專利名稱：一種Bt蛋白Cry70Aa1、其編碼基因及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的Bt蛋白，具體地說，涉及一種Bt蛋白Cry70Aal、其編碼基因
及應用。
背景技術：
在人類生產過程中，蟲害是造成農業(yè)生產損失及影響人類健康的重要因素。為了減少這些損失，多年來，對農作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學防治手段進行防治，但由于化學農藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農副產品中農藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學農藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。目前在農田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學合成農藥的有力替代品，Bt還是轉基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年Schn印f從菌株HD-I中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來，人們已經分離克隆了 500多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N，等Microbiol Mol Biol Rev，1998，62 :807-813 ；http://www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil Crickmore/Bt/)。一般而言，Cryl, Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應用于植物的鱗翅目害蟲的防治。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B. thuringiensis subsp. israelensis，簡稱Bti)產生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛用于蚊蟲的防治。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey, W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉基因抗蟲植物的應用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。1985 年，McGaughey 報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Btsubsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt殺蟲劑產生了明顯的抗性(Tabashnik，B. Ε,等 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地，發(fā)現Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經形成(馮夏.1996.昆蟲學報，39(3)238-244 ；Hofte, H.，1988. Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前發(fā)現在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產生了抗性，用選擇壓力數學模型預測到，在Bt轉基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產生抗性(khnepf，Ε.，等1998.Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究證明Bti在大田的使用中尚未發(fā)現抗性問題，但是蚊蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(Georghiou G P,1997. Applied and Environmental Microbiology，63 :1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力Bt基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產生抗性的問題，提供一種新的Bt蛋白Cry70Aal、其編碼基因及應用。為了實現本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種Bt蛋白Cry70Aal，其氨基酸序列為1) SEQID No. 1所示的氨基酸序列；或 SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如在非活性區(qū)段，將第774位的Ala替換為val，將第14位的ala缺失，在第27位增加一個Gly或增加一個lie，不影響蛋白的活性。本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)新菌株HS18-1。該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，保藏號為CGMCC No. 2718。通過對HS18-1的毒力測試表明，HS18-1對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等，均具有極高的毒力。從HS18-1基因組及質粒測序結果中發(fā)現該菌株存在一個新的cry基因，進一步設計其全長基因引物，克隆得到cry70Aal基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，全長為對0% ，分析表明，GC含量為35. 33%，編碼803個氨基酸組成的蛋白。經測定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 1 所示。在 softberry 網站采用 bacterialsigma7. 0 promoter 程序對全序列進行預測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為cry70Aal。Cry70Aal蛋白的氨基酸組成如表1所示。表lCry70Aal蛋白的氨基酸組成
權利要求
1.一種Bt蛋白Cry70Aal，其氨基酸序列為1)SEQID No. 1所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 2所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.含有權利要求1所述蛋白的殺蟲劑。
7.權利要求2或3所述基因或權利要求4所述載體在制備轉基因植物中的應用。
8.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述基因、權利要求4所述載體或權利要求5所述宿主細胞在提高植物抗蟲性中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述植物為棉花、玉米、水稻。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cry70Aa1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或該序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明的Cry70Aa1蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，可將其編碼基因轉化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農作物，使其具備相應的抗蟲活性，從而降低農藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經濟價值和應用前景。
文檔編號A01H5/00GK102584960SQ201110459669
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者劉懷年, 李雙成, 李巧, 李平, 王世全, 鄭愛萍 申請人:四川農業(yè)大學