專利名稱：：沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法。
背景技術(shù)：
：煙粉風(fēng)Bemisiatabaci(Gennadius)屬同翅目，粉風(fēng)科,小粉風(fēng)屬，又名棉粉風(fēng)或甘薯粉虱，在亞洲、歐洲、非洲、南美洲、中北美洲、大洋洲等大陸地區(qū)均有分布。煙粉虱寄主范圍十分廣泛，主要危害十字花科、茄科、葫蘆科、豆科、菊科、錦葵科等植物。煙粉虱的危害主要來(lái)自于其成蟲(chóng)和若蟲(chóng)。煙粉虱成蟲(chóng)、若蟲(chóng)將ロ針穿過(guò)寄主植物細(xì)胞間隙深入韌皮部取食，直接刺吸植物汁液，導(dǎo)致寄主作物生長(zhǎng)受阻，植株弱?。怀上x(chóng)產(chǎn)卵時(shí)卵柄直接插入葉組織內(nèi)造成傷ロ為害；其若蟲(chóng)和成蟲(chóng)分泌蜜露，誘發(fā)煤污病，密度高時(shí)，葉片呈現(xiàn)黒色，嚴(yán)重影響光合作用。此外，煙粉虱還傳播70種以上的病毒病，引起寄主作物病毒病流行，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(A.RamiHorowitz,YehezkelAntignusandDanGerling.ManagementofBemisiatabaciWhiteflies,i'heWhitefly,Bemisiatabaci(HomopteraAleyrodidae)InteractionwithGeminivirus-InfectedHostPlants,2011,293-322,DOI10.1007/978-94-007-1524-0_lI)。目前，殺蟲(chóng)劑是控制煙粉虱危害的重要手段。現(xiàn)在防治煙粉虱的常規(guī)藥劑主要包括有機(jī)磷類(如毒死蜱、こ酰甲胺磷等)、氨基甲酸酯類(如滅多威、丁硫克百威等)、新煙酰類(吡蟲(chóng)啉、啶蟲(chóng)脒、烯啶蟲(chóng)胺等)以及昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(噻嗪酮、蚊蠅醚)等殺蟲(chóng)劑。由于煙粉虱本身的生物學(xué)特性、殺蟲(chóng)劑用藥的頻繁性和盲目性等原因，煙粉虱在世界范圍內(nèi)已經(jīng)對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性(PalumboJC,HorowitzAR,PrabhakerN.InsecticidalcontrolandresistancemanagementforBemisiatabaci.しropProt,2001,20:739-765)。對(duì)不同類型的殺蟲(chóng)劑，煙粉虱有著不同的抗藥性分子機(jī)制。對(duì)抗吡蟲(chóng)啉的B型和Q型煙粉虱進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，煙粉虱體內(nèi)的ー個(gè)P450基因(CYP6CM1)表達(dá)量增加了17倍，從而使其對(duì)包括卩比蟲(chóng)啉在內(nèi)的新煙堿類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性(IrisKarunker,JuergenBenting,BettinaLueke,etal.Over-expressionofcytochromeP450CYP6CM1isassociatedwithhighresistancetoimidaclopridintheBandQbiotypesofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:634-644)。煙粉虱對(duì)機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑的分子抗性機(jī)制則可能涉及到羧酸酯酶介導(dǎo)的水解代謝作用的增強(qiáng)和こ酰膽堿酯酶發(fā)生點(diǎn)突變而對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性降低。在抗有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑的B型煙粉虱中，羧酸酯酶基因(coel)的表達(dá)量提高了4倍，同吋，こ酰膽堿酯酶基因(acel)在?；幕钚晕稽c(diǎn)發(fā)生了突變，最終導(dǎo)致煙粉虱的抗藥性增強(qiáng)(AionM,AlonF,NauenR,etal.Organophosphates'resistanceintheB-biotypeofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae)isassociatedwithapointmutationinanacel-typeacetylcholinesteraseandoverexpressionofcarboxyIesterase.InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:940-949)。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA(siRNA)，這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。RNAi是普遍存在于動(dòng)物和植物界的ー種防御反應(yīng)，已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因功能研究和植物新種質(zhì)創(chuàng)制的有效的方法。Mao等(MaoYing-bo,Caiffen-juan,WangJia-wei,etal.SilencingacottonboIlwormP450monooxygenasegenebyplant-mediatedRNAiimpairslarvaltoleranceofgossypol.NatBiotechnol,2007,25:1307-1313)構(gòu)建P450CYP6AE14基因的RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因煙草葉片喂食棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)后發(fā)現(xiàn)CYP6AE14轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，并且幼蟲(chóng)對(duì)棉酹的敏感性增強(qiáng)，棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)明顯被抑制。Turner等(TurnerCT,Davymw,MacDiarmidRM,etal.RNAinterferenceinthelightbrownapplemoth,Epiphyaspostvittana(Walker)inducedbydouble-strandedRNAfeeding.InsectMolBiol,2006,15:383-391)利用RNAi技術(shù)對(duì)蘋(píng)果褐卷蛾Epiphyaspostvittana(Walker)羧酸酯酶基因(EposCXEl)實(shí)現(xiàn)了有效沉默，喂食外源性dsRNA2d后，蘋(píng)果褐卷蛾幼蟲(chóng)中腸EposCXEl轉(zhuǎn)錄水平小于對(duì)照組的1/2。這些研究表明，通過(guò)RNAi技術(shù)干擾昆蟲(chóng)體內(nèi)P450基因和羧酸酯酶基因等部分抗藥性基因的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)精確抗蟲(chóng)，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大指導(dǎo)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)煙粉虱嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的現(xiàn)狀，以煙粉虱抗藥性基因?yàn)榘袠?biāo)，提供一種沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法。根據(jù)本發(fā)明的沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法，包括以下步驟I)選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coel基因?yàn)镽NAi靶基因；2)通過(guò)OverlapPCR將CYP6CM1基因和coel基因的部分序列嵌合并以之構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi載體；3)RNAi載體轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物，獲得具有防治煙粉虱的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述方法包括步驟如下I)根據(jù)煙粉虱CYP6CM1基因和coel基因序列，分別設(shè)計(jì)下列兩對(duì)引物F1/R1和F2/R2；FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT2)提取煙粉虱RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以步驟I)引物通過(guò)OverlapPCR獲得CYP6CM1基因和coel基因的嵌合基因(嵌合基因序列為SEQNO.I所示)，純化后與pGEM_TEasyVector連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,測(cè)序吻合,提取質(zhì)粒DNA。3)以步驟2)DNA為模板，利用下列F3/R3引物(下劃線所示為引入的酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和中間載體Hurricane用BamHI和HindIII酶切，酶切片段進(jìn)行連接，得到Hurricane-T；F3CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATGR3TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT4)以步驟2)DNA為模板，利用下列F4/R4引物(下劃線所示為引入的酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和Hurricane-T以XhoI和SacI酶切，酶切片段進(jìn)行連接，得到Hurricane-RNAi；F4CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAGR4CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG5)用BamHI和SacI酶切植物表達(dá)載體pBI121和Hurricane-RNAi，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，獲得RNAi載體。6)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉(zhuǎn)基因煙草。7)將轉(zhuǎn)基因煙草置于獨(dú)立防蟲(chóng)溫室內(nèi)，飼養(yǎng)煙粉虱，調(diào)查煙粉虱體內(nèi)抗藥性基因的表達(dá)水平和施用殺蟲(chóng)劑后煙粉虱死亡率，以飼喂非轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱為對(duì)照。本發(fā)明是對(duì)以殺蟲(chóng)劑為主的煙粉虱防治方法的重要補(bǔ)充，利用RNAi干擾煙粉虱抗藥性基因的表達(dá)，煙粉虱進(jìn)食RNAi轉(zhuǎn)基因煙草后，其體內(nèi)的抗藥基因CYP6CM1基因和coel基因表達(dá)量分別為進(jìn)食非轉(zhuǎn)基因煙草煙粉虱的13.34-43.44%和13.25-42.99%;施用新煙堿類殺蟲(chóng)劑后，RNAi轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率為96.33%，明顯高非轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率75.45%;施用有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑后，RNAi轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率89.01%，明顯高非轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率43.12%。圖I為BamHI/SacI雙酶切驗(yàn)證RNAi載體的結(jié)果，M=Marker；1:未酶切的RNAi載體；2:酶切后產(chǎn)生的RNAi片段和pBI121質(zhì)粒片段。圖2顯示CYP6CM1基因和coel基因嵌合的dsRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，LB:T_DNA左邊界；RBT-DNA右邊界；N0S-TN0S終止子；N0S_PN0S啟動(dòng)子；c_Ccoel基因和CYP6CM1基因的嵌合序列；FAD2intron:擬南芥FAD2基因的內(nèi)含子；35S_P:CaMV35S啟動(dòng)子；NPTII:抗卡那霉素性的選擇標(biāo)記基因。圖3為PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草中的嵌合基因和FADintron間的序列片段的結(jié)果，MMarker；CK:非轉(zhuǎn)基因煙草；1_6:獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖4顯示飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因和coel基因的相對(duì)表達(dá)量，CK:飼喂非轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱；T1-T6:飼喂1-6號(hào)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因煙草株系的煙粉虱。圖5顯示飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱施用艾美樂(lè)(新煙堿類殺蟲(chóng)劑)后的死亡率。圖6顯示飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱施用樂(lè)果(有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑)后的死亡率。具體實(shí)施例方式實(shí)施例II、以CYP6CM1基因和coel基因?yàn)榘谢虻腞NAi載體構(gòu)建(I)選取CYP6CM1基因(IrisKarunker,JuergenBenting,BettinaLueke,etal.Over-expressIonofcytochromeP450CYP6CM1isassociatedwithhighresistancetoimidaclopridintheBandQbiotypesofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae).InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:634-644)和coel基因(AIonM,AlonF,NauenR,etal.Organophosphates'resistanceintheB-biotypeofBemisiatabaci(HemipteraAleyrodidae)isassociatedwithapointmutationinanacel-typeacetylcholinesteraseandoverexpressionofcarboxylesterase.InsectBiochemistryandMolecularBiology,2008,38:940-949)為RNAi革巴基因，并分別根據(jù)其序列設(shè)計(jì)OverlapPCR引物F1/R1和F2/R2FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT(2)收集煙粉虱，以TaKaRaRNAisoReagent(TaKaRa公司)提取煙粉虱RNA，用TaKaRaM-MLVreversetranscriptase(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈。(3)以引物F1/R1和F2/R2分別擴(kuò)增CYP6CM1基因(424bp)、coel基因(523bp)，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù)延伸lOmin。PCR產(chǎn)物在I.O%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化目的片段。(4)將步驟(3)純化的目的片段混合做模板，以上述引物Fl和R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù)延伸lOmin。PCR產(chǎn)物(916bp)在I.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化嵌合基因。(5)將步驟⑷純化的嵌合基因與pGEM-TEasyVector(Promega公司)連接，反應(yīng)體系如下2XBuffer5.OμI,pGEM-TEasyVector0.7μI、PCR產(chǎn)物3.3μI、T4DNA連接酶I.Oμ1，上述成分混勻后16°C連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(生エ生物エ程(上海)有限公司)，步驟如下取一管-70°C保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰盒上融化，加入10μI連接產(chǎn)物，輕搖混勻，冰浴30min;42°C熱激90sec后迅速置冰浴2min，加入400μI液體LB，370CIOOrpm振蕩培養(yǎng)Ih;取200μI培養(yǎng)液均勻涂布于涂有4μIIPTG(200mg/ml)和40μIX-GAL(20mg/ml)的氨芐青霉素(50mg/l)平板上，37°C靜置培養(yǎng)12h。挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆，在含有氨芐青霉素(50mg/l)的LB液體培養(yǎng)基中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，經(jīng)引物Fl和R2進(jìn)行PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后進(jìn)行序列測(cè)定,916bp全部序列吻合,隨后用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質(zhì)粒DNA。(6)以步驟(5)質(zhì)粒DNA為模板，利用F3-CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATG和和R3-TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT弓I物(下劃線所示為引入的酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù)延伸lOmin。PCR產(chǎn)物(925bp)在I.O%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化PCR產(chǎn)物，用BamHI和HindIII酶切PCR產(chǎn)物和中間載體Hurricane(PeterA.Stoutjesdijk,SurinderP.Singh,QingLiu,etal.hpRNA-MediatedTargetingoftheArabidopsisFAD2GeneGivesHighlyEfficientandStableSilencing.PlantPhysiology,2002,129:1723-1731.由澳大利亞CSIROPlantIndustry提供，改造自文中的iHPconstruct),酶切產(chǎn)物用T4-DNA酶(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(生エ生物工程(上海)有限公司)，挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，經(jīng)引物F3/R3進(jìn)行PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后,用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質(zhì)粒DNA,命名為Hurricane-T。(7)以步驟(5)質(zhì)粒DNA為模板，利用F4-CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAG和R4-CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG弓I物(下劃線所示為引入的酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性3min，(94°C變性30sec，57°C退火30sec，72°C延伸60sec)35個(gè)循環(huán)，72°C繼續(xù)延伸lOmin。PCR產(chǎn)物(919bp)在I.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化PCR產(chǎn)物，以XhoI和SacI酶切PCR產(chǎn)物和Hurricane-T，酶切產(chǎn)物用T4-DNA酶(TaKaRa公司)進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、220rpm培養(yǎng)16h,經(jīng)引物F4/R4進(jìn)行PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后，用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質(zhì)粒DNA,命名為Hurricane-RNAi。(8)用BamHI和SacI酶切植物表達(dá)載體pBI121(Clontech公司)和Hurricane-RNAi,酶切產(chǎn)物在O.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用AxygenDNAgelextractionkit(Axygen公司)回收純化目的片段，用T4-DNA連接酶(TaKaRa公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(生エ生物工程(上海)有限公司)。挑取平板上長(zhǎng)出的單克隆，在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37°C、220rpm培養(yǎng)16h，用AxygenPlasmidMiniprepKit(Axygen公司)提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)BamHI/SacI雙酶切驗(yàn)證后(圖I)，獲得植物表達(dá)的RNAi載體(圖2)。2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草2.I農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備取-70°C保存農(nóng)桿菌EHA105(北京Biovector公司)劃線于LB(含有20mg/lrif)平板，28°C培養(yǎng)2d。挑單菌落培養(yǎng)于50ml液體LB(含20mg/lrif)，140rpm，28°C培養(yǎng)至OD600=O.5;農(nóng)桿菌菌液轉(zhuǎn)入無(wú)菌50ml離心管,4000rpm離心4min,棄上清液,加入5ml預(yù)冷O.15MNaCl懸浮細(xì)胞，4000rpm離心4min,去上清液；再用O.15MNaCl懸浮細(xì)胞，4000rpm離心4min，去上清液；加入3ml預(yù)冷20mMCaCl2溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置30min，加入終濃度為15%甘油，混勻后每管分裝ΙΟΟμ1，立即凍存于-70°C。2.2RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌取Iμg左右的RNAi質(zhì)粒DNA加入到100μI農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30min;液氮冷凍Imin,取出后37°C水浴2min,冰浴2min;加入Iml液體LB,28°C、140rpm搖培2-3h;離心，10(^1液體1^重懸后涂在含5011^/1KanLB平板上，28°C培養(yǎng)到形成單菌落；單菌落培養(yǎng)于50mg/lKan液體LB，28°C、140rpm搖培16h，取2μI菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆保存?zhèn)溆谩?.3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因煙草參照以下方法獲得(I)將健康煙草葉片置于大培養(yǎng)皿,用75%こ醇浸泡滅菌Imin,O.I%升萊浸泡滅菌8分鐘，用滅菌水沖洗5次。(2)滅菌濾紙吸去煙葉表面水，用刀片切成小塊。(3)農(nóng)桿菌28°C下培養(yǎng)至0D600=O.6，浸染葉盤(pán)5min。(4)將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移到滅菌吸水紙上，吸干表面菌液后轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.lmg/LNAA+1mg/L6-BA+3%鹿糖+2.5g/Lphytagel,pH5.8)，21°C暗培養(yǎng)兩天(5)將葉盤(pán)轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0.lmg/LNAA+lmg/L6-BA+3%蔗糖+2.5g/Lphytagel+500mg/L頭孢霉素+100mg/L卡那霉素,ρΗ5·8)光照培養(yǎng)ー個(gè)月左右,保持2830°C，每15天更換一次分化培養(yǎng)基。(6)分化出小苗后，將苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基+O.lmg/LNAA+250mg/L頭孢霉素)，25°C光照16h。生根后將卡那霉素抗性苗移栽到土壌。2.4轉(zhuǎn)基因煙草的DNA提取利用CTAB法提取再生煙草植株葉片DNA，具體步驟如下取O.1-0.5g新鮮葉片，液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)入I.5ml離心管，加入600μI預(yù)熱CTAB裂解液(表I)，渦旋混勻，65°C水浴Ih,加入600μI氯仿-異戍醇(24:I),顛倒50次混勻，IOOOOrpm離心15min,取上清于新I.5ml離心管,加入等體積的預(yù)冷異丙醇,充分混勻，-20°C放置30min,12000rpm離心15min，棄上清，加入Iml75%酒精洗滌DNA沉淀，棄酒精，風(fēng)干，加IOOylTE溶解DNA，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?。表ICTAB裂解液組成成分_mm_1.4MNaCl40.908g0.1MTris.HCl50mlof1.0MTris-HCl(pH8.0)stocksolution20mMNa.EDTA20mlof0.5MEDTA(pH8.0)stocksolution2%CTABIOg2%PVPIOg1%(V/V)P-Me5mlddWater425mlTotal500ml2.5轉(zhuǎn)基因煙草的PCR檢測(cè)用特異引物Carb-Mono-409F:CAGGTTCAAGCCAAACTCCA和FAD-intron96R:TATCGTGAGCGGAGAAATTC進(jìn)行PCR檢測(cè)RNAi載體中的內(nèi)含子部分序列，目的片段大小為600bp左右，非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照。PCR擴(kuò)增程序如下95°C預(yù)變性5min;94°C變性30sec，56で退火3086(3，72で延伸50sec，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)I%瓊脂糖凝膠電泳，電泳檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草植株能擴(kuò)增出400bp大小的片段，而非轉(zhuǎn)基因植株沒(méi)有擴(kuò)增到特異條帶(圖3)，證明RNAi框架已經(jīng)整合至轉(zhuǎn)基因煙草基因組。3、轉(zhuǎn)基因煙草防治煙粉虱的效果3.I飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因和coel基因表達(dá)水平檢測(cè)將轉(zhuǎn)基因煙草置于獨(dú)立防蟲(chóng)溫室內(nèi)，飼養(yǎng)煙粉虱。煙粉虱進(jìn)食5天后，收集煙粉虱，以TaKaRaRNAisoReagent(TaKaRa公司)提取煙粉虱RNA，用TaKaRaM-MLVreversetranscriptase(TaKaRa公司)合成cDNA第一鏈。定量PCR檢測(cè)CYP6CM1基因(引物ACGGAGCCTTTCAAGTTACCAGA和CGTCTCCGAAAGGCAAATAGGT)和coel基因(引物GATGTCTCACGGCAACTTTACCC和GCCAACTCTGTAATTGAATGTGACA)的表達(dá)水平，內(nèi)參為actin基因(引物TCAGGGTGTAATGGTCGGTA和TGATGATACCGTGCTCGATGG)。以飼喂非轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱為對(duì)照，飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱體內(nèi)CYP6CM1基因和coel基因相對(duì)表達(dá)水平分別為13.34-43.44%和13.25-42.99%(圖4)。3.2飼喂轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性檢測(cè)將轉(zhuǎn)基因煙草置于獨(dú)立防蟲(chóng)溫室內(nèi)，飼養(yǎng)煙粉虱。煙粉虱進(jìn)食5天后，分別施用新煙堿類殺蟲(chóng)劑(70%艾美樂(lè)水分散粒劑，購(gòu)于杭州拜耳作物科技公司)和有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑(40%樂(lè)果乳劑，購(gòu)于江蘇東進(jìn)農(nóng)藥化工廠銷售公司)，調(diào)查煙粉虱死亡率，以飼喂非轉(zhuǎn)基因煙草的煙粉虱為對(duì)照。用藥3天后，RNAi轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱在施用艾美樂(lè)(新煙堿類殺蟲(chóng)劑)后死亡率為96.33%，明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率75.45%(圖5)，在施用樂(lè)果(有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑)后死亡率為89.01%，明顯高于非轉(zhuǎn)基因煙草上的煙粉虱死亡率43.12%(圖6)。權(quán)利要求1.沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coel基因?yàn)镽NAi靶基因；2)通過(guò)OverlapPCR將CYP6CM1基因和coel基因的部分序列嵌合并以之構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi載體；3)RNAi載體通轉(zhuǎn)化目的植物，獲得具有防治煙粉虱效果的轉(zhuǎn)基因植物。2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)根據(jù)煙粉虱CYP6CM1基因和coel基因序列，分別設(shè)計(jì)下列兩對(duì)引物F1/R1和F2/R2；FlATGGCGGCAGCTATTGACARlGTTTGGCTTGAACCTGGATGGGATGCCAGAAATCAF2TTCTGGCATCCCATCCAGGTTCAAGCCAAACTCCAR2GCCATACTTTTTCAGCAGGCT2)提取煙粉虱RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以步驟I)引物通過(guò)OverlapPCR獲得CYP6CM1基因和coel基因的嵌合基因，嵌合基因序列如SEQNO.I所示，純化后與pGEM-TEasyVector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，測(cè)序吻合，提取質(zhì)粒DNA；3)以步驟2)質(zhì)粒DNA為模板，利用下列F3/R3引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和中間載體Hurricane分別用BamHI和HindIII酶切,酶切片段再進(jìn)行連接,得到Hurricane-T,F3CAAGGATCCATGGCGGCAGCTATTGACATGR3TCCAAGCTTTTTCAGCAGGCTGTACCGT；4)以步驟2)質(zhì)粒DNA為模板，利用下列F4/R4引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和Hurricane-T分別以XhoI和SacI酶切，酶切片段再進(jìn)行連接，得到Hurricane-RNAi,F4CAACTCGAGCAGGCTGTACCGTGAATGAGR4CAAGAGCTCATGGCGGCAGCTATTGACATG；5)用BamHI和SacI分別酶切植物表達(dá)載體pBI121和Hurricane-RNAi，回收酶切的目的片段，用T4-DNA連接酶連接，獲得RNAi載體；6)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草，通過(guò)硫酸卡那霉素篩選，抗性再生苗生根、移栽，PCR鑒定獲取轉(zhuǎn)基因煙草。3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述RNAi載體含有SEQIDNO.I所示的部分或全部核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及沉默兩個(gè)抗性基因防治煙灰虱的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟選取煙粉虱抗藥性CYP6CM1基因和coe1基因?yàn)镽NAi靶基因；通過(guò)OverlapPCR將CYP6CM1基因和coe1基因的部分序列嵌合并以之構(gòu)建反向重復(fù)序列的RNAi載體；RNAi載體轉(zhuǎn)化目的植物，獲得具有防治煙粉虱的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明是對(duì)以殺蟲(chóng)劑為主的煙粉虱防治方法的重要補(bǔ)充。本發(fā)明利用RNAi技術(shù)干擾煙粉虱體內(nèi)的抗藥性相關(guān)基因的表達(dá)，為防治煙粉虱提供了技術(shù)支持。文檔編號(hào)A01H5/00GK102690837SQ20121002565公開(kāi)日2012年9月26日申請(qǐng)日期2012年2月7日優(yōu)先權(quán)日2012年2月7日發(fā)明者劉方,張保龍,王坤波,蔡小彥,陳天子申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所,江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院