專利名稱：一種提高白羽扇豆原生質(zhì)體再生頻率的培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高羽扇豆原生質(zhì)體再生頻率的培養(yǎng)基，屬于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)和植物生物技術(shù)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羽扇豆是一種具有極高應(yīng)用價值的草本植物，其種子蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，含油量為5% -20%，不僅可作食用，而且可作為優(yōu)質(zhì)的飼用。同時，羽扇豆花型美觀，花期2個多月，有單色和復(fù)色，在室內(nèi)、庭院、花壇等地方種植，極具裝飾效果。目前在歐洲、澳大利亞、 亞洲及非洲的許多國家均有種植，廣泛栽培的品種主要有白羽扇豆(Lupinus albus)、窄葉羽扇豆(L.angustifolius)和黃羽扇豆(L. Iuteus)。我國羽扇豆僅局限于零星的栽培嘗試，主要用于花卉。羽扇豆是重要的經(jīng)濟植物，但其再生能力很差，不僅表現(xiàn)在愈傷到再生植株，而且表現(xiàn)在從植株到生根，是目前世界上公認(rèn)的很難通過組織培養(yǎng)方法開展生物技術(shù)研究的植物之一。目前國內(nèi)外只有1篇有關(guān)羽扇豆原生質(zhì)體再生成植株的報道，且只得到1株再生植株，因此，限制其生物技術(shù)的開展，包括原生質(zhì)體的融合，胚胎培救以及小孢子培養(yǎng)等；不利于羽扇豆相關(guān)的生物技術(shù)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，我們通過多年的實踐，摸索出適于羽扇豆從愈傷到再生植株的培養(yǎng)基，解決了羽扇豆再生體系這個瓶頸問題。本發(fā)明所述的提高白羽扇豆原生質(zhì)體再生頻率的培養(yǎng)基，其組成如下(1)基本培養(yǎng)基B5大量、微量+MS有機；(2)激素的組合0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ+0. 5mg/L 赤霉素；(3)其它成分蔗糖5g/L+果糖126mg/L+核糖120mg/L+木糖120mg/L+甘露糖 126mg/L+纖維二糖137mg/L+水解酪蛋白200mg/L+硝酸銀5g/L+瓊脂糖8g/L。本發(fā)明選用栽培品種‘白羽扇豆’為研究對象，從3個方面對培養(yǎng)基成分進行嘗試。第一，選用4種基本培養(yǎng)基，分別是MS基本培養(yǎng)基，B5基本培養(yǎng)基，MS大量和微量再加上B5有機，B5大量和微量再加上MS有機；第二，在激素組合方面，選用2種不同生長素類 0，4-D和NAA)，再選用3種不同細(xì)胞分裂素類(6-BA，玉米素和TDZ)進行組合；第三，選用加赤霉素和不加赤霉素的方法。通過16種不同培養(yǎng)基的比較分析，找到了上述適合白羽扇豆原生質(zhì)體再生成植株的培養(yǎng)基，再生頻率高達(dá)40%。解決了羽扇豆愈傷到植株這個瓶頸問題，對開展羽扇豆相關(guān)生物技術(shù)(如原生質(zhì)體再生，原生質(zhì)融合，轉(zhuǎn)基因研究，種質(zhì)資源的保存和創(chuàng)新研究)等均具有重要的意義。


圖1白羽扇豆原生質(zhì)體提取、分離、培養(yǎng)和愈傷的誘導(dǎo)照片。A是白羽扇豆種子；B是4-5周無菌苗照片；C是經(jīng)酶切葉片；D是梯度離心分離原生質(zhì)體；E是培養(yǎng)1周分裂原生質(zhì)體；F是培養(yǎng)4周形成小愈傷；G是愈傷組織形成。圖2.白羽扇豆在同一基本培養(yǎng)基(B5大量、微量+MS有機)條件下不同激素組合出苗情況比較A，0. 5mg/L 2，4_D+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L 玉米素；B, 0. 5mg/L 2，4-D+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L 玉米素 +0. 5mg/L 赤霉素；C，0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ ；D，0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ+0. 5mg/L 赤霉素。圖3是白羽扇豆在16種不同培養(yǎng)基再生率的比較。
具體實施例方式實施例1篩選過程選用栽培品種白羽扇豆(Lupinus albus)作為實驗材料；通過培育出 4-5周無菌幼苗，取其幼葉；經(jīng)酶切，分離原生質(zhì)體；通過液體培養(yǎng)4-5周，獲得愈傷組織； 通過選用不同培養(yǎng)基組合，獲得再生苗。具體操作如下(1)將白羽扇豆種子(圖1A)用96%酒精先處理15秒，然后用3%次氯酸鈉處理 15分鐘，有滅菌的重蒸水沖洗3次，再在滅菌的重蒸水浸泡2小時，便于種子吸水發(fā)芽。(2)滅過菌的種子(圖1B)放在1/2MS培養(yǎng)基中(沒有有機成份)+20克蔗糖， ρΗ5· 8，在光照培養(yǎng)箱生長4周(250C，16h光照/8小時不見光，15001x)。(3)取無菌幼葉(圖1C)經(jīng)酶解(0. 5%離析酶R_10，l%纖維素酶‘Onozuka，， 0. 9%甘露醇)，過夜，分離原生質(zhì)體前輕微震蕩10分鐘。(4)經(jīng) 50 μ m 濾網(wǎng)過濾、洗滌(0. 154Mol/L 氯化鈉，0. 125Mol/L 氯化鈣，0. 005Mol/ L氯化鉀，0. 005Mol/L葡萄糖，pH，5. 8)，離心，用蔗糖溶液
梯度離心；得原生質(zhì)體(圖1D)(5)將分離的原生質(zhì)體用吸管吸出，經(jīng)洗滌，用液體培養(yǎng)基稀釋至3Χ IO5個原生質(zhì)體/mL的密度。液體培養(yǎng)基的成分為(MS培養(yǎng)基，0. 127g/L蔗糖，0. U6g/L甘露醇， 68. 46g/L 果糖，lmg/L 萘乙酸鈉(NAA), 0. 2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0. 5mg/L 玉米素(Zeatin)，pH，5.6)。圖IE為不見光條件上(25°C )生長1周，原生質(zhì)體開始分裂，細(xì)胞壁開始形成(圖1E)。(6)在上述液體培養(yǎng)基里生長4周的情況，形成小的愈傷組織(圖1F)。(7)將上述小的愈傷組織轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織和植株的形成(圖1G)； 所述的固體培養(yǎng)基設(shè)計了 16種不同培養(yǎng)基(表1)方式一基本培養(yǎng)基種類的選擇，我們選用4種，分別以MS大量、微量、有機(培養(yǎng)基1-4)，B5大量、微量、有機(5-8)，MS大量、微量加上B5有機(培養(yǎng)基9_12)，B5大量、微量加上MS有機(培養(yǎng)基13-16)；方式二 在激素組合方面，首先選用2種不同生長素類 ，4-D和NAA)，再選用3種不同細(xì)胞分裂素類(6-BA，玉米素和TDA)進行比較；方式三選用加赤霉素和不加赤霉素進行比較。表1用于白羽扇豆愈傷組織再生植株培養(yǎng)基成分比較
培養(yǎng)基12345678910111213141516基本培養(yǎng)基種類MS大量+微量+有機B5大量+微量+有機MS大量+微量+ B5有機B5大量+微量 MS有機蔗糖(g/L)5555果糖(mg/L)126126126126核糖(mg/L)120120120120木糖(mg/L)120120120120甘露糖(mg/L)126126126126纖維二糖(mg/L)137137137137水解酪蛋白(mg/L)200200200200硝酸銀(g/L)5555瓊脂糖(g/L )88882,4-D (mg/L)0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5NAA (mg/L)0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 56-BA ( mg/L )2. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 02. 0赤霉素(mg/L)0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5玉米素(mg/L)1. 01. 01. 01. 01. 01. 01. 01. 0TDZ (mg/L)1. 01. 01. 01. 01. 01. 01. 01. 0注2，4-D，2，4-二氯苯氧乙酸；NAA，萘乙酸鈉；6-BA，6_芐氨基腺嘌呤；TDZ，噻苯隆，pH = 5. 8 ；再生率=出苗數(shù)/供試愈傷數(shù)X 100%。圖2是白羽扇豆在同一基本培養(yǎng)基(B5大量、微量+MS有機)條件下不同激素組合出苗情況比較。圖3是白羽扇豆在16種不同培養(yǎng)基再生率的比較，其中(1)橫坐標(biāo)為4種不同類型基本培養(yǎng)基(1，MS為基本培養(yǎng)基；2，B5為基本培養(yǎng)基； 3，MS大量、微量+B5有機；4，B5大量、微量+MS有機)(2)縱坐標(biāo)白羽扇豆愈傷組織再生率(％ )，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)60個愈傷，共180個愈傷。(3) 4種激素組合處理1 0. 5mg/L 2，4_D+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L 玉米素；處理2 :0. 5mg/L 2，4-D+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L 玉米素 +0. 5mg/L 赤霉素；處理3 :0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ ；
5
處理4 :0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ+O. 5mg/L 赤霉素。綜合比較16種培養(yǎng)基愈傷組織的再生率(表1和圖3)，可以明顯看出4種不同類型基本培養(yǎng)基中以第4種為最佳，即B5大量、微量+MS有機。如果用該種培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，從激素的組合來看，0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA+l. Omg/L TDZ+O. 5mg/L赤霉素為最佳，再生率達(dá)40%。該組合在4種不同基本培養(yǎng)基條件下再生率均為最高。
權(quán)利要求
1. 一種提高白羽扇豆原生質(zhì)體再生頻率的培養(yǎng)基，其特征在于組成如下(1)基本培養(yǎng)基B5大量、微量+MS有機；(2)激素的組合0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA +1.0 mg/L TDZ + 0. 5 mg/L 赤霉素；(3)其它成分蔗糖5g/L +果糖126 mg/L +核糖120 mg/L +木糖120 mg/L +甘露糖126 mg/L +纖維二糖137 mg/L +水解酪蛋白200 mg/L +硝酸銀5 g/L +瓊脂糖 8g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高羽扇豆原生質(zhì)體再生頻率的培養(yǎng)基，其組成為基本培養(yǎng)基B5大量、微量+MS有機；激素的組合0.5mg/LNAA+2.0mg/L6-BA+1.0mg/LTDZ+0.5mg/L赤霉素；其它成分蔗糖5g/L+果糖126mg/L+核糖120mg/L+木糖120mg/L+甘露糖126mg/L+纖維二糖137mg/L+水解酪蛋白200mg/L+硝酸銀5g/L+瓊脂糖8g/L。該培養(yǎng)基解決了羽扇豆愈傷到植株這個瓶頸問題，對開展羽扇豆相關(guān)生物技術(shù)等均具有重要的意義。
文檔編號A01H4/00GK102550410SQ20111045170
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者劉銀, 杜坤, 王娟, 王幼平, 蔣金金 申請人:揚州大學(xué)