專利名稱：黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物多倍體誘導(dǎo)方法領(lǐng)域，尤其涉及黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
黃芩多倍體誘導(dǎo)國內(nèi)已有相關(guān)報(bào)道，主要為實(shí)驗(yàn)室條件下的組織培養(yǎng)法和莖尖誘導(dǎo)法，兩種方法均能獲得黃芩多倍體。但是，因其方法不當(dāng)，使其存在一定的不足。組織培養(yǎng)法誘導(dǎo)多倍體是利用成熟細(xì)胞在特定條件下如愈傷組織，經(jīng)脫分化后再重新轉(zhuǎn)化成胚性分生組織而進(jìn)行誘導(dǎo)的一種方式，雖然純合率高，但要走脫分化的彎路，脫分化的過程生產(chǎn)上無法實(shí)現(xiàn)，因?yàn)榻M織培養(yǎng)法操作過程繁雜，成本高，時(shí)間長，且黃芩多倍體結(jié)實(shí)力非常低，產(chǎn)種量無法滿足生產(chǎn)需求，故生產(chǎn)上無法使用。而莖尖誘導(dǎo)法很難獲得純合多倍體，因?yàn)榍o尖分生組織既有原生分生組織，又有初生分生組織，原生分生組織是胚性細(xì)胞，專司分裂，分裂能力強(qiáng)，分裂周期短，而初生分生組織是胚性細(xì)胞產(chǎn)生的分生組織，是邊分裂邊分化的細(xì)胞，其分裂能力相對(duì)較弱，分裂周期長。那么，在莖尖誘導(dǎo)中，如果誘導(dǎo)時(shí)間較短，會(huì)出現(xiàn)原生分生組織細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)而加倍，初生分生組織細(xì)胞由于分裂周期較長而處于間期沒有經(jīng)過染色體加倍，加倍的細(xì)胞分裂速度和生長速度都比普通細(xì)胞慢，在生長的過程中，普通細(xì)胞由于生長速度快而逐漸將加倍的細(xì)胞包圍起來，形成嵌合體；如果延長誘導(dǎo)時(shí)間，初生分生組織細(xì)胞剛好經(jīng)過一次染色體加倍，而原生分生組織細(xì)胞可能會(huì)出現(xiàn)兩次或多次加倍，超過了植物能夠忍受的環(huán)境脅迫范圍，弓I起生物膜破壞，細(xì)胞脫水，各種代謝無序進(jìn)行，即由于膜脂質(zhì)過氧化而使細(xì)胞死亡。另夕卜，即使成功，也是地上部分為多倍體，地下部分為二倍體，即雜合體。這就是莖尖誘導(dǎo)很難獲得純合四倍體的原因，故農(nóng)藝性狀不穩(wěn)定，生產(chǎn)上無法推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在針對(duì)背景技術(shù)中存在的不足，而提供的一種黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法。本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，是根據(jù)種子本身的特點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)的，因?yàn)榉N子是植物繁衍下一代的直接器官，其內(nèi)具有分生能力最強(qiáng)的胚性細(xì)胞，即原生分生組織，而且胚性細(xì)胞專司分裂功能，具有分裂周期短、集中的特點(diǎn)，而且在萌發(fā)過程中，胚根和胚芽同時(shí)進(jìn)行分裂活動(dòng)，也就是在誘導(dǎo)過程中，只要掌握了恰當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)液濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)就能夠成功。胚根和胚芽同時(shí)得到誘導(dǎo)，使得胚根產(chǎn)生的地下部分和胚芽產(chǎn)生的地上部分同時(shí)加倍，故不會(huì)出現(xiàn)莖尖誘導(dǎo)的地上部分為多倍體，地下部分為二倍體，即雜合體現(xiàn)象，而是純合的同源四倍體。本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的
a、預(yù)處理選取發(fā)育完好、粒大飽滿當(dāng)年的普通二倍體黃芩種子，用新配制的0. 04% 0. 06%的KMnO4溶液消毒清洗三次、每次400 800洗液/100克，每次浸泡時(shí)間為I 3分鐘；將消毒完畢的黃芩種子用凈水清洗，去除表面水分；b、萌發(fā)將經(jīng)a步驟處理的黃芩種子在溫度23 26°C條件下均布于發(fā)芽床上，以適量凈水為萌發(fā)劑，直至種芽破殼；
C、誘導(dǎo)將經(jīng)b步驟處理的黃芩種子取出，去除表面水分，移入誘導(dǎo)床上，在溫度25 29°C條件下，加入誘導(dǎo)液、其組份為0.01%秋水仙素和0. 3%二甲基亞砜的水溶液，其用量以半浸種子為宜，誘導(dǎo)至芽長為2. 2 2. 5mm時(shí)結(jié)束；
d、后處理將經(jīng)c步驟誘導(dǎo)后的種子從誘導(dǎo)液中取出，用凈水沖洗3 5次，即完成黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)。本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，獲得了黃芩同源四倍體植株，其誘導(dǎo)方法黃芩的成活率為90. 6%，誘導(dǎo)率為83. 2%。與二倍體相比，四倍體植株形態(tài)特征明顯，葉片粗超、顏色深綠、葉形指數(shù)變小，株高、地徑花序長、種子及根重等顯著增加，細(xì)胞核顯著增 大，氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞花粉粒明顯增大，保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體多而大，氣孔密度明顯減小，表現(xiàn)為明顯的多倍體巨型性特征。黃芩根主要成分為黃芩苷和漢黃芩苷，二倍體黃芩黃芩苷和漢黃芩苷的含量分別為12. 83%,3. 35%，同源四倍體黃芩則分別為20. 36%和6. 23%，各提高了61. 26%和85.97%。其中黃芩苷為藥典規(guī)定的藥效成分。二倍體黃芩單株干根的產(chǎn)量為16. 46g，四倍體黃芩單株干根的產(chǎn)量為53. 53g，完全能夠滿足生產(chǎn)要求。本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，科學(xué)合理，去除了因種子萌發(fā)進(jìn)行各項(xiàng)生理準(zhǔn)備所需時(shí)間不同而造成的差異，在時(shí)間上最大限度地減少了誘導(dǎo)液對(duì)種子的傷害；誘導(dǎo)溫度與室溫接近，易于操作，且與播種土壤溫度差異小，可以提高成活率；另外，誘導(dǎo)液濃度極低，可以最大限度地減少誘導(dǎo)液對(duì)種子的傷害。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的
a、預(yù)處理選取發(fā)育完好、粒大飽滿當(dāng)年的普通二倍體黃芩種子，用新配制的0.04% 0. 06%的KMnO4溶液消毒清洗三次、每次400 800mL洗液/100克，每次浸泡時(shí)間為I 3分鐘；將消毒完畢的黃芩種子用凈水清洗，去除表面水分；
b、萌發(fā)將經(jīng)a步驟處理的黃芩種子在溫度23 26°C條件下均布于發(fā)芽床上，以適量凈水為萌發(fā)劑，直至種芽破殼；
C、誘導(dǎo)將經(jīng)b步驟處理的黃芩種子取出，去除表面水分，移入誘導(dǎo)床上，在溫度25 29°C條件下，加入誘導(dǎo)液、其組份為0.01%秋水仙素和0. 3%二甲基亞砜的水溶液，其用量以半浸種子為宜，誘導(dǎo)至芽長為2. 2 2. 5mm時(shí)結(jié)束；
d、后處理將經(jīng)c步驟誘導(dǎo)后的種子從誘導(dǎo)液中取出，用凈水沖洗3 5次，即完成黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)。實(shí)施例2
本發(fā)明黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，是通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的
第一預(yù)處理階段選取發(fā)育完好、粒大飽滿當(dāng)年的普通二倍體黃芩種子，使用新配制的
0.05%的KMnO4溶液將黃芩種子進(jìn)行消毒清洗三次，每100克種子每次用400 800 mL的KMnO4溶液，用潔凈的玻璃棒反復(fù)攪拌，使種子與KMnO4溶液充分接觸，第一次消毒3分鐘，傾出消毒液；再取0. 05%的KMnO4溶液將黃芩種子消毒2分鐘，傾出消毒液；最后取0. 05%的KMnO4溶液將黃芩種子消毒消毒I分鐘，傾出消毒液；將消毒完畢的黃芩種子加入蒸餾水，洗凈種子表面殘留的KMnO4溶液，傾出清洗液，取出種子，去除表面水份；
第二萌芽階段將預(yù)處理后的黃芩種子在溫度為25 26°C條件下均布于發(fā)芽床，彼此間保持一定的距離，以蒸餾水為萌發(fā)劑進(jìn)行萌發(fā)，蒸餾水的量以半浸種子為宜，直至種子開始萌動(dòng)即種芽突破種皮；
第三誘導(dǎo)階段將萌芽后的黃芩種子取出，去除表面水分，移入誘導(dǎo)床上，誘導(dǎo)床內(nèi)的種子充分分散開，彼此保持一定的距離，于溫度25 27°C條件下，加入0.01%秋水仙素+0. 3% 二甲基亞砜組成的誘導(dǎo)液，其誘導(dǎo)液的量也以半浸種子為宜，直至芽生長到適宜播種的長度約2. 2 2. 5mm時(shí)，誘導(dǎo)結(jié)束；
第四后處理階段將誘導(dǎo)后的種子迅速從誘導(dǎo)液中取出，用蒸餾水沖洗，連續(xù)沖洗3-5次，每次0. 5 3分鐘，即制的成品。秋水仙素是目前普遍采用的效果確切的化學(xué)誘導(dǎo)劑。對(duì)植物而言，秋水仙素是人為增加的環(huán)境脅迫因素，但秋水仙素具有劇毒性，在一定條件下可以使植物細(xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，促使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS無法正常消除而使細(xì)胞凋零。本發(fā)明中采用秋水仙素與二甲基亞砜為誘導(dǎo)劑，二甲基亞砜(dimethysurfoxide,DMS0)能夠促進(jìn)秋水仙素快速浸透到植物組織中，提高誘導(dǎo)率，緩解因滲透不均勻產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象，而且還能降低秋水仙素的誘導(dǎo)濃度，減輕其對(duì)細(xì)胞毒害性，從而提高成活率。
另外，現(xiàn)有的種子誘導(dǎo)法均采用誘導(dǎo)劑作為萌發(fā)劑直接浸泡萌發(fā)誘導(dǎo)，使種子萌發(fā)和誘導(dǎo)同步進(jìn)行，時(shí)間從12_96h不等，然后播種，成活率和誘導(dǎo)率均較低。本發(fā)明的萌發(fā)劑和誘導(dǎo)劑采用不同的試劑，從種子萌發(fā)生理看，種子萌發(fā)過程需要經(jīng)歷吸水期、酶的形成、有機(jī)物的轉(zhuǎn)變以及植物激素的變化等四個(gè)基本時(shí)期，而種子中的胚性細(xì)胞只有在完成了這些相關(guān)準(zhǔn)備之后才開始進(jìn)行細(xì)胞分裂，而且不同植物的這四個(gè)時(shí)期所經(jīng)歷的時(shí)間是不同的，而且環(huán)境溫度等因素對(duì)其影響很大，發(fā)芽快的種子可能一兩天即可萌發(fā)，發(fā)芽慢的可能一周左右，休眠的種子所需時(shí)間更長。所以，這里的浸泡時(shí)間不是誘導(dǎo)時(shí)間，只有誘導(dǎo)劑作用于分裂期的細(xì)胞，其浸泡時(shí)間才是真正的誘導(dǎo)時(shí)間。采用萌動(dòng)的種子就是使其完成種子萌發(fā)所需的各種生理準(zhǔn)備過程，種子內(nèi)的胚性細(xì)胞已開始進(jìn)行細(xì)胞分裂，此時(shí)轉(zhuǎn)入到誘變劑內(nèi)才是誘導(dǎo)時(shí)間的開始，這樣可以避免因種子萌發(fā)的各種生理準(zhǔn)備時(shí)間不同而造成的差異，同時(shí)降低人為環(huán)境脅迫時(shí)間，減少對(duì)種子的損害，而且胚根、胚芽可以同時(shí)被誘導(dǎo)，防止雜合體的產(chǎn)生。
權(quán)利要求
1.黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法，其特征在于通過如下步驟實(shí)現(xiàn)的 a、預(yù)處理選取發(fā)育完好、粒大飽滿當(dāng)年的普通二倍體黃芩種子，用新配制的0.04% . 06%的KMnO4溶液消毒清洗三次、每次400 800mL洗液/100克，每次浸泡時(shí)間為I 3分鐘；將消毒完畢的黃芩種子用凈水清洗，去除表面水分； b、萌發(fā)將經(jīng)a步驟處理的黃芩種子在溫度23 26°C條件下均布于發(fā)芽床上，以適量凈水為萌發(fā)劑，直至種芽破殼； C、誘導(dǎo)將經(jīng)b步驟處理的黃芩種子取出，去除表面水分，移入誘導(dǎo)床上，在溫度25 29°C條件下，加入誘導(dǎo)液、其組份為0.01%秋水仙素和0. 3%二甲基亞砜的水溶液，其用量以半浸種子為宜，誘導(dǎo)至芽長為2. 2 2. 5mm時(shí)結(jié)束； d、后處理將經(jīng)c步驟誘導(dǎo)后的種子從誘導(dǎo)液中取出，用凈水沖洗3 5次，即完成黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明的黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)方法涉及植物多倍體誘導(dǎo)方法領(lǐng)域，將普通二倍體黃芩種子，用0.04%～0.06%的KMnO4溶液消毒清洗三次、每次浸泡時(shí)間為1～3分鐘；將消毒完畢的黃芩種子用凈水清洗，去除表面水分；將經(jīng)預(yù)處理的黃芩種子在溫度23～26℃條件下均布于發(fā)芽床上，以凈水為萌發(fā)劑，直至種芽破殼，取出后，去除表面水分，移入誘導(dǎo)床上，在溫度25～29℃條件下，加入誘導(dǎo)液、其用量以半浸種子為宜，誘導(dǎo)至芽長為2.2～2.5mm時(shí)結(jié)束；將誘導(dǎo)后的種子取出，用凈水沖洗3～5次，即完成黃芩同源四倍體的誘導(dǎo)。本誘導(dǎo)方法，科學(xué)合理，去除了因種子萌發(fā)進(jìn)行各項(xiàng)生理準(zhǔn)備所需時(shí)間不同而造成的差異，在時(shí)間上最大限度地減少了誘導(dǎo)液對(duì)種子的傷害；誘導(dǎo)溫度與室溫接近，易于操作，且與播種土壤溫度差異小，可以提高成活率；另外，誘導(dǎo)液濃度極低，可以最大限度地減少誘導(dǎo)液對(duì)種子的傷害。
文檔編號(hào)A01C1/00GK102612891SQ20121011599
公開日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月19日
發(fā)明者于輝, 申志英 申請(qǐng)人:申志英