專利名稱：毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域，尤其是ー種毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
毛葡萄(Kiii1S heyneana Roem. & Schult.)又名絨毛葡萄、五角葉葡萄,在我國華中、華東、西南、華南北部、西北的陜、甘及華北的山西均有分布，是分布最為廣泛的野生葡萄種類之一。毛葡萄抗性強、適應(yīng)性好，結(jié)果系數(shù)高，易與葡萄栽培品種雜交，既是葡萄栽培的優(yōu)良抗性砧木，也是葡萄抗性育種的優(yōu)良親本。由干葡萄遺傳背景復(fù)雜、生命周期長，使常規(guī)雜交育種在品種改良上受到極大限制，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可實現(xiàn)毛葡萄抗性性狀與葡萄栽培品種的品質(zhì)性狀有效結(jié)合，培育出優(yōu)質(zhì)高抗葡萄新品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的關(guān)鍵是高效再生體系的建立，而毛葡萄離體再生研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，它能為毛葡萄遺傳轉(zhuǎn)化奠定堅實基礎(chǔ)，為葡萄其他優(yōu)良性狀向毛葡萄的轉(zhuǎn)移提供了一條有效的途徑，以滿足農(nóng)業(yè)生
產(chǎn)需要。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節(jié)選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質(zhì)量百分比為O. 1%的升汞溶液(即相當(dāng)于Ig氯化汞溶解在I升水中)浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5_6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養(yǎng)基中，在溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2,光照時間為12h/d的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)誘導(dǎo)至腋芽萌發(fā)，獲得誘導(dǎo)的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導(dǎo)取步驟一中獲得的誘導(dǎo)的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產(chǎn)生再生不定芽；
步驟三、生根培養(yǎng)取步驟ニ中產(chǎn)生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，先光下培養(yǎng)7d,再暗培養(yǎng)7d后，然后轉(zhuǎn)入光下繼續(xù)培養(yǎng)至正常生根，獲得試管苗；培養(yǎng)溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2，光照時間為12h/d ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量百分比為O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質(zhì)中，用1/8MS營養(yǎng)液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養(yǎng)液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質(zhì)量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養(yǎng)缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 TC的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，置于溫、室內(nèi)煉苗30d，最后定植到大田即可。步驟一中采用的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加
2.Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20 g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。步驟ニ中采用的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。步驟三中采用的1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 14 g吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O?！?br> 步驟四中采用的1/8MS營養(yǎng)液是指MS培養(yǎng)基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 05mg ·じ1吲哚こ酸。由于采用上述的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)成功實現(xiàn)毛葡萄葉片離體再生，毛葡萄再生率可達37%以上，最高可達93. 3%，生根率可達90%以上，成活率可達100%，為毛葡萄遺傳轉(zhuǎn)化奠定堅實基礎(chǔ)，為葡萄其他優(yōu)良性狀向毛葡萄的轉(zhuǎn)移提供了一條有效的途徑；本發(fā)明方法簡單，成本低廉，使用效果好。本發(fā)明的實施例I :毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節(jié)選取生長健壯的毛葡萄“花溪-4”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質(zhì)量百分比為O. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養(yǎng)基上(每升MS培養(yǎng)基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O), MS培養(yǎng)基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d ;培養(yǎng)誘導(dǎo)至腋芽萌發(fā)，獲得誘導(dǎo)的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導(dǎo)取步驟一中獲得的誘導(dǎo)的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養(yǎng)基上(每升MS培養(yǎng)基添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O)，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產(chǎn)生再生不定芽；45d再生率可達93. 3% ;
步驟三、生根培養(yǎng)取步驟ニ中產(chǎn)生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O)，先光下培養(yǎng)7d，再暗培養(yǎng)7d后，然后轉(zhuǎn)入光下繼續(xù)培養(yǎng)至正常生根，獲得試管苗；培養(yǎng)溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2，光照時間為12h/d ；30d后生根率可達92. 5% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量百分比為O. 1% KMnO4溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質(zhì)中，用1/8MS營養(yǎng)液(1/8MS營養(yǎng)液是指MS培養(yǎng)基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 05mg じ1吲哚こ酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養(yǎng)液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質(zhì)量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養(yǎng)缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25± I°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，置于溫室內(nèi)煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%。本發(fā)明的實施例2 :毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟，
步驟一、無菌系的建立在生長季節(jié)選取生長健壯的毛葡萄“農(nóng)院-11”新梢為外植體，在自來水下沖洗干凈后，先在體積百分比為70%的酒精中浸泡30s，無菌水沖洗3次，再用質(zhì) 量百分比為O. 1%升汞溶液浸泡消毒8min，無菌水沖洗5次，剪成單芽莖段，接種到MS培養(yǎng)基上(每升MS培養(yǎng)基附加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O), MS培養(yǎng)基的溫度為25土1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d ;培養(yǎng)誘導(dǎo)至腋芽萌發(fā)，獲得誘導(dǎo)的腋芽葉片；
步驟ニ、不定芽誘導(dǎo)取步驟一中獲得的誘導(dǎo)的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養(yǎng)基上(每升MS培養(yǎng)基添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，ρΗ5· 8-6. O)，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s-1 · πΓ2，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產(chǎn)生再生不定芽；35d時再生率可達37. 5% ；
步驟三、生根培養(yǎng)取步驟ニ中產(chǎn)生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中(1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加
8.0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O)，先光下培養(yǎng)7d，再暗培養(yǎng)7d后，然后轉(zhuǎn)入光下繼續(xù)培養(yǎng)至正常生根，獲得試管苗；培養(yǎng)溫度為25±1°C，光照強度為40umol · s—1 · m_2，光照時間為12h/d ；30d后生根率可達96. 9% ；
步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol -S-1 ·πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量百分比為O. 1%ΚΜη04溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質(zhì)中，用1/8MS營養(yǎng)液(1/8MS營養(yǎng)液是指MS培養(yǎng)基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 05mg じ1吲哚こ酸)澆透，之后每隔7d澆灌I次營養(yǎng)液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質(zhì)量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養(yǎng)缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 1°C的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，置于溫室內(nèi)煉苗30d，最后定植到大田，成活率100%?；ㄏ猒4及農(nóng)院-11均是從野外收集的貴州野生毛葡萄優(yōu)良單株，與栽培葡萄品種相比，果粒小，含糖量較低、含酸量較高，但抗病、抗蟲性及抗旱性好，既可作為釀酒葡萄栽培，也可用于砧木利用，更是提高栽培品種抗性的優(yōu)良親本。
權(quán)利要求
1.ー種毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟， 步驟一、無菌系的建立在生長季節(jié)選取生長健壯的毛葡萄新梢作為外植體，用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上，先用體積百分比為70%的酒精漂洗30s，再用無菌水沖洗3次后，用質(zhì)量百分比為O. 1%的升汞溶液浸泡消毒8-lOmin后，用無菌水沖洗5-6次，然后剪除新梢兩端褐化部分后，剪成單芽莖段，接種到MS培養(yǎng)基中，在溫度為25土 1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)誘導(dǎo)至腋芽萌發(fā)，獲得誘導(dǎo)的腋芽葉片； 步驟ニ、不定芽誘導(dǎo)取步驟一中獲得的誘導(dǎo)的腋芽葉片剪成O. 5X0. 5cm2見方的小塊，在葉片背面沿葉脈垂直方向劃三刀，正面向上接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度為25±1°C，光照強度為40umol · S-1 · m_2，光照時間為12h/d的條件下培養(yǎng)20d，葉片開始向上卷起，25-30d劃傷處再生出不定芽，30-45d大量產(chǎn)生再生不定芽； 步驟三、生根培養(yǎng)取步驟ニ中產(chǎn)生的不定芽，將其接種到1/2MS生根培養(yǎng)基中，先光下培養(yǎng)7d，再暗培養(yǎng)7d后，然后轉(zhuǎn)入光下繼續(xù)培養(yǎng)至正常生根，獲得試管苗；培養(yǎng)溫度為25±1°C,光照強度為40umol · s_1 · πΓ2，光照時間為12h/d ； 步驟四、煉苗移栽選取步驟三中生有3-4條根，長為4-5cm的試管苗，在102. Sumol · s—1 · πΓ2的光照條件下煉苗7d，然后從培養(yǎng)瓶中取出試管苗，洗凈試管苗根部培養(yǎng)基，用質(zhì)量百分比為O. 1%ΚΜη04溶液浸根10s，再移栽到滅菌的珍珠巖基質(zhì)中，用1/8MS營養(yǎng)液澆透，之后每隔7d澆灌I次營養(yǎng)液，并從移栽后第2-3d始每隔7d澆灌I次1000倍質(zhì)量百分比為40%的多菌靈溶液，加蓋與營養(yǎng)缽相同大小的塑料杯保持濕度，置于溫度為25土 TC的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至植株長出3-5條新根后移栽到盛有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，置于溫室內(nèi)煉苗30d，最后定植到大田即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟一中采用的MS培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加2. Omg的6-芐基嘌呤，O. 2mg的吲哚こ酸，20 g蔗糖和5g瓊脂粉，其pH值為5. 8-6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟ニ中采用的培養(yǎng)基為國際通用的培養(yǎng)基，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加8. 0-8. 5 mg的6-芐基嘌呤，O. 3-0. 35 mg的吲哚丁酸，O. 20-0. 26 mg的吲哚こ酸，18-32 g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟三中采用的1/2MS培養(yǎng)基是指MS培養(yǎng)基中的大量元素減半，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 08-0. 5g吲哚丁酸，0-0. 14 g吲哚こ酸，20g蔗糖和5g瓊脂粉，pH5. 8-6. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，其特征在于步驟四中采用的1/8MS營養(yǎng)液是指MS培養(yǎng)基中的大量元素為1/8，其它元素不變，并在該MS培養(yǎng)基中每升添加O. 05mg ·じ1卩引哚こ酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毛葡萄離體再生培養(yǎng)方法，包括以下步驟無菌系的建立、不定芽誘導(dǎo)、生根培養(yǎng)及煉苗移栽。本發(fā)明采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)成功實現(xiàn)毛葡萄葉片離體再生，毛葡萄再生率可達37%以上，最高可達93.3%，生根率可達90%以上，成活率可達100%，為毛葡萄遺傳轉(zhuǎn)化奠定堅實基礎(chǔ)，為葡萄其他優(yōu)良性狀向毛葡萄的轉(zhuǎn)移提供了一條有效的途徑。本發(fā)明方法簡單，成本低廉，使用效果好。
文檔編號A01H4/00GK102742507SQ20121027355
公開日2012年10月24日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者劉偉, 張文娥, 潘學(xué)軍, 馬孟增 申請人:貴州大學(xué)