專利名稱：一種抗寒的草銨膦抗性基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗寒的草銨膦抗性基因，同時還涉及一種抗寒的草銨膦抗性基因在植物除草劑草銨膦中的用途。
背景技術(shù)：
草銨膦(Glufosinate)是有機磷類除草劑，其有效成分是phosphinothricin (簡稱PPT)，化學(xué)名稱為(RS)-2-氨基-4-4(羥基甲基氧膦基)丁酸銨，是外消旋體混合物，只有L-PPT具有植物毒性，屬滅生性仿生莖葉處理劑。草銨膦的研制與開發(fā)是與雙丙氨膦密切相關(guān)。雙丙氨膦是從鏈霉菌(Str印tomyceshygroscopicus)發(fā)酵液中分離提純的一種三肽天然產(chǎn)物，雙丙氨膦本身無除草活性，在植物體內(nèi)降解成具有除草活性的草銨膦。據(jù)此，德國艾格福公司直接合成草銨膦(Glufosinate)，成功開發(fā)出一個新除草劑品種。草銨膦制劑已被廣泛使用在非耕地防除多種一年生和多年生禾本科草和闊葉草(Ahren W H et all994)。草銨膦原藥為白色至淺黃色結(jié)晶粉末，密度1.4g/ml(20°C )，熔點215°C，沸點99. 5 °C，蒸氣壓< 0. ImPa (25 V )，高度穩(wěn)定，25 °C可貯存2年；20°C、pH = 7時水溶度l，370，000mg/L，20°C時有機溶劑溶解度(g/100ml)丙酮0.016，乙醇0. 065，乙酸乙酯 0. 014，正己燒 0. 02，甲苯 0. 014 (Vencill W K 2002 HiraiK, Uchida A，Ohno R 2002)。草銨膦是非選擇性莖葉處理劑，傳導(dǎo)較差。一般來說，草銨膦在植物體內(nèi)隨蒸騰流在木質(zhì)部運輸(Anderson D M et al 1993)，但是在一些植物體內(nèi)，14C-草銨膦也可以由韌皮部運輸?shù)礁姆稚M織。研究還發(fā)現(xiàn)雜草對草銨膦的敏感性與草銨膦在韌皮部內(nèi)傳導(dǎo)的速率密切相關(guān)。Steckel等人(1997b)報道，草銨膦處理狗尾草、稗草、苘麻和藜24h后，對草銨膦的吸收依次是67^^53^32^^16 ^用14C-同位素示蹤法檢測這4種雜草對草銨膦傳導(dǎo)性，處理狗尾草1 后，對草銨膦運輸達到；處理稗草24h后，對草銨膦運輸達到14%。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，處理葉片將所吸收的草銨膦向根部運輸，這就說明狗尾草和稗草對草銨膦的運輸是經(jīng)韌皮部進行的(Steckel G J 1997b)。谷氨酰胺合成酶在植物的氮代謝過程中起作用，它是植物一個重要的解毒酶， 可解除由硝酸鹽還原、氨基酸降解及光呼吸中釋放出的銨的毒性。草銨膦的靶標(biāo)酶正是谷氨酰胺合成酶(GQ。在正常情況下，GS可以由ATP及glutamate形成λ-glutamyl phosphate0但在PPT處理后，PPT先與ATP結(jié)合，磷酸化的PPT占據(jù)GS分子的8個反應(yīng)中心，使GS的空間構(gòu)型發(fā)生變化，從而GS的活性受到抑制。這些過程破壞的結(jié)果導(dǎo)致細胞內(nèi)氨積累、氨基酸合成及光合作用受抑制、葉綠素破壞；雖然氨的積累能使細胞死亡，但主要引起植物受害的還是對RuBp羧化酶/光呼吸作用迅速抑制造成。同使，草銨膦也具有殺蟲和殺菌功能(Nicole J Kutlesa, Stanley Caveney 2001)。最早研究草銨膦在土壤中的代謝是Tebbe和Reber (Tebbe C C and H HReber 1988)，隨后Smith (Smith A Ε. 1988)也進行了研究。草銨膦在土壤中降解很快，半衰期短， 其土壤活性很低。草銨膦在土壤中一般被降解為4-甲基磷酸亞基2-氧代丁酸(PPO)，3-甲基磷酸亞基丙酸(MPP)，2-羥基-4-羥基(甲基)膦酰基丁酸(MHB)和4-羥基(甲基)膦?；∷?MPB)。由于草銨膦殺草譜廣，在環(huán)境中迅速生物降解及對非靶生物低毒，因此如何將其作為作物田苗后選擇性除草劑使用是十分必要的，而生物工程技術(shù)為此提供了可能；至今為止，在轉(zhuǎn)基因抗除草劑作物研究與推廣中，抗草銨膦作物僅次于抗草甘膦作物而居第2 位，隨著抗草銨膦作物種植面積的繼續(xù)擴大，國際農(nóng)藥市場對草銨膦的需求將會進一步增加，無疑這對我國除草劑出口將是一大機遇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種抗寒的草銨膦抗性基因，該基因是通過設(shè)計引物從基因組中直接擴增得到。該基因的核苷酸序列全長為489bp，編碼162個氨基酸。利用Genbank數(shù)據(jù)庫中的BLASTP進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的氨基酸序列Streptomyces hygroscopicus分離與克隆出抗性基因bar及Streptomyces viridochromogenes中分離出來具有同樣功能的基因pat，都只有37%的相似性。證明該基因是一個新的基因。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種抗寒的草銨膦抗性基因在植物除草劑草銨膦中的應(yīng)用，將該基因連接到PGEX-6P-1表達載體(購自美國GEHealthcare公司) 上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Escherichia coliBL21 (該大腸桿菌Escherichia coliBL21購自 Invitrogen公司)，該菌能在150mM/L的草銨膦抗性平板上生長，而空白對照不能生長，經(jīng)實驗論證，該基因?qū)Τ輨┎蒌@膦有很高活性，而且能夠在低溫下保持這樣的活性。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)該酶的，Kmippt)為 0. 079mM,Kcat 為 13IMirT1，Kcat/Km = 1711mM/L .min。說明該基因確實有很高的草銨膦抗性，在轉(zhuǎn)基因植物有巨大的潛在應(yīng)用價值。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種草銨膦抗性的編碼基因的制備過程是將深?；旌暇喊大w積比為1 %的接種量轉(zhuǎn)接到含有草銨膦(50mM/L)的HLB (培養(yǎng)基組成(質(zhì)量體積比，以下相同)的蛋白胨，0.5% (質(zhì)量體積比)酵母培養(yǎng)物和2% (質(zhì)量體積比)氯化鈉，補充水到1L，調(diào)pH至7. 0))液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時。再將生長好的菌液在含有草銨膦(50mM/L)的HLB固體(在液體HLB的基礎(chǔ)上補加了質(zhì)量體積比為2%的瓊脂粉)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)M小時。劃線分離得到單菌落以后，再按照上述方法復(fù)篩一次，得到的抗性細菌。抽提該原始單菌落的基因組DNA，并以其為PCR模板，選用16S擴增通用引物 1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)(合成于金斯瑞生物公司)以細菌染色體DNA為模板進行PCR擴增，鑒定結(jié)果為lihodococcusequi (馬紅球菌，保藏在中國海洋微生物菌種保藏中心)，原始細菌的16S序列如表SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，一種分離的草銨瞵抗性的編碼基因，其序列為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。查閱相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)該屬的菌報道的基因組中有草銨瞵-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。然后設(shè)計引物從該菌的基因組DNA中通過PCR擴增出目的基因，命名為r印at，該基因的核苷酸序列全長為489bp(核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示)將該基因連接到表達載體pGEX_6P_l 上導(dǎo)入大腸桿菌BL21進行蛋白誘導(dǎo)表達，純化。其表達的蛋白為phosphinothricinN-acetyltransferase (草銨瞵_N_乙酰轉(zhuǎn)移酶)編碼162個氨基酸。(氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示)。一種分離的草銨瞵抗性的蛋白，其序列為SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。為確定此酶對草銨瞵有活性，所以測定了此酶的相關(guān)活性。一種抗寒的草銨膦抗性基因在植物除草劑草銨膦中的應(yīng)用，其應(yīng)用過程是含有目的蛋白的該菌能在150mM/L的草銨瞵抗性平板上生長，而空白對照不能生長，通過PEG 法、微彈轟擊法、電激法及Ri雙元載體質(zhì)粒將此基因?qū)胨?、小麥、馬鈴薯、玉米、甜菜、 煙草、番茄、油菜、甘蔗等20多種作物中，證明了這些轉(zhuǎn)基因植株對草銨瞵的抗性有很好的效果。這種轉(zhuǎn)基因技術(shù)所培育出來的品種，為控制一些抗性雜草提供了 1條很好的途徑。此外，這類基因還可以作為植物的篩選標(biāo)記基因，作為篩選標(biāo)記的同時又賦予轉(zhuǎn)基因作物農(nóng)業(yè)上的有用性狀。將此基因插入表達有助于提高分化頻率，讓其作為篩選標(biāo)記基因，在組織培養(yǎng)的過程中，培養(yǎng)基中添加20mg/L以上的草銨瞵，存活的組織可以初步認(rèn)定含有次目的基因。而含有該基因的大腸桿菌具有以下形態(tài)特征此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般大小約0. 5 μ -0. 8 μ ml. 0 μ m-3. 0 μ m,多單獨存在或成雙，但不呈長鏈狀排列。約有50%左右的菌株具有周生鞭毛而能運動，但多數(shù)菌體只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱；多數(shù)菌株生長有比鞭毛細、短、直且數(shù)量多的菌毛，有的菌株具有莢膜或微莢膜；不形成芽胞，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性，所以是陰性細菌。與現(xiàn)有發(fā)明相比，申請人克隆的i^pat基因編碼的phosphinothricinN-acetyltr ansferase與現(xiàn)有的酶相比具有一些不同的特性。該酶的Km(ppt)為0. 079mM，Keat為13IMirT1， Kcat/Km= 1711mM/L*min (圖7)，說明此蛋白具有較高的活性，而且該酶能在0°C時保持48% 左右的活性(圖6)，說明此酶在低溫下能夠保持較高的活性，其轉(zhuǎn)基因作物能在北方等寒冷的條件下生長有潛在的應(yīng)用價值。在PH6-10的環(huán)境中能夠維持60%左右的活性(圖 5)，說明該酶具有廣泛的酸堿度適用范圍。該酶既能夠作用草銨膦又能夠作用于其類似物 L-甲硫氨酸砜和L-甲硫氨酸砜亞胺，是一個新的可以利用的有用資源。經(jīng)過生物學(xué)實驗驗證，證明該酶具有高活性，耐低溫，可廣泛用于不同抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物。


圖1為一種抗寒的草銨膦抗性基因流程2為一種原始的pGEX-6p_l圖譜圖3為一種重組質(zhì)粒pGEX-6p-l_R印at圖譜圖4為一種RePAT蛋白純化示意圖。M泳道為Marker 1泳道未誘導(dǎo)pGEX_6p-l上清2泳道誘導(dǎo)pGEX_6p-l上清3泳道未誘導(dǎo)RePAT上清4泳道誘導(dǎo)RePAT上清5純化的目的蛋白圖5為一種RePAT最佳pH示意圖。橫坐標(biāo)為不同pH值縱坐標(biāo)為相對活性。圖6為一種RePAT最佳溫度示意圖。橫坐標(biāo)為不同溫度值縱坐標(biāo)為相對活性。圖7為一種RePAT動力學(xué)圖示意圖。橫坐標(biāo)為濃度值縱坐標(biāo)為速度。
具體實施例方式實施例1 草銨膦抗性菌株的篩選將深海混合菌液按體積比為1 %的接種量轉(zhuǎn)接到含有草銨膦(50mM/L)的HLB (培養(yǎng)基組成(質(zhì)量體積比，以下相同)的蛋白胨，0.5% (質(zhì)量體積比)酵母培養(yǎng)物和2% (質(zhì)量體積比)氯化鈉，補充水到1L，調(diào)pH至7. 0))液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)M小時。再將生長好的菌液在含有草銨膦(50mM/L)的HLB固體(在液體HLB的基礎(chǔ)上補加了質(zhì)量體積比為2% (質(zhì)量體積比)的瓊脂粉)培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)M小時。劃線分離得到單菌落以后，再按照上述方法復(fù)篩一次，得到的抗性細菌。實施例2 抗性菌株的鑒定與目的基因的克隆提取細菌染色體DNA將分離得到Iihodococcus equi，于HLB培養(yǎng)基培養(yǎng)M小時后，取1. 5ml菌液于一滅菌EP管中，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘，棄上清，收集菌體；用TE buffer (配方:50mmol/tris-HCl ρΗ8· 0，10mmol/L EDTA,調(diào) pH 至 8. 0)洗菌體2次后加入50ul 100ug/ml溶菌酶(該溶菌酶購于Sigma公司)懸浮菌體，37°C水浴1 小時；加入520ul TE buffer, 30ul 10% (質(zhì)量體積比)十二烷基磺酸鈉(SDS) ^P 3ul 20mg/ml的蛋白酶K(該蛋白酶K購于Sigma公司)混勻后，37°C水浴1小時；加入IOOul 5mol/L的氯化鈉溶液充分混勻，再加溴代十六烷基三甲胺/氯化鈉溶液 80ul 混勻(配方10% CTAB，0. 7M NaCl)，70°C水浴 10 分鐘；加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比為25 M 1)，混勻，室溫Q0-25°C， 以下相同)放置5-10分鐘。12000rpm離心10分鐘，抽提兩次，得到上清；取上一步驟的上清加入2/3體積的異丙醇輕輕混勻，12000rpm離心10分鐘；棄上清，將沉淀用體積比為70% (質(zhì)量體積比)乙醇洗2次，置于室溫干燥后，溶于50ul TE溶液中，置于-20°C保存?zhèn)溆谩＞甑?6S擴增鑒定選用16S 擴 ±曾通用弓I 物 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)禾口 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)(合成于金斯瑞生物公司)以細菌染色體DNA為模板進行 PCR擴增，PCR體系如下
IOxPCR緩沖液(購自TAKARA公司)5 μΙ_
dNTP (10mM 購自 TAKARA 公司1 μΙ_
模板(Rhodococcus equi 染色體 DNA)1 μL
27F (10μΜ)1 μΙ_
1492R (10μΜ)1 μΙ_
TaqDNA 聚合酶(TAKARA)1 μΙ_
加無離子水至50 μ L0PCR 條件:95°C預(yù)變性 4min ；95°C，30s ；55°C，30s ；72°C 90s，30 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin, 4°C 5min。將PCR產(chǎn)物送去金斯瑞生物公司測序，結(jié)果經(jīng)Blast比對得知，該菌是 Rhodococcus equi。查詢該菌的基因信息，發(fā)現(xiàn)該屬的菌報道的基因組中有草銨膦_N_乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因。引物設(shè)計擴增目的基因根據(jù)NCBI GENEBANK 公布的 pat 基因的核苷酸序列(Accession Number :GI 311888035)設(shè)計合成如下引物正向引物(pat_F)5，_CG GAATTCATGCTGA TCCGCGACGCC-3，， 包含 EcoRI 限制性酶切位點，反向引物(pat-R)5，-ATAAGAATGCGGCCGCCTAGAGGGTCAGCTGCA G-3’，包含Notl限制性酶切位點。(下劃線為酶切位點)引物由金斯瑞生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR 擴增PCR體系如下
IOxPCR緩沖液(購自TAKARA公司)5 μΙ_
dNTP (10mM 購自 TAKARA 公司)1 μΙ_
模板(Rhodococcus equi DNA)1 μL
正向引物F (10μΜ)1 μΙ_
反向引物R(10|jM)1 μ
TaqDNA 聚合酶(TAKARA)1 μΙ_加無離子水至50 μ L0PCR 條件95°C 預(yù)變性 4min ；95°C, 30s ；55°C, 30s ；72 °C 30s, 30 個循環(huán)；72°C 延伸10min，4°C 5min。將PCR產(chǎn)物拿去金斯瑞生物公司測序，結(jié)果經(jīng)Blast比對得知，該基因的核苷酸序列全長為489bp，啟示密碼子為AUG，終止密碼為UAG0編碼162個氨基酸，這些氨基酸形成的蛋白質(zhì)屬于N乙酰轉(zhuǎn)移酶家族，該基因編碼的氨基酸序列Sti^ptomyces hygroscopicus分離與克隆出抗性基因bar及Streptomyces viridochromogenes中分離出來具有同樣功能的基因pat，都只有37%的相似性，說明該基因是一個比較新穎的基因，為轉(zhuǎn)基因植物提供了一個新的資源。酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pGEX-6p_lPCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRI-Notl (購自TAKARA公司)酶切，酶切反應(yīng)體系如酶解緩沖液，5 μ L ；EcoRI，，2 μ L ；Notl, 2 μ L ；PCR產(chǎn)物，41 μ L?；靹蚝笾糜?7°C保溫6小時。質(zhì)粒載體pGEX-6p-l (購自美國GE Healthcare公司)酶解體系和條件同上一致。DNA凝膠回收本發(fā)明中涉及到的DNA的純化均使用試劑盒QIAquick GEL Extraction Kit (夠自德國Qiagen公司)，操作參照產(chǎn)品說明書。具體過程是在紫外燈下將目的條帶切下來后至于1. 5mL的離心管中，每IOOmg加入300 μ L的QG緩沖液，50攝氏度水浴鍋溫浴8min， 直到凝膠全部融化。將溶膠液加入到吸附管12000rpm，4°C離心lmin，加入750 μ L PE緩沖液離心洗脫lmin，加入50 μ L去離子水洗脫收集DNA。
連接連接體系IOX連接酶緩沖液(購自TAKARA公司)1 μ L雙酶切的PCR產(chǎn)物6 μ L雙酶切的載體2 μ L T4 DNA連接酶(購自TAKARA公司)1 μ L混勻后，16 °C保溫過夜。轉(zhuǎn)化將連接混合物與100 μ L大腸桿菌感受態(tài)細胞Ε. coli BL21 (DE3)混合，冰浴放置 30分鐘，42°C處理90秒，加800 μ L LB培養(yǎng)基(其中1 %胰蛋白胨，1 %氯化鈉，0. 5%酵母粉，ρΗ7. 0)，37°C保溫45min，涂布于含100 μ g/mL氨芐青霉素固體LB平皿，37°C保溫14小時，得到轉(zhuǎn)化子。同時將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5anvitr0gen公司)用于保存。實施例3 蛋白的表達、純化與分析重組蛋白的表達將過夜活化的轉(zhuǎn)化子以的接種量轉(zhuǎn)接至IL含100 μ g/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)2-3h，使0D_達到0. 6-0. 7，加入異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 至終濃度為0. 2mM, 15°C 200轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)12小時。離心收集菌體，然后用PBS緩沖液(pH 7. 4，140. OmM氯化鈉，2. 7mM氯化鉀，10. OmM磷酸氫二鈉，1. 8mM磷酸氫二鉀)洗滌一次，再用50mL PBS懸浮，然后用高壓細胞破碎儀破碎細胞(夠自美國THERMO公司)。細胞破碎液于4°C、12000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，收集上清。用SDS-PAGE檢測上清是否有目的蛋白表達。蛋白的純化本發(fā)明利用GST親和純化重組蛋白，具體操作步驟如下(所有操作均在4°C下進行)裝柱取ImL 柱材料 GSH Sepharose 4B (夠自 Amersham-Pharmacia)司層析柱中， 用50mL PBS緩沖液洗脫平衡；結(jié)合將細胞破碎液液的上清以1. OmL/min的流速過柱；洗脫用IOOmL PBS洗脫沒有結(jié)合的雜蛋白，流速控制在1. OmL/min以下；酶解取10 μ L濃度為10unit/yL的3C蛋白酶(購自Pharmacia公司)與ImL 的PBS緩沖液混勻，加入層析柱酶切混勻后4°C酶解16小時；收集蛋白收集酶解后的PBS至1. 5mL的離心管中，再加ImL PBS第二次洗脫收集，PBS緩沖液中即溶有目的蛋白；純化蛋白的檢測和定量本發(fā)明中涉及到蛋白的檢測均使用12%的SDS-PAGE分析。配方如下
濃縮膠濃度為5%
H2O
30% Acr-Bis (29:1) IMTris-HCL1 pH8.8 10% SDS
10%過硫酸銨
TEMED
分離膠濃度為12%
H2O
30% Acr-Bis (29:1) IMTris-HCL1 pH8.8 10% SDS
10%過硫酸銨
1.4mL 0.33mL 0.25mL 0.02mL 0.02mL
0.002mL
1.6mL 2mL 1.3mL 0.05mL 0.05mL
TEMED0.002mL檢測方法取10 μ L純化的蛋白樣品，加等體積的蛋白上樣緩沖液(5Χ，購買自寶生物工程大連有限公司)，沸水浴5-lOmin，然后上樣10 μ L。蛋白純化的SDS-PAGE結(jié)果見圖2。蛋白濃度的測定本發(fā)明中涉及到的蛋白質(zhì)的定量均使用Bradford蛋白定量檢測試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司)。具體步驟如下取4yL蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(購自上海生工生物工程技術(shù)有限責(zé)任公司)加PBS稀釋至 100 μ L，使終濃度為200 μ g/mL。取稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品按0，1,2,4,6,8,10，15 μ L分別加到96孔板中，加PBS補足到 20 μ L，每孔蛋白含量分別為0，0. 2，0. 4，0. 8，1. 2，1. 6，2和3 μ g，每個梯度重復(fù)3次。加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加PBS到20 μ L，重復(fù)3次。各孔加入200 μ L Bradford Reagent，混勻，室溫放置 5min。用預(yù)熱的酶標(biāo)儀(Thermo Scientific公司)測定A595讀數(shù)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的蛋白濃度。最后計算獲得蛋白濃度為0. 62mg/mL。實施例4 酶學(xué)性質(zhì)的測定草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶最適pH的測定采用二硫代二硝基苯甲酸(DNTB)顯色的方法測定輔酶A的產(chǎn)量。取0. 5ul純化的蛋白加入到150ul用不同pH值緩沖液配置的草銨膦和乙酰輔酶A底物(pH3. 0-8. 0的緩沖液為0. 2M磷酸氫二鈉/0. IM檸檬酸緩沖液；PH8-10的緩沖液為50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，35°C反應(yīng)30分鐘，然后加入3. OM鹽酸胍IOul，終止反應(yīng)3分鐘，再加入20mM的DNTB20ul，持續(xù)五分鐘，取200ul放入酶標(biāo)儀測定A412的讀數(shù)，以最高酶活為100%，計算不同條件下的相對酶活。圖3表明，草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶的最適pH為8. 6，在轉(zhuǎn)基因作物中能更好的定位與植物的葉綠體中，而且在PH6-10的范圍內(nèi)都保持了 50%的活性。這表明該酶在一定的酸堿條件下都具有很好的催化活性。草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶最適溫度的測定草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶最適溫度的測定是用pH8. 6的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液在不同溫度下測定酶活。圖4表明，該酶在(0 60°C)都有活性，最適溫度為25°C，且在0°C時都能夠保持50%左右的活性，說明該酶是個冷活性的酶，更適用于在寒冷地帶轉(zhuǎn)基因作物的種植。草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶的動力學(xué)測定在pH8. 6的緩沖液溫度25°C時測定酶的動力學(xué)常數(shù)。圖5表明，草銨膦N乙酰轉(zhuǎn)移酶的 Kmippt)為 0. 076mM, Kcat 為 niMirT1，Kcat/Km = 1711mM/L · min。該酶與商品 PAT 活性相近，但是同源性確只有37%，為轉(zhuǎn)基因植物中提供了一個新的資源，并且能夠得到很好的應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種分離的草銨膦抗性的編碼基因，其序列為SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
2.一種分離的草銨膦抗性的蛋白，其序列為SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1所述的一種草銨膦抗性的編碼基因在植物除草劑草銨膦中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗寒的草銨膦抗性基因及應(yīng)用，將深?；旌暇喊?%的接種量轉(zhuǎn)接到含有草銨膦的HLB的蛋白胨，酵母培養(yǎng)物和氯化鈉液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。再將生長好的菌液在含有草銨膦的HLB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。劃線分離得到單菌落以后，再按照上述方法復(fù)篩一次，得到的抗性細菌。抽提該原始單菌落的基因組DNA，并以其為PCR模板，選用16S擴增通用引物1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)和27F(5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)以細菌染色體DNA為模板進行PCR擴增，鑒定結(jié)果為Rhodococcusequi，原始細菌的16S序列為SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，一種分離的草銨膦抗性的編碼基因，其序列為SEQIDNO2所示的核苷酸序列。經(jīng)過生物學(xué)實驗驗證，證明該酶具有高活性，耐低溫，可廣泛用于不同抗除草劑轉(zhuǎn)基因作物。
文檔編號A01H5/00GK102559717SQ201210001518
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉子鐸, 吳高兵, 張毅, 林擁軍, 袁鳴孺, 邵宗澤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)