專(zhuān)利名稱(chēng)：一種二氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種植物培養(yǎng)材料的消毒方法，具體說(shuō)涉及ー種利用ニ氧化氯對(duì)劍麻珠芽的外植體材料的消毒方法，屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，植物種苗無(wú)菌培養(yǎng)快繁技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上迅速發(fā)展，植物組織培養(yǎng)外植體材料的消毒滅菌多采用100(T2000mg/L的HgCl2 (升汞)溶液，以及次氯酸鈉、過(guò)氧化氫、酒精、抗生素等，這些殺菌劑處理后很難徹底去除或效果較差，使用操作也較繁瑣，工作效率低。劍麻外植體的傳統(tǒng)消毒方法采用含有Hg2+的消毒剤，對(duì)環(huán)境和人體的毒性較大， 使用程序繁瑣，工作效率低，并且初代培養(yǎng)增殖率低，繼代周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致繁殖速度緩慢，并且因長(zhǎng)時(shí)間繼代増殖而導(dǎo)致繁殖體玻璃化程度顯著增高，再生種苗移栽成活率低，嚴(yán)重阻礙劍麻快繁種苗的產(chǎn)量和質(zhì)量提高。劍麻組培快繁為保證繁殖種苗質(zhì)量而必須在短時(shí)間內(nèi)建立足夠數(shù)量的無(wú)菌繁殖體，因此要消毒較多的珠芽材料，殺菌劑及無(wú)菌水等用量大，成本費(fèi)用高，滅菌操作工作量大。ニ氧化氯是目前國(guó)際上公認(rèn)的的高效、廣譜、快速、安全、無(wú)殘留、不污染環(huán)境的第四代滅菌消毒劑，可殺滅一切微生物，包括細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌芽孢、真菌、分枝桿菌和病毒等，且微生物不會(huì)產(chǎn)生抗藥性。ニ氧化氯對(duì)微生物細(xì)胞壁有較強(qiáng)的吸附穿透能力，可有效地氧化細(xì)胞內(nèi)含巰基的酶，還可快速地抑制微生物的蛋白質(zhì)合成。滅菌效果比一般含氯消毒劑高2. 5倍，而且在殺菌消毒過(guò)程中對(duì)人畜等高等生物無(wú)害，無(wú)致癌、致畸、致突變性，是ー種安全、可靠的高效環(huán)保型殺菌消毒剤。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域ニ氧化氯已廣泛用于禽畜飼養(yǎng)場(chǎng)舍及飲水的消毒、蠶繭養(yǎng)殖器具消毒、魚(yú)蝦疾病防治、池水消毒與增氧、殺滅毛蚶甲肝病毒及磨菇生產(chǎn)滅菌消毒保鮮處理，也有用于葉菜和鮮切花采收后滅菌保鮮儲(chǔ)存處理。但少見(jiàn)有關(guān)ニ氧化氯在植物無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)方面的應(yīng)用。國(guó)內(nèi)2006年首先報(bào)道了 ClO2對(duì)無(wú)籽西瓜種子進(jìn)行表面消毒滅菌用于組培快繁研究，2009年梁鉀賢等報(bào)道了用ClO2對(duì)香蕉以吸芽為材料的外植體進(jìn)行消毒滅菌取得了重大成功，并在香蕉種苗生產(chǎn)中取得了很好的效益。到目前為止，國(guó)內(nèi)外利用ClO2對(duì)劍麻外植體材料進(jìn)行消毒滅菌的研究未見(jiàn)報(bào)道。劍麻s i sal ana Perr. ex Engelm)是一種熱帶多年生硬質(zhì)纖維作物，其纖維色澤潔白，具有質(zhì)地堅(jiān)韌，拉力強(qiáng)，耐磨擦等眾多優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于漁業(yè)、航海、エ礦、運(yùn)輸、油田等行業(yè)，以及用于編織劍麻地毯、劍麻布、過(guò)濾器、エ藝品等。劍麻綜合用途廣，是寶貴的熱作資源。劍麻組培快繁，需要建立以珠芽莖尖分生組織為材料的無(wú)菌外植體，為保證繁殖種苗質(zhì)量，必須建立足夠數(shù)量的無(wú)菌外植體。因此要消毒較多的珠芽材料，殺菌劑及無(wú)菌水等用量大，成本費(fèi)用高，滅菌操作工作量大。劍麻外植體的消毒通常采用1000mg/L的HgCl2溶液浸泡20min，無(wú)菌水沖洗5次，消毒劑的Hg2+對(duì)環(huán)境和人體的毒性較大，使用時(shí)需要做足防護(hù)措施，程序繁瑣，工作效率低，而且初代培養(yǎng)增殖率低，繼代周期較長(zhǎng)。采用ClO2溶液對(duì)植物組織培養(yǎng)外植體材料消毒滅菌具有程序簡(jiǎn)單、環(huán)保無(wú)害、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，為探討應(yīng)用ClO2建立高效、環(huán)保的劍麻外植體的消毒方法，發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)劍麻外植體傳統(tǒng)消毒技木，消毒劑的Hg2+對(duì)環(huán)境和人體的毒性較大，使用時(shí)需要做足防護(hù)措施，程序繁瑣，工作效率低，而且初代培養(yǎng)增殖率低，繼代周期較長(zhǎng)等問(wèn)題，提供ー種具有方法程序簡(jiǎn)單、環(huán)保、高效，腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)快，初代繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)的ニ劍麻外植體材料消毒的方法，該方法采用ニ氧化氯對(duì)劍麻珠芽外植體材料進(jìn)行浸泡消毒。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下方案予以實(shí)現(xiàn)的
一種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，包括如下步驟
(1)劍麻外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片備用；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為500-3000mg/L ；
(3)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的劍麻外植體材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上，裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的活化ニ氧化氯溶液，將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間為20-50min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。ニ氧化氯滅溶液濃度和浸泡消毒時(shí)間組合的確定
采用不同濃度的ニ氧化氯溶液(3000 mg/L、2000 mg/L、1500 mg/LU000 mg/L或500mg/L)對(duì)劍麻珠芽外植體材料浸泡不同時(shí)間(20分鐘、30分鐘、40分鐘或50分鐘)組合消毒，以傳統(tǒng)方法O. IffigCl2消毒液浸泡20分鐘，無(wú)菌水沖洗5次處理做對(duì)照，接種培養(yǎng)后調(diào)查外植體污染率、腋芽萌生率和繁殖體最初三代増殖率作為消毒效果的評(píng)判指標(biāo)。最終試驗(yàn)顯示
1，“濃度-時(shí)間”組合為“1000 mg/L-30分鐘”和“ 1500 mg/L-30分鐘”的效果最好，污染率、腋芽萌生率和繁殖體最初三代増殖率的綜合效果表現(xiàn)最佳。2.劍麻外植體材料浸泡20分鐘至50分鐘的消毒效果都較好，污染率均達(dá)到或超越常用的升汞溶液浸泡消毒技術(shù)水平。3. ニ氧化氯溶液濃度1000-3000mg/L處理的滅菌效果沒(méi)有顯著差異，500mg處理的滅菌效果與常用的升汞溶液浸泡消毒技術(shù)相當(dāng)。4.濃度500mg/L的溶液處理，微生物污染率顯著高于濃度1000_3000mg/L的處理，但與常用的升汞溶液浸泡消毒的微生物污染率沒(méi)有顯著差異，滅菌效果。5.采用濃度500_3000mg/L的ニ氧化氯消毒處理的劍麻外植體，其腋芽萌生率和繁殖體最初三代増殖率，顯著高于常用的升汞消毒處理。6.采用濃度500-3000mg/L的ニ氧化氯消毒處理的劍麻外植體，其腋芽萌生率和繁殖體最初三代増殖率，隨濃度升高和浸泡時(shí)間延長(zhǎng)而有降低的趨勢(shì)，濃度高、浸泡時(shí)間長(zhǎng)，這種趨勢(shì)越明顯。7.采用ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料浸泡消毒，省エ快捷，一次性消毒外植體材料的數(shù)量是常用的升汞消毒方法的數(shù)倍，效率非常高。8.采用ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料浸泡消毒，消毒自行分解成無(wú)毒物質(zhì)，操作無(wú)需采用特別防護(hù)措施，程序簡(jiǎn)單、環(huán)保。本發(fā)明的有益效果是本方法將劍麻外植體材料用ニ氧化氯消毒后浙干直接接種培養(yǎng)，免除了傳統(tǒng)方法O. IffigCl2消毒液處理后必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌水沖洗5次的繁瑣工作，具有方法程序簡(jiǎn)單、環(huán)保無(wú)害、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)采用本方法消毒的外植體，在與傳統(tǒng) 方法消毒的外植體同等培養(yǎng)條件下，具有腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)快，萌生率高，初代繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)有多家企業(yè)生產(chǎn)劍麻組培苗，均是因?yàn)槌醮鷫堉陈实?，増殖繼代時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致玻璃化嚴(yán)重，再生種苗產(chǎn)量低，質(zhì)量差而被東南亞客商拒絕進(jìn)貨，經(jīng)濟(jì)損失巨大。本技術(shù)成果生產(chǎn)的劍麻組培苗受到東南亞客商的稱(chēng)贊。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I
(1)外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為500mg/L ;
(3)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒50min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。實(shí)施例2
(1)外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為1000mg/L;
(4)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒40min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。實(shí)施例3
(I)外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐。(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為1500mg/L ;
(5)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒20min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。實(shí)施例4
(1)外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為2000mg/L ;
(6)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒30min后浙干消毒液，無(wú)菌水沖洗，浙干后進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。實(shí)施例5
(1)外植體材料的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為3000mg/L ;
(7)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒20min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。實(shí)施例6
(O實(shí)施外植體材料消毒的準(zhǔn)備
選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片，保留I. 5cmX2cm大小的頂部生長(zhǎng)錐；
(2)配制ニ氧化氯溶液
按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為1000mg/L;
(8)外植體消毒滅菌
將準(zhǔn)備好的材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的ニ氧化氯溶液將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，浸泡消毒30min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，方法是將每個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.一種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于包括如下步驟(1)劍麻外植體材料的準(zhǔn)備 選擇劍麻的優(yōu)良珠芽經(jīng)培育生長(zhǎng)有6 10片葉的植株，于睛天取回組培工作間，用水沖掉泥土和雜物后，切除根，環(huán)剝除葉片備用；(2)配制ニ氧化氯溶液按照使用量配制活化ニ氧化氯溶液，ニ氧化氯溶液濃度為500-3000mg/L ；(3)外植體消毒滅菌 將準(zhǔn)備好的劍麻外植體材料移至啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上，裝入無(wú)菌容器中，注入新配制的活化ニ氧化氯溶液，將材料浸沒(méi)，期間更換ニ氧化氯溶液一次，對(duì)材料進(jìn)行多次攪拌，ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間為20-50min后浙干消毒液，直接進(jìn)行外植體接種，將每 個(gè)材料縱切為4塊，接種到劍麻誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基中，然后移至培養(yǎng)室按照劍麻的組培快繁技術(shù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液濃度為500-1000mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液濃度為1000-1500mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液濃度為1500-2000mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液濃度為2000-2500mg/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液濃度為2500-3000mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間30min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間40min。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種ニ氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，其特征在于所述的ニ氧化氯溶液浸泡消毒時(shí)間50min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種二氧化氯對(duì)劍麻外植體材料消毒的方法，該方法以處置好的劍麻珠芽的外植體材料，用1000-3000mg/L的二氧化氯溶液浸泡消毒20-50分鐘，在啟動(dòng)工作狀態(tài)的潔凈工作臺(tái)上瀝干消毒液，然后將每一個(gè)珠芽材料平均分切成四塊，接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)；本方法采用適宜濃度的二氧化氯溶液對(duì)來(lái)源于劍麻珠芽的外植體材料進(jìn)行浸泡處理消毒，瀝干消毒液后直接接種培養(yǎng)，免除了傳統(tǒng)方法0.1%HgCl2消毒液處理后必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌水沖洗5次的繁瑣工作，具有方法程序簡(jiǎn)單、環(huán)保無(wú)害、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)采用本方法消毒的外植體，在與傳統(tǒng)方法消毒的外植體同等培養(yǎng)條件下，具有腋芽萌動(dòng)生長(zhǎng)快，初代繁殖系數(shù)高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102742506SQ20121027296
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者劉偉清, 揭進(jìn), 梁鉀賢 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)