大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法以及由此制備的植物體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其是通過將包含在來源于甘薯（Ipomoea?batatas）的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-Ins基因突變體的重組載體，轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體內實現(xiàn)的；由上述方法制備的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體及其種子；一種環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其通過將上述重組載體轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體而得到的；由上述方法制備的，環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的蓄積花青素的轉化甘薯植物體及其種子；一種能增加蓄積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素含量以及環(huán)境脅迫耐性的組合物，其包含所述IbOr-Ins基因變異體。
【專利說明】大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法以及由此制備的植物體
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法以及由此制備的植物體；更詳細地說，本發(fā)明涉及一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其是通過將包含在來源于甘薯(Ipomoea batatas)的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因突變體的重組載體，轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體內實現(xiàn)的；由上述方法制備的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體及其種子；一種環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其通過將上述重組載體轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體而得到的；由上述方法制備的，環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的蓄積花青素的轉化甘薯植物體及其種子；一種能增加蓄積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素含量以及環(huán)境脅迫耐性的組合物，其包含所述IbOr-1ns基因變異體。
【背景技術】[0002]甘薯(Ipomoea batatas L.Lam)不僅能夠在比較貧瘠的土地上進行栽培,而且每公頃產(chǎn)量約為30噸，是一種被用作糧食和家畜飼料的具代表性的塊根農(nóng)作物。紫色、黃色等有色甘薯含有多種抗氧化物質，特別是呈黃色的黃色甘薯含有14.7~20mg/100g的胡蘿卜素，而紫色甘薯含有2.28g/100g左右的花青素，其能夠促進細胞的老化，并且可去除作為各種成人疾病病因的活性氧，具有優(yōu)異的抗氧化作用。此外，在1990年代以后，通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium)對甘薯嘗試了進行協(xié)同培養(yǎng)的轉化，通過頂端及側芽分裂組織誘導胚胎發(fā)生培養(yǎng)細胞及體細胞胚胎的發(fā)生，使植物體再分化轉化系統(tǒng)得到發(fā)展(Lim等A.2007,《分子育種》19,227-239，(Lim et al.2007, Mol Breedingl9，227-239))。但是還沒有對大量生產(chǎn)類胡蘿卜素、花青素、多酚等小分子抗氧化物質的甘薯的相關報道。由此認為，開發(fā)一種具有復合脅迫耐性的同時，還能夠大量產(chǎn)生小分子抗氧化物質的作物，可用于解決21世紀人類所面臨的糧食、能源和環(huán)境問題。
[0003]Islam等(Islam et al.2002Biosc1.Biotechnol.Biochem.66,2483-2486)報道了甘薯的葉子中至少存在15中以上的具有高生理活性的花青素，其比維生素C或者維生素E具有更強的抗氧化活性(Philpo tt et al.2003J.Sc1.Food Agric.83，1076-1082)。有趣的是據(jù)報道稱，在很多植物體葉子中花青素的生物合成是被誘導活性氧的外部環(huán)境脅迫誘導的，尤其是葉子或者根部的花青素在保護植物體的防御機制中發(fā)揮主要的作用，使其免受外部的侵襲(Neill et al.2002Plant Cell Environ.25，539-547)。由于植物酚類化合物的多樣性和廣泛的分布，其被認為是最重要的天然抗氧化劑。據(jù)報道稱，多酚和酚類化合物還在人體內發(fā)揮保護我們身體的重要作用，使身體免受各種氧化脅迫，因此越來越受矚目。在甘薯根部中最具代表性的多酹，即羥基肉桂酸(hydroxycinnamic acids, HCA)是強力的抗氧化劑，無論是在甘薯組織和表達期，在大部分的甘薯品種中均大量含有(Islametal.2002J.Agric.Food Chem.50，3718-3722)。如上所述，多酚與類胡蘿卜素、花青素一同，使得甘薯表現(xiàn)出很高的抗氧化活性。
[0004]世界衛(wèi)生組織(WHO)公布了全世界有I億名兒童由于缺乏維生素A而受苦，并由此導致每年有50萬名以上的兒童失明。胡蘿卜素作為維生素A的前體，其具有營養(yǎng)強化劑和食品輔助劑的生理活性功能，因此可以說關于食品中胡蘿卜素的蓄積的代謝工程學研究是為提高營養(yǎng)學價值所必需的研究對象。已知胡蘿卜素作為具有高抗氧化活性的物質，不僅具有生理活性功能，而且對于植物自身的氧化脅迫的防御機制也起到重要作用，最近有報道指出類胡蘿卜素的生物合成受植物激素之一的脫落酸(ABA)的影響，因此需要對這些抗氧化物質和環(huán)境脅迫進行研究。
[0005]為了從轉化植物體生產(chǎn)有用物質進行著多項研究，但其生產(chǎn)率較低，無法滿足商業(yè)化的要求。由此認為，為了較經(jīng)濟地大量生產(chǎn)具有高附加價值的生理活性物質，利用植物培養(yǎng)細胞以及植物體本身，降低生產(chǎn)費用的方法將被有效地應用。并且，開發(fā)能大量產(chǎn)生有用物質的植物體后，重新誘導植物培養(yǎng)細胞，可大大得縮短從產(chǎn)生有用物質到大量生產(chǎn)所需要的時間，比較容易進行培養(yǎng)細胞的擴大培養(yǎng)。并且，可排除可在轉化植物體中發(fā)生的環(huán)境危害問題，不僅能廣泛應用于生理活性蛋白質等多種目標化合物，即使還用于醫(yī)藥品、食品用途，相比微生物、動物培養(yǎng)，對于其的排斥感會小。
[0006]韓國授權專利第10-0813284號中公開有一種增加類胡蘿卜素含量的方法，其是將源自柑橘的八氫番茄紅素生物合成酶基因轉化到植物體中，從而增加類胡蘿卜素含量；韓國公開專利第2010-0100097中公開有一種提高鹽脅迫耐性的方法，其是將源自甘薯的MuSl基因轉化到植物體中，從而提高鹽脅迫耐性。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術問題
[0008]本發(fā)明是根據(jù)上述要求而提出的，本發(fā)明通過將包含在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因突變體的重組載體，轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而制備了大量蓄積功能性的類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體；并且，確認了所述轉化植物體表現(xiàn)出環(huán)境脅迫耐性，從而完成了本發(fā)明。
[0009]技術方案
[0010]未解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其包括將含有在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因突變體的重組載體，轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過 表達的步驟。
[0011]并且，本發(fā)明提供由上述方法制備的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體及即其種子。
[0012]并且，本發(fā)明提供一種環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其包括將含有在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因突變體的重組載體，轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過表達的步驟。
[0013]并且，本發(fā)明提供由上述方法制備的，環(huán)境脅迫耐性較野生型提高的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體及其種子。[0014]并且，本發(fā)明提供一種增加累積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素含量的組合物，其包含在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體。
[0015]并且，本發(fā)明提供一種能增加蓄積花青素的甘薯植物體的環(huán)境脅迫耐性的組合物，其包含在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體。
[0016]有益效果
[0017]由本發(fā)明制備的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體，可作為功能性食品被有效的使用；并且由于其顯示環(huán)境脅迫耐性，因此對于擴大收獲量，其使用價值有可能非常高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1表不在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因的植物表達載體。
[0019]圖2表示利用新紫美(么]天卜口| )甘薯體細胞，進行來源于甘薯IbOr-1ns基因突
變體轉化的步驟(A)以及通過轉化篩選標記物(HPTII)進行基因組DNA聚合酶鏈式反應(gDNA PCR)的結果(B) (N/T (Non transgenic plants):非轉化植物體；E/V (Empty vectorplants):用空載體轉化的對照組植物體；Zm-0r (transgenic plants):轉化植物體)。
[0020]圖3表示使本發(fā) 明中來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化新紫美甘薯的貯藏根的截面(A)以及地上部轉化體的形態(tài)(B) (N/T:非轉化植物體；E/V:用空載體轉化的對照組植物體；Zm-0r:轉化植物體；a:E/V植物體；b =Zm-Or植物體；c:E/V植物體莖部；d，e =Zm-Or植物體莖部)。
[0021]圖4是表示轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯轉化體中，與類胡蘿卜素生物合成相關基因的表達狀況的結果，該結果是通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR ),后進行電泳測定的。
[0022]圖5是表示轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯轉化體中，與花青素生物合成相關基因的表達狀況的結果，該結果是通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR ),后進行電泳測定的。
[0023]圖6是表示使來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化的新紫美甘薯貯藏根中，總類胡蘿卜素含量的結果，該是通過分光光度計進行測定的。
[0024]圖7是表示使來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化的新紫美甘薯貯藏根中，總花青素含量的結果，該是通過分光光度計進行測定的。
[0025]圖8表示在使來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化的新紫美甘薯葉子中，分析DPPH自由基清除活性(A)和多酚含量的結果(B )。
[0026]圖9表示在使來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化的新紫美甘薯葉子圓盤(旬[|4丑)中，分析對多種濃度的鹽脅迫耐性的結果。
[0027]圖10表示在使來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體過表達的轉化的新紫美甘薯葉盤中，分析由不同濃度的MV處理的脅迫耐性的結果?！揪唧w實施方式】
[0028]本發(fā)明為實現(xiàn)目的，提供一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其包括將含有在來源于甘薯的IbOrange基因中，人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因突變體的重組載體，轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過表達的步驟，IbOr-1ns基因突變體由SEQ ID N0.1的堿基序列構成。
[0029]本發(fā)明中，在IbOrange基因(參見韓國授權專利第0990330號)中插入KSQNPNL氨基酸，從而制備了 IbOr-1ns基因突變體。然而能增加類胡蘿卜素含量或者提高耐鹽性的突變體均可使用，沒有特殊的限制。
[0030]本發(fā)明的IbOr-1ns基因突變體優(yōu)選包括SEQ ID N0.1表示的堿基序列。所述堿基序列的突變體也包括在本發(fā)明的范圍內。更確切地說，上述基因突變體可包含與SEQ IDN0.1的堿基序列具有70%以上序列同源性的堿基序列，更優(yōu)選為80%以上，進一步優(yōu)選為90%以上，最優(yōu)選為95%以上。對于多聚核苷酸的“序列同源性的％”是通過比較兩個以最優(yōu)方式排列的序列和比較區(qū)域得以確認。比較區(qū)域中的部分多聚核苷酸序列與對于兩個序列的最優(yōu)排列的參考序列(不包括添加或者刪除)相比，可包含添加或者刪除(即間隙(gap))。
[0031]術語“重組”是指細胞復制異種核酸或表達上述核酸或表達由肽、異種肽或異種核酸編碼的蛋白質的細胞。重組細胞能將在上述細胞的天然形態(tài)中未被發(fā)現(xiàn)的基因或者基因片段表達為正義引物或者反義引物形態(tài)中的一個。而且，重組細胞可以表達從天然狀態(tài)的細胞中發(fā)現(xiàn)的基因，但上述基因是發(fā)生變形的，是通過人為手段再導入至細胞內的基因。
[0032]本發(fā)明的上述IbOr-1ns基因突變體序列可以插入到重組表達載體內。術語“重組表達載體”是指細菌質粒、噬菌體、酵母菌質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其它載體。大體上,任意的質粒及載體只要在宿主內能夠復制及穩(wěn)定化,均可使用。上述表達載體的重要特性在于，具有復制原點、啟動子、標記基因及翻譯控制單元(translation controlelement)。
[0033]通過本領域技術人員公知的方法可以構建包括IbOr-1ns蛋白質-編碼DNA序列及合適的轉錄/翻譯調節(jié)信號的表達載體。上述方法包括試管內重組DNA技術、DNA合成技術及活體內重組技術等。為了引導mRNA的合成，上述DNA序列可以有效地連接到表達載體內的合適的啟動子上。而且，表達載體可以包括作為翻譯起始部位的核糖體結合部位及轉錄終止子。
[0034]本發(fā)明的重組載體的優(yōu)選例為T1-質粒載體，其存在于根癌農(nóng)桿菌等合適的宿主中時，能夠將其自身的一部分，所謂的T-區(qū)域轉移到植物細胞中。其它類型的T1-質粒載體(參照EP0116718B1號)可以通過將植物細胞或雜合DNA適當?shù)夭迦氲街参锏幕蚪M內，從而生產(chǎn)新的植物的原生質體，目前用于雜合DNA序列轉移。T1-質粒載體最優(yōu)選的形態(tài)是EP0120516B1號及美國專利第4940838號中要求保護的所謂雙元(binary)載體。能夠將本發(fā)明的DNA導入到植物宿主中的其它適合的載體可以選自源自雙鏈植物病毒(例如，花椰菜花葉病毒(CaMV))及單鏈病毒、 雙粒病毒等的病毒載體，例如可以選自非完整性植物病毒載體。這些載體的使用對難以適當?shù)剞D化植物宿主時尤其有利。
[0035]表達載體優(yōu)選含有一個以上的選擇性標記。上述標記作為具有能夠用常規(guī)化學方法篩選的特性的核酸序列，包括能將轉化細胞從非轉化細胞中區(qū)分出來的所有的基因。例如有草甘膦(glyphosate)或草丁膦(phosphinothricin)等除草劑抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、G418、博來霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol)等抗生素耐受性基因,但并不僅限于此。
[0036]在本發(fā)明的重組載體中，啟動子可以是CaMV35S、肌動蛋白、泛素、pEMU、MAS或組蛋白啟動子，但不限于此。術語“啟動子”是指始于結構基因的DNA上游區(qū)域，是為了啟動轉錄而與RNA聚合酶結合的DNA分子?！爸参飭幼印笔侵改茉谥参锛毎袉愚D錄的啟動子?！敖M成型(constitutive)啟動子”是指在大部分的環(huán)境條件及生長狀態(tài)或者細胞分化條件下具有活性的啟動子。由于轉化體的篩選能夠在各階段、通過各種組織形成，因此本發(fā)明優(yōu)選組成型啟動子。并且，不限制組成型啟動子的選擇可能性。
[0037]在本發(fā)明的重組載體中，可以使用通常使用的終止子，例如胭脂堿合酶(NOS)JK稻ct -淀粉酶RAmylA終止子、菜豆堿(phaseoline)終止子、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的章魚堿(Octopine)基因的終止子等,但不限定于此。關于終止子的必要性，一般被認為是這些區(qū)域能促進植物細胞內轉錄的確定性及效率。因此，在本發(fā)明的內容中優(yōu)選使用終止子。
[0038]植物的轉化是指將DNA轉移到植物的任意方法。這些轉化方法不一定需要經(jīng)過再生及(或)組織培養(yǎng)期。目前，植物種的轉化不僅對于雙子葉植物，包括單子葉植物量子的植物種也非常普遍。原則上，任意的轉化方法均可被用于將本發(fā)明的雜合DNA導入到祖細胞中。所述方法可選自對于原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F(xiàn).A.et al.，1982, Nature296,72-74 ；Negrutiu 1.et al., Junel987, Plant Mol.Biol.8,363-373(Krens, F.A.等人，1982，自然 296，72-74 ;Negrutiu 1.等人，1987 年 6 月，植物分子生物學 8，363-373))、原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.et al., 1985Bio/Technol.3，1099-1102 (Shillito R.D.等人，1985生物/技術3，1099-1102))、對植物元素的顯微注射法(Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185 (克洛斯威 A.等人，1986，分子遺傳學和基因組202，179-185))、各種植物元素的(DNA或者RNA-涂布的)微粒轟擊法(Klein T.M.et al., 1987, Nature327,70 (Klein T.M.等人，1987，自然 327，70))、依據(jù)植物的浸潤或者成熟花粉或者小孢子轉化的，根癌農(nóng)桿菌介導的基因轉移(非完整性)中依據(jù)病毒的感染(ΕΡ0301316號)等。本發(fā)明的優(yōu)選方法包含農(nóng)桿菌介導的DNA轉移。更為優(yōu)選的是利用ΕΡΑ120516號及美國專利第4940838號所記載的所謂雙元載體技術的方法。
[0039]根據(jù)本發(fā)明一個體現(xiàn)例的方法，上述蓄積花青素的甘薯植物體優(yōu)選紫色甘薯，更優(yōu)選品種為新紫美的甘薯，但并不僅限于此。
[0040]并且，本發(fā)明提供由上述方法制備的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體及其種子。
[0041]本發(fā)明確認了用本發(fā)明的來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體進行轉化的新紫美甘薯植物體，其IbOrange基因以及與類胡蘿卜素生物合成相關的主要基因PSY、LCY-β、LCY- ε以及CHY-β )的表達量，較非轉化植物體增加，并且還確認了類胡蘿卜素含量較非轉化植物體增加約 3倍以上(參考圖4以及圖6)。
[0042]并且，本發(fā)明提供一種相比野生型對環(huán)境脅迫的耐性增加的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其包括將含有由SEQ IDN0.1的堿基序列構成的IbOr-1ns基因突變體的重組載體轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過表達的步驟，所述IbOr-1ns基因突變體是在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定喊基序列而得到的。
[0043]根據(jù)本發(fā)明一個體現(xiàn)例的方法，所述蓄積花青素的甘薯植物體優(yōu)選紫色甘薯，更優(yōu)選品種為新紫美的甘薯，但并不僅限于此。
[0044]根據(jù)本發(fā)明一個體現(xiàn)例的方法，上述環(huán)境脅迫優(yōu)選為非生物學(abiotic)脅迫，更優(yōu)選為鹽或者甲基紫精，但并不僅限于此。
[0045]并且，本發(fā)明提供由上述方法制備的，較野生型環(huán)境脅迫耐性提高的，大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體及其植物體種子。
[0046]并且，本發(fā)明提供一種增加蓄積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素含量的組合物，其包含在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體，所述IbOr-1ns基因變異體由SEQ ID N0.1的堿基序列構成。本發(fā)明的組合物包含有SEQ ID N0.1的堿基序列構成的IbOr-1ns基因變異體作為有效成分，并通過將上述基因突變體轉化至大量蓄積花青素的甘薯植物體，從而增加蓄積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素的含量。
[0047]并且，本發(fā)明提供一種增加蓄積花青素的甘薯植物體的環(huán)境脅迫耐性的組合物，其包含在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體，所述IbOr-1ns基因變異體由SEQ ID N0.1的堿基序列構成。本發(fā)明的組合物包含有SEQ ID N0.1的堿基序列構成的IbOr-1ns基因變異體作為有效成分，并通過將上述基因突變體轉化至蓄積花青素的甘薯植物體，從而增加大量蓄積花青素的甘薯植物體的環(huán)境脅迫耐性。
[0048]以下，將通過實施例詳細地說明本發(fā)明。但是，下述實施例只是為了例示本發(fā)明，本發(fā)明的內容并不限定于下述實施例。
[0049]實施例1.1bOr-1ns基因的克隆及堿基序列分析
[0050]制備了用于克隆甘薯Orange基因的PCR引物，其引物序列如下:正向引物(5’_atggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3’ ；SEQ ID N0.2)及反向弓丨物(5’-ttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3’ ；SEQ ID N0.3)。將由此得到的 IbOr 作為模板，實施重疊(overlapping)PCR,從而實施了對IbOr的特定堿基序列的人為突變。為了插入IbOrange基因的氨基酸序列(參見韓國授權專利第0990330號)內的第133號氨基酸起被推定為-KSQNPNL-的堿基序列，制備了 PCR引物，此時所使用的引物序列如下:正向引物(5’ -gaaaagcaagaaaataaacttaaatcccagaaccctaac-3’ ；SEQID N0.4)及反向引物(5，-aagatttgcggatgtcaggttagggttctgggatttaag-3’ ；SEQ ID N0.5)。其結果，獲得了約 921bp 的 PCR 產(chǎn)物，克隆到PGEM-T-載體上后，通過測序確認了從第133號氨基酸起以-KSQNPNL-插入的突變。使用Clonetech公司的優(yōu)勢2(advantage2)聚合酶實施PCR,使用pGEMeasy克隆載體(Promega)克隆預計大小的PCR產(chǎn)物后，通過測序確認了全部堿基序列。將此cDNA基因命名為IbOr-1ns。本發(fā)明的IbOr-1ns基因全長為924bp的cDNA編碼307個氨基酸。用氨基酸排列預測的等電點(pi)和分子量(Mw)分別為8.45和33.74kDa。
[0051]在引物的堿基序列中，為了使用英杰公司(Invitrogen)的通道(g ateway)表達系統(tǒng)，在上述引物的5’末端上分別添加銜接序列(adapt er sequence)(用大寫字母標記)。喊基序列為正向引物(5’ -CAAAAAAGCAGGCTNNa tggtatattcaggtagaatcttgtcgctc-3’ ；SEQID N0.6)及反向引物(5，-CAAGAAAGCTGGGTNttaatcaaatgggtcaattcgtgggtcatg-3’ ；SEQ IDN0.7)。首先,使用pGEMeasy克隆載體(Promega)克隆上述預計大小的PCR產(chǎn)物后,通過測序確認了全部堿基序列。將此cDNA基因命名為IbOr-1ns。對克隆有IbOrange基因的pGEMeasy載體進行BP反應，從而在pD0NR207載體上克隆基因。之后，通過pD0NR207和作為植物表達載體的PGWBlI載體的LR反應，克隆得到IbOr-1ns基因的植物表達載體(圖1)。
[0052]實施例2.向新紫美甘薯體細胞培養(yǎng)細胞中轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因變異體
[0053]在35S啟動子的調節(jié)下，將來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體轉化至大量含有花青素的甘薯品種新紫美體細胞培養(yǎng)細胞(圖2A)。其結果，通過選擇培養(yǎng)基獲得轉化小植物體，并以此為對象，通過基因組DNA PCR測定轉化體篩選標記物潮霉素基因HPT II的表達，從而篩選出轉化體。將上述轉化體標記為Zm-Or (圖2B)。
[0054]實施例3.轉化來源于甘薯IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體的表型分析
[0055]將來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體轉化至紫色甘薯新紫美后，獲得貯藏根，結果如圖3所示，如果是非轉化的新紫美時，無明顯變化，即仍表現(xiàn)為深紫色；與此相反，如果是Zm-Or時，表現(xiàn)出了黃色和紫色混合的表型(圖3A)。并且，關于莖的表型，轉化體的側芽和側枝大多數(shù)比較發(fā)達，其葉子數(shù)也比較多(圖3B)。
[0056]實施例4.在轉化來源于甘薯IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體中，與類胡蘿卜素的生物合 成相關基因的表達分析
[0057]以非轉化以及轉化新紫美甘薯植物體為對象，通過RT-PCR分析了與類胡蘿卜素生物合成相關基因以及IbOrange基因的表達。其結果，如果是非轉化植物體以及轉化空載體的植物體時，IbOrange基因的表達較弱，甚至不表達；與此相反，如果是Zm-Or時，IbOrange基因的表達大幅度地增加。并且，如果是非轉化植物體以及轉化空載體的植物體時，大部分類胡蘿卜素相關的基因表達非常弱或者不表達；與此相反，如果是Zm-Or時，PSY,LCY-β ,LCY- ε ,CHY-β等，大部分與類胡蘿卜素的生物合成相關基因的表達增加。并且，與獨腳金內酯生物合成相關的基因(strigolactone biosynthesis related gene)如CCR4、CCR基因等和ABA生物合成主要基因NCED基因的表達也有了增加(圖4)。
[0058]實施例5.在轉化來源于甘薯IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體中，與花青素的生物合成相關基因的表達分析
[0059]以非轉化以及轉化新紫美甘薯植物體為對象，通過RT-PCR分析了與花青素生物合成相關基因的表達。其結果，如果是非轉化新紫美甘薯植物體和轉化空載體的新紫美甘薯植物體時，大部分與花青素相關基因的表達均較強；與此相反，如果是Zm-Or時，CHS、CH1、F3H、ANS、3GT等大部分花青素生物合成的主要基因的表達均減少。然而，在維管(vascular)內的與花青素的蓄積相關的基因，例如VP24與非轉化植物體相比，表達差異并不是非常大(圖5)。
[0060]實施例6.對轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體的類胡蘿卜素的含量分析
[0061]為確認轉化的新紫美甘薯植物體的類胡蘿卜素的含量是否有變化，以非轉化以及轉化新紫美甘薯植物體為對象，對貯藏根組織的類胡蘿卜素含量，通過分光光度計檢測440nm處的吸光度而測定。從結果中可確認，轉化的新紫美甘薯植物體與作為對照組的非轉化體相比，類胡蘿卜素含量增加了約3倍以上(圖6)。
[0062]實施例7.對轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體的花青素的含量分析
[0063]為確認轉化的新紫美甘薯植物體的花青素的含量是否有變化，以非轉化以及轉化新紫美甘薯植物體為對象，對貯藏根組織的花青素含量，通過分光光度計進行測定。從結果中可確認，轉化新紫美甘薯植物體與作為對照組的非轉化體相比，花青素含量降低了約
0.6-0.8倍以上(圖7)。然而，轉化植物體#1-1顯示出了與非轉化植物體類似的花青素含量，且該轉化株顯示出的類胡蘿卜素含量最高，因此其被認為是比較理想的轉化植物體(圖6、圖 7)。
[0064]實施例8.對轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體葉子的低分子抗氧化活性分析
[0065]為了以轉化的新紫美甘薯植物體葉子為對象，比較低分子抗氧化物質的含量，測定了 DPPH自由基消除活性(圖8A)。其結果，如果是非轉化體和轉化空載體的植物體時，每克(g)鮮重(fresh weight,FW)中表現(xiàn)出了約相當于250-340 μ g的抗壞血酸(ASA)的活性；而如果是轉化體時，表現(xiàn)出了約相當于310-610 μ g的抗壞血酸的活性，尤其是轉化體#1-1顯示出了最高的抗氧化活性。并且，對于多酚，如果是非轉化體和轉化空載體的植物體時，每克鮮重表現(xiàn)出了約相當于170-190 μ g的綠原酸(chlorogenic acid)的活性；而如果是轉化體時，表現(xiàn)出了約230-360 μ g的綠原酸的活性，即轉化體較對照組顯示出了更高的含量(圖8B)。
[0066]實施例9.對轉化來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體的新紫美甘薯植物體的非生物性脅迫耐性分析
[0067]依據(jù)本發(fā)明，利用來源于甘薯的IbOr-1ns基因突變體轉化的新紫美甘薯植物體相比于非轉化新紫美，其β_胡蘿卜素含量增加了 2.5-2.9倍以上。為進一步確認，現(xiàn)有的花青素和通過本發(fā)明增加的類胡蘿卜素能否使轉化植物體具備脅迫耐性，利用鹽、MV等處理，實施非生物性脅迫。
[0068]首先，將對照組和轉化體葉狀莖頂端第4、5個葉子，制備成直徑為8mm的葉子圓盤(disc)，后在0、150、200、400mM濃度的NaCl溶液中，25°C的暗條件下浸潰24小時。通過3，3-二胺基聯(lián)苯胺(3，3-diaminobezidine, DAB)染色觀察了各個葉子圓盤受到的氧化脅迫。DAB與細胞內過氧化氫(H202)發(fā)生反應，產(chǎn)生褐色的沉淀物。在lmg/ml DAB-HCl(pH3.8)溶液中，將各個處理組浸潰24小時后，對顯色程度進行照相。其結果，如果作為對照組的新紫美和轉化空載體的新紫美時，隨著NaCl濃度的增加褐色的顯色程度更深，即隨著濃度的增加，受到更多的氧化脅迫；而與此相比，如果是轉化體時，與對照組相比，其顯色程度較淺，即表現(xiàn)出了對于由鹽引起的氧化脅迫的耐性(圖9)。
[0069]并且，對于另一個氧化脅迫源的甲基紫精(MV)，取六個直徑為8mm的葉子圓盤，分別懸浮于直徑為2.5cm的多格培養(yǎng)皿(multi petri dish)中，其每孔包含有3ml的包含O、
2.5、5、10 μ M的MV的0.4%山梨醇溶液。在25°C的暗條件下培養(yǎng)12小時，使MV被吸收后，在連續(xù)光條件下培養(yǎng)24小時。其中以12小時為間隔，利用電導計(model455C，Istek公司，韓國)測定溶液的離子電導率，以及通過DAB染色測定24小時后的氧化脅迫，從而觀察葉子的損傷程度。如果是非轉化體和轉化空載體的對照組植物體時，用2.5 μ M的MV處理后，到48小時其顯示37.3%和55.7的高離子電導率，從而可知其對由MV產(chǎn)生的氧化脅迫具有很強的敏感性。與此相反，如果是轉化體時，其僅顯示25.6%和31.2%的低離子電導率，從而可知其對由MV產(chǎn)生的氧化脅迫具有很強的耐性。如果是非轉化體和轉化空載體的對照組植物體時，用5 μ M的MV處理后，到48小時其顯示51.9%和62.5的高離子電導率，從而可知其對由MV產(chǎn)生的氧化脅迫具有很強的敏感性。與此相反，如果是轉化體時，其僅顯示34.9%和40.8%的低離子電導率，從而可知其對由MV產(chǎn)生的氧化脅迫具有很強的耐性(圖10Α)。并且，在lmg/ml DAB-HCl (pH3.8)溶液中，將各個處理組浸潰24小時后，進行顯色的結果顯示，如果是非轉化體和轉化空載體的對照組植物體時，隨著MV濃度的增加，其褐色的顯色程度越深，即隨著濃度的增加，受到更多的氧化脅迫；與此相反，如果是轉化植物體時，其顯色程 度相比于對照組低，即顯示對由MV引起的氧化脅迫的耐性(圖10B)。
【權利要求】
1.一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其特征在于，其包括將含有由SEQ ID N0.1的堿基序列構成的IbOr-1ns基因突變體的重組載體轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過表達的步驟,所述IbOr-1ns基因突變體是在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列而得到的。
2.根據(jù)權利要求1所述的大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其特征在于，所述甘薯植物體為紫色甘薯。
3.一種大量蓄積類胡蘿卜素以及花青素的轉化甘薯植物體，其特征在于，其通過權利要求I或者2所述的方法制備。
4.通過根據(jù)權利要求3所述的方法得到的甘薯植物體的種子。
5.一種相比野生型對環(huán)境脅迫的耐性增加的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其包括將含有由SEQ ID N0.1的堿基序列構成的IbOr-1ns基因突變體的重組載體轉化至蓄積花青素的甘薯植物體內，從而使IbOr-1ns基因突變體過表達的步驟，所述IbOr-1ns基因突變體是在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列而得到的。
6.根據(jù)權利要求5所述的相比野生型對環(huán)境脅迫的耐性增加的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其特征在于，所述甘薯植物體為紫色甘薯。
7.根據(jù)權利要求5所述的相比野生型對環(huán)境脅迫的耐性增加的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體的制備方法，其特征在于，所述環(huán)境脅迫為非生物性脅迫。
8.通過權利要求5至7中任意一項所述的方法而制備的相比野生型對環(huán)境脅迫的耐性增加的大量蓄積花青素的轉化甘薯植物體。
9.通過權利要求8所述的方法得到的甘薯植物體的種子。
10.一種增加蓄積花青素的甘薯植物體的類胡蘿卜素含量的組合物，其特征在于，其包含在來源于甘薯的IbOrange基因中人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體,所述IbOr-1ns基因變異體由SEQ ID N0.1的喊基序列構成。
11.一種增加蓄積花青素的甘薯植物體的環(huán)境脅迫耐性的組合物，其特征在于，其包含在來源于甘薯的IbOrange 基因中人為地插入特定堿基序列的IbOr-1ns基因變異體,所述IbOr-1ns基因變異體由SEQ ID N0.1的喊基序列構成。
【文檔編號】A01H5/00GK103917087SQ201180072691
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2011年10月24日 優(yōu)先權日:2011年8月5日
【發(fā)明者】郭尚洙, 李幸順, 金善荷, 樸成喆, 鄭在哲 申請人:韓國生命工學研究院