專利名稱：中華鱉偽雌鱉及全雄中華鱉的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)屬于水產(chǎn)動物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及中華鱉偽雌鱉(即基因型為雄性表型為雌性)的誘導(dǎo)方法和全雄中華鱉的培育方法，應(yīng)用于鱉類性別控制和全雄苗種培育。
背景技術(shù)：
中華鳘(Trionyx sinensis)其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富、滋補力強,是我國名特水產(chǎn)養(yǎng)殖動物之一。目前中華鱉養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，形成了規(guī)模較大、影響力較強的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)。不同性別和個體間存在著明顯的生長差異，雄性中華鱉生長顯著快于雌性，其日增重率為雌性中華鱉的I. 09倍，因此全雄繁育技術(shù)是鱉產(chǎn)業(yè)需要解決的難題。目前，有關(guān)中華鱉性別分化的研究主要集中在環(huán)境因素的作用(聶劉旺等，2001 ;Ji et al. ,2003)以及性腺 發(fā)育和內(nèi)分泌的研究(Lofts B. and Tsui H. W.，1997 ;朱道玉，2009)等。中華鱉在不同季節(jié)的由腦垂體與性腺共同調(diào)節(jié)性腺和附睪性腺功能(Tsui et al.，1977)。在中華鱉性腺自受精卵孵化至性成熟階段中，胚胎發(fā)育至第5天形成生殖嵴；第16天原始生殖細胞開始分化，至第24-26天性腺分化結(jié)束形成精巢或卵巢(朱道玉，2009)。章龍珍等(1998)通過溫室養(yǎng)殖對中華鱉性腺發(fā)育的影響研究發(fā)現(xiàn)，溫室養(yǎng)殖可以使加快中華鱉性腺成熟，雌性性成熟只需21個月，雄性需10個月。在性別分化方面Ji et al. (2003)等的研究顯示，中華鱉孵化溫度由24°C升高到34°C，雄鱉的比例沒有顯著差異，表明中華鱉性別決定機制中存在GSD型。孵化溫度由22°C升至35°C，雄性中華鱉的孵化比例由27. 27%提高到67. 57%,在一定范圍內(nèi)，溫度升高會提高雄性中華鱉孵出的比例(巫旗生等，2011),與聶劉旺的研究結(jié)果類似。葉玉珍等(1999)通過甲基睪丸素對中華鱉外部性征誘導(dǎo)作用的研究發(fā)現(xiàn)，夕卜源雄性激素對稚鱉的外部性征及行為有較大的誘導(dǎo)作用。2007年，Kawai et al.通過基因組雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)中華鱉中存在ZZ/ZW型微小性別染色體。因此，迄今為止，通過溫度的環(huán)境因素和雌性激素誘導(dǎo)因素來控制中華鱉的性別，國內(nèi)外尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是通過研究孵化溫度和17 β_雌二醇對中華鱉進行性別控制，得出影響中華鱉高雌性率的孵化溫度條件和17 β -雌二醇的投喂誘導(dǎo)濃度，建立誘導(dǎo)中華鱉性逆轉(zhuǎn)的技術(shù)方法，用于中華鱉性別控制和全雄中華鱉培育。本發(fā)明的技術(shù)方案如下中華鱉偽雌鱉的培育方法，包括受精卵的孵化和稚鱉誘導(dǎo)，受精卵的孵化溫度為250C，剛孵化出的稚鱉用17 β -雌二醇進行投喂誘導(dǎo)而得到中華鱉偽雌鱉，17 β -雌二醇投喂?jié)舛葹?5mg/kg飼料(每公斤飼料中拌45mg的17 β -雌二醇),誘導(dǎo)時間為30天。所述的中華鱉偽雌鱉培育方法，對稚鱉用17 β -雌二醇按照45mg/kg飼料的濃度進行藥物誘導(dǎo)30天。全雄中華鱉的培育方法，根據(jù)上述方法培育獲得的中華鱉偽雌鱉，再和表型、基因型均為雄性的中華鱉交配受精、人工采卵孵化，最終獲得的后代為全雄中華鱉。本發(fā)明創(chuàng)新之處在于結(jié)合了兩種影響中華鱉性別發(fā)育的外界因素，在不同階段對中華鱉進行性別控制或誘導(dǎo)，來提高基因型為雄性表型為雌性的偽雌中華鱉數(shù)量；并通過偽雌鱉與表型和基因型均為雄性的真雄鱉交配來得到全雄中華鱉后代。溫控階段本實驗設(shè)置六個孵化溫度，分別是22°C、25°C、28°C、30°C、32°C、35°C，每個指標(biāo)設(shè)一個重復(fù)，每組100枚，設(shè)置一對照組，在孵化室內(nèi)常溫孵化。所有卵均為同一晚產(chǎn)出，均重為5. I克，受精率92%。孵化基質(zhì)沙粒經(jīng)陽光暴曬5小時，實驗組放恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)孵化，孵化期間每天噴灑與砂溫度相近的水。孵化箱的相對濕度保持在85%左右，溫度由恒溫箱控制不變直至出殼。由于性別分化主要是在孵化前期進行，孵化后期最宜在正常溫度下進行，以利于稚鱉出殼生長，判斷出甲魚改變性別的關(guān)鍵時期。因此，根據(jù)中華鱉卵 的孵化積溫值，25天后對在35°C、32°C、30°C、28°C下的卵移出恒溫箱至孵化室進行孵化出殼。50天后對在25°C、22°C下的卵移出恒溫箱至孵化室進行孵化出殼。藥物誘導(dǎo)階段對25°C -35°c孵化出來的稚鱉用17β-雌二醇進行誘導(dǎo)，將17 β -雌二醇分別以30mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、65mg/kg濃度的添加量到飼料中進行投喂誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)30天。其余的養(yǎng)殖條件與稚鱉的正常培養(yǎng)方法一致。本發(fā)明具有以下有益效果I、采用本發(fā)明的方法，可以得到較大數(shù)量的雌性中華鱉，為培育全雄中華鱉提供足夠數(shù)量的親本群。2、采用本發(fā)明的方法，可以獲得全雄中華鱉后代，免去了人工進行篩選所花費的時間和勞動力成本。3、本發(fā)明的方法給出了溫度和藥物對中華鱉性別分化及影響的關(guān)系，為進一步研究中華鱉性別分化機制及采用生物技術(shù)方法進行性別控制奠定基礎(chǔ)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例一一、受精卵采集I、所有孵化用具都應(yīng)進行消毒處理或暴曬殺菌；2、在集卵箱中放一層比較干的細沙；3、對人工產(chǎn)卵沙池全面翻砂采集，采集完后整理好沙池，以便親鱉下次產(chǎn)卵；4、采集的鱉卵需在沙內(nèi)暫放2-3天時間，以便在正式孵化前清除未受精卵；二、受精卵的鑒別經(jīng)過暫放2-3天的鱉卵，已經(jīng)明顯分化出動植物極，分界清晰，卵殼光亮，白色的動物極占據(jù)鱉卵的大部分，到達卵殼中線稍偏下位置的為受精卵，否則為非受精卵。三、受精卵孵化方式“地層式”，孵化室內(nèi)首先在地下鋪一層厚黃土并壓緊，擺受精卵前應(yīng)放一層3厘米的干細沙，(黃土和沙都應(yīng)消毒或暴曬處理)。孵化箱內(nèi)孵化操作類似于孵化室，即在箱底鋪層細沙。擺放時應(yīng)動物極朝上，兩層為宜。四、孵化期間管理
I、溫度的控制，將中華鱉卵埋在裝滿細沙的塑料盆中，分別放置于溫度為22°C、25 V、28°C、32 V和35°C的恒溫孵化箱中孵化；采用在恒溫孵化箱內(nèi)灑水和在孵化盆的細沙表面噴水的方法來維持孵化濕度，使其相對濕度保持約85%。先干后濕，前20天只需保持少許的濕度，出苗期間無需噴水；2、每天需保證孵化箱內(nèi)(早、中、晚各一次)通風(fēng)換氣，以便卵的呼吸；3、觀察孵化期間卵殼顏色的變化淡黃色-出現(xiàn)白色區(qū)-白色區(qū)擴大至中線偏下-暗黃色-淡紫紅-紫紅-烏黑色-乳白色，此時胚胎發(fā)育完成，稚鱉即將出殼。五、出殼后管理 稚鱉剛出殼時十分幼嫩，不宜立即入池，應(yīng)放在光滑的陶瓷或塑料盆中用清水暫養(yǎng)(一個直徑40厘米的盆可暫養(yǎng)稚鱉20只左右)，經(jīng)常換水，及時清除脫落的臍帶，12 24小時后，待稚鱉臍帶完全脫落、收縮后，再放入暫養(yǎng)池或稚鱉池養(yǎng)殖；入池前應(yīng)剔除臍帶未收好、質(zhì)量差的稚鱉；這個階段無需投食。六、稚鱉放養(yǎng)I、放養(yǎng)前鱉體消毒用2%食鹽水浸泡稚鱉10分鐘，或15 20克/米3高錳酸鉀溶液浸洗消毒15 20分鐘，或聚維酮碘30克/米3，浸洗15分鐘；2、放養(yǎng)時的注意事項鱉苗轉(zhuǎn)運時每箱不要裝得太多，以免相互擠壓，過度撕咬、抓傷(每箱放適量切碎的水葫蘆可減輕鱉苗間的撕咬、抓傷)；放養(yǎng)時沿池塘四周均勻投放，切不可只集中投放在幾處，因為鱉苗體質(zhì)弱，活動能力差，往往不會自行分散游走；3、放養(yǎng)后3小時內(nèi)全塘均勻潑灑硫醚沙星O. 6mg/L或聚維酮碘I. 5mg/L,以促進鱉苗體表創(chuàng)傷的愈合，防止繼發(fā)性感染白斑病；第二天再用同樣劑量重復(fù)一次，下塘后一周內(nèi)很關(guān)鍵，決不可用刺激性大的漂白粉、強氯精等藥物，因為這類藥物在殺菌的同時，也可殺滅塘中的藻類；七、放養(yǎng)后的日常管理I、在飼料中添加魚肝油、VE、VC、復(fù)合維生素B，增強鱉苗的體質(zhì)，以促進鱉苗對真菌的抵抗力；魚肝油、VE、VC、復(fù)合維生素B可長期添加；2、抗菌藥物的添加在飼料中添加適量抗菌藥物(如強力霉素、諾氟沙星、氟苯尼考等)在放養(yǎng)后投喂5天，以避免因放養(yǎng)操作時鱉苗體表損傷而引起的感染，同時促進體表創(chuàng)傷的愈合；3、水質(zhì)的管理放養(yǎng)后一個月內(nèi)以保水為主，不要出水；隨著吃料的增多，塘水逐漸變肥，可根據(jù)各塘的具體情況，適當(dāng)排水。在養(yǎng)殖過程中保持優(yōu)良的水質(zhì)，保持PH值7. 5 8. 5,氨態(tài)氮< lmg/L,透明度15 25cm, C0D30mg/L左右,嚴(yán)格調(diào)控水質(zhì),避免水質(zhì)惡化；4、巡塘早晚巡塘，觀察水溫、水質(zhì)及鱉苗的活動、爬板情況，一旦發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及早采取措施；5、投料管理糜狀飼料拉成細條狀離水面Icm左右均勻投放在飼料板上。仔細觀察鱉苗的吃料情況，及時調(diào)整投餌量，做到定時、定量、定質(zhì)、定點投喂，剩餌收撿干凈，以防敗壞水質(zhì)；每隔3天用20mg/L漂白粉消毒一次，殺滅飼料板上的青苔、鐘形蟲及病原體。八、藥物誘導(dǎo)稚鳘開口后，就開始進行藥物誘導(dǎo)，分別以30mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、65mg/kg濃度的添加量到飼料中進行誘導(dǎo)，分別誘導(dǎo)30天，將稚鱉飼養(yǎng)到個體性別特征較明顯時，進行性別的鑒定。雌鱉尾部較短，不能自然伸出裙邊外或外露很少，體型圓，體高，背甲呈卵圓形，前后基本一致，腹部中間的軟甲，十字形后肢間距較寬；雄鱉尾部較長，能自然伸出裙邊外，體型稍長，體高隆起而薄，背甲呈長卵圓形，后部較寬，腹部中間的軟甲，曲玉形，后肢間距較寬較窄。幼鱉階段數(shù)據(jù)統(tǒng)計得出，在孵化期恒溫25°C，稚鱉期45mg/kg雌性激素進行30天誘導(dǎo)的雌雄比例為144 36，為雌鱉產(chǎn)出最多，而對照組的雌雄比例為81 84。并比以往單獨因素誘導(dǎo)性別轉(zhuǎn)化的效率要高。親鱉培育與全雄后代繁殖對孵化期恒溫25°C，稚鱉期45mg/kg雌性激素進行30天誘導(dǎo)的雌性中華鱉(中華鱉真?zhèn)未启~)進行標(biāo)記培育，性成熟后與表型和基因型為雄性 的中華鱉進行交配，發(fā)現(xiàn)有62只表型為雌性的中華鱉與表型和基因型為雄性中華鱉的后代為全雄個體。具體數(shù)據(jù)通過分析如下，將144只雌性中華鱉進行編號(01-144)，分別飼養(yǎng)，并以I : 7的雌性比例進行繁殖，觀察子代表觀特征可以得出共有62只雌性中華鱉的后代為全雄中華鱉.其余82只雌性中華鱉的后代雌雄比例接近I : I。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.中華鱉偽雌鱉的培育方法，其特征在于，包括受精卵的孵化和稚鱉誘導(dǎo)，受精卵的孵化溫度為25°c，剛孵化出的稚鱉用17 β-雌二醇進行投喂誘導(dǎo)而得到中華鱉偽雌鱉，17 β -雌二醇濃度為45mg/kg飼料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的中華鱉偽雌鱉培育方法，其特征在于對稚鱉用17β-雌二醇按照45mg/kg飼料的濃度進行藥物誘導(dǎo)30天。
3.全雄中華鱉的培育方法，根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法培育獲得中華鱉偽雌鱉，再和表型、基因型均為雄性的中華鱉交配受精、人工采卵孵化，最終獲得后代為全雄中華瞥。
全文摘要
本發(fā)明公開了中華鱉偽雌鱉及全雄中華鱉的培育方法，屬于水產(chǎn)動物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。中華鱉偽雌鱉的培育方法，包括受精卵的孵化和稚鱉誘導(dǎo)，受精卵的孵化溫度為25℃，剛孵化出的稚鱉用17β-雌二醇進行投喂誘導(dǎo)而得到中華鱉偽雌鱉，17β-雌二醇濃度為45mg/kg飼料。全雄中華鱉是由中華鱉偽雌鱉與表型和基因型均為雄性的中華鱉交配后獲得。采用本發(fā)明的方法，可以得到較大數(shù)量的偽雌中華鱉，為培育全雄中華鱉提供足夠數(shù)量的親本群。采用本發(fā)明的方法，可以獲得全雄中華鱉后代，免去了人工進行篩選所花費的時間和勞動力成本。
文檔編號A23K1/165GK102763625SQ20121027259
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月28日
發(fā)明者夏建海, 戴振炎, 熊鋼, 王曉清, 馬曉 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)