專利名稱：一種分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種分子標(biāo)記輔助回交快速提高小麥抗赤霉病侵入性的方法，屬于作物分子育種領(lǐng)域，專用于小麥抗赤霉病侵入種質(zhì)的選育與鑒定。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，其產(chǎn)品對(duì)人類的食品安全不可或缺。由禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum Schwabe)引起的赤霉病是小麥生產(chǎn)上的一種重要病害，廣泛發(fā)生于溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)。其危害包括不育、種子飽滿度降低，致使產(chǎn)量嚴(yán)重下降，一般減產(chǎn)10 15%，有時(shí)可高達(dá)50%。病麥粒中還含有毒素(主要是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，D0N)，食用后會(huì)直接危害人、畜的健康。由于全球氣候變暖和耕作制度的改變，赤霉病正從傳統(tǒng)的流行麥區(qū)如長(zhǎng)江中下游麥區(qū)、南部沿海麥區(qū)、黑龍江東部麥區(qū)逐漸向其它麥區(qū)如華北的山東、山西、河南、河北，西南的四川，西北的寧夏、甘肅、青海等省份擴(kuò)展。近十 年來，即使加強(qiáng)了對(duì)赤霉病的防治，我國(guó)平均每年仍有30萬噸以上的小麥因該病而受損。2003年，安徽省小麥赤霉病發(fā)病面積達(dá)1，500萬畝，產(chǎn)量損失約6億公斤，同年江蘇省也發(fā)生赤霉病大流行。近五年來，在長(zhǎng)江中下游麥區(qū)，赤霉病發(fā)生異常頻繁，都達(dá)到了中等偏重的程度。鑒于小麥赤霉病對(duì)糧食安全和食品安全構(gòu)成的嚴(yán)重威脅，提高小麥對(duì)赤霉病的抗性成為亟待解決的重大科學(xué)問題。小麥對(duì)赤霉病的抗性包含五種類型抗侵入(type I)、抗擴(kuò)展(type II)、降解毒素(type III)、降低籽粒病粒率(type IV)和減少產(chǎn)量損失或耐病性(type V)。其中抗侵入是小麥抵御赤霉菌入侵的第一道屏障，在抗性反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。近幾年來，抗侵入性越來越受到抗赤育種家們的重視。但是，高抗赤霉病的小麥種質(zhì)資源非常匱乏，目前許多赤霉病抗性遺傳研究都集中在蘇麥3號(hào)及其衍生系上。望水白是我國(guó)特有的抗赤霉病種質(zhì)，其抗赤霉病侵入表現(xiàn)甚至要優(yōu)于蘇麥3號(hào)。在望水白的4B和5A染色體上存在兩個(gè)主效抗侵入QTL Qfhii. nau-4B和Qfhi. nau_5A，在各次實(shí)驗(yàn)中均可以解釋15%以上的表型變異(Lin et al. 2006)。運(yùn)用回交手段對(duì)一些優(yōu)良小麥品系的個(gè)別缺點(diǎn)進(jìn)行改良是一個(gè)十分有效的措施。但是對(duì)于小麥赤霉病抗性的改良來說存在很多困難首先，小麥赤霉病抗性是一種非常復(fù)雜的數(shù)量性狀，由多基因控制且受環(huán)境條件影響較大，表型鑒定非常困難。其次，小麥赤霉病是一種穗部病害，要等到開花后才能評(píng)價(jià)是否抗病，而此時(shí)已無法直接配置雜交組合。再次，有些抗赤霉病QTL屬于隱性遺傳，回交一代后必須自交一代，鑒定出抗病單株后才能繼續(xù)回交。因此，采用傳統(tǒng)的回交育種方法改良小麥的赤霉病抗性費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這嚴(yán)重阻礙了抗源在抗赤霉病育種中的有效利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)背景技術(shù)提出的技術(shù)問題提供一種育種周期短、效率高的分子標(biāo)記輔助選擇培育抗赤霉病侵入小麥新品系的方法，該方法能快速有效地改良現(xiàn)有品系的赤霉病抗性。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，包括以下步驟I)以攜帶抗侵入QTL的重組自交家系為供體，以綜合性狀優(yōu)良但感赤霉病的小麥品系為受體，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，所得的雜種F1代再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間；2)在苗期提取BC1F1分離群體中各單株的DNA，并利用與目標(biāo)QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)等位基因的雜合型單株繼續(xù)與輪回親本雜交獲得BC2F1分
3)在苗期提取BC2F1分離群體中各單株的DNA，繼續(xù)利用與目標(biāo)QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選含有單個(gè)目標(biāo)QTL的雜合型單株；再選擇分布于整個(gè)小麥基因組的150對(duì)SSR標(biāo)記用于對(duì)含有目標(biāo)QTL的單株進(jìn)行背景回復(fù)率分析，選擇背景回復(fù)率最高的單株繼續(xù)回交獲得BC3F1分離群體；4)重復(fù)步驟3)，獲得攜帶目標(biāo)QTL且背景回復(fù)率最高的BC3F1目標(biāo)單株后自交獲得BC3F2分離群體，種植于田間；5)在苗期提取BC3F2分離群體中各單株的DNA，重復(fù)步驟3)，選擇攜帶目標(biāo)QTL且背景回復(fù)率最高的純合型單株自交，獲得BC3F3純合家系。6)將中選BC3F3純合家系與輪回親本一起種植于田間進(jìn)行多環(huán)境抗性表型鑒定。上述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其所述PCR檢測(cè)的方法包括以下步驟I)用SDS法提取各世代群體中單株的DNA ；2)利用 Qfhi. nau-4B 的兩側(cè) SSR 標(biāo)記 ZMG182 和 ZMG54 以及 Qfhi. nau_5A 的兩側(cè)SSR標(biāo)記ZMB95和ZMB98對(duì)上述基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分析帶型，凡呈現(xiàn)有與供體親本相同大小的DNA條帶的單株即為目標(biāo)單株。上述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，利用選擇的SSR標(biāo)記進(jìn)行背景選擇包括以下步驟I)根據(jù)小麥遺傳圖譜(Xue SL, Zhang ZZ, Lin F，Kong ZX, Cao Y，Li CJ, Yi HY,Mei MF, Zhao DM，Zhu HL, Xu HB, Wu JZ, Tian DG，Zhang CQ, Ma ZQ (2008)A high-densityintervarietal map of the wheat genome enriched with markers derived fromexpressed sequence tags. Theor Appl Genet 117 :181-189)每隔 20_30cM選擇一個(gè)標(biāo)記，共選擇了分布于21條染色體的150對(duì)SSR標(biāo)記用于目標(biāo)單株的PCR擴(kuò)增；2)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分析帶型，計(jì)算背景回復(fù)率；攜帶有最多的與受體親本完全一致帶型的單株即為目標(biāo)單株，用于下一代回交或自交。上述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其所述的供體為從南大2419X望水白重組自交系群體中選出的同時(shí)攜帶Qfhi. nau_4B和Qfhi. nau_5A兩個(gè)抗侵入QTL的家系SSD97 ;所述的受體為綿陽99-323，所述的輪回親本為綿陽99-323。本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)步驟為I)根據(jù) Qfhi. nau-4B 兩側(cè)標(biāo)記(ZMG182 和 ZMG54)和 Qfhi. nauu_5A 兩側(cè)標(biāo)記(ZMB95和ZMB98)的標(biāo)記基因型資料從南大2419X望水白重組自交系群體中選擇同時(shí)攜帶這兩個(gè)抗侵入QTL的株系SSD97作為供體親本，選擇來自四川的一個(gè)大穗、大粒新品系綿陽99-323作為輪回親本，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，所得的雜種F1代再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間。2)在苗期提取分離群體中各單株的DNA，并利用SSR引物ZMG182、ZMG54、ZMB95和ZMB98進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)等位基因的雜合型單株繼續(xù)與輪回親本雜交獲得BC2F1分離群體。所用引物的序列信息如下表I引物序列信息
權(quán)利要求
1.一種分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其特征是包括以下步驟 1)以攜帶抗侵入QTL的重組自交家系為供體，以綜合性狀優(yōu)良但感赤霉病的小麥品系為受體，進(jìn)行常規(guī)有性雜交，所得的雜種F1代再與輪回親本回交，得到回交一代BC1F1分離群體，種植于田間； 2)在苗期提取BC1F1分離群體中各單株的DNA，并利用與目標(biāo)QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)等位基因的雜合型單株繼續(xù)與輪回親本雜交獲得BC2F1分離群體； 3)在苗期提取BC2F1分離群體中各單株的DNA，繼續(xù)利用與目標(biāo)QTL緊密連鎖的SSR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)，篩選含有單個(gè)目標(biāo)QTL的雜合型單株；再選擇分布于整個(gè)小麥基因組的150對(duì)SSR標(biāo)記用于對(duì)含有目標(biāo)QTL的單株進(jìn)行背景回復(fù)率分析，選擇背景回復(fù)率最高的單株繼續(xù)回交獲得BC3F1分離群體； 4)重復(fù)步驟3)，獲得攜帶目標(biāo)QTL且背景回復(fù)率最高的BC3F1目標(biāo)單株后自交獲得BC3F2分離群體，種植于田間； 5)在苗期提取BC3F2分離群體中各單株的DNA，重復(fù)步驟3)，選擇攜帶目標(biāo)QTL且背景回復(fù)率最高的純合型單株自交，獲得BC3F3純合家系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其特征是所述PCR檢測(cè)的方法包括以下步驟 1)用SDS法提取各世代群體中單株的DNA； 2)利用Qfhi. nau-4B 的兩側(cè) SSR 標(biāo)記 ZMG182 和 ZMG54 以及 Qfhi. nau_5A 的兩側(cè) SSR標(biāo)記ZMB95和ZMB98對(duì)上述基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分析帶型，凡呈現(xiàn)有與供體親本相同大小的DNA條帶的單株即為目標(biāo)單株。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其特征是利用選擇的SSR標(biāo)記進(jìn)行背景選擇包括以下步驟 1)根據(jù)小麥遺傳圖譜選擇分布于21條染色體的150對(duì)SSR標(biāo)記用于目標(biāo)單株的PCR擴(kuò)增； 2)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，分析帶型，計(jì)算背景回復(fù)率；攜帶有最多的與受體親本完全一致帶型的單株即為目標(biāo)單株，用于下一代回交或自交。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法，其特征是所述的供體為從南大2419 X望水白重組自交系群體中選出的同時(shí)攜帶Qfhi. nau-4B和Qfhi. nau-5A兩個(gè)抗侵入QTL的家系SSD97 ;所述的受體為綿陽99-323，所述的輪回親本為綿陽 99-323。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子標(biāo)記輔助回交提高小麥抗赤霉病侵入的方法。以攜帶抗侵入QTL的重組自交家系為供體，以綜合性狀優(yōu)良但感赤霉病的品系為受體，進(jìn)行雜交并回交。在每個(gè)回交世代利用與目標(biāo)QTL緊密連鎖的兩側(cè)標(biāo)記進(jìn)行前景選擇，同時(shí)利用分布于整個(gè)小麥基因組的150對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)帶有目標(biāo)QTL的單株進(jìn)行背景選擇，選擇背景回復(fù)率最高的單株用于下一代回交。連續(xù)回交3代再自交2代后可以獲得抗性得到明顯改善，其它性狀與輪回親本基本一致的近等基因系。本發(fā)明通過提取回交后代苗期葉片的DNA，并進(jìn)行標(biāo)記基因型分析，可獲得目標(biāo)單株，有效解決了表型選擇中赤霉病抗性易受環(huán)境條件影響以及抗病表型要到開花期才能鑒定的問題；同時(shí)還能減少群體規(guī)模，降低育種成本，快速有效地改良小麥品系的抗赤霉病侵入性。
文檔編號(hào)A01H1/02GK102626048SQ20121008213
公開日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月2日
發(fā)明者李國(guó)強(qiáng), 薛樹林, 許峰, 馬正強(qiáng) 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)