專利名稱：赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種赤霉素的生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法。
背景技術(shù)：
赤霉素(俗稱920)屬于植物五大激素之一，是一種高效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。目前工業(yè)化赤霉素的生產(chǎn)仍采用微生物發(fā)酵的方法，其菌種是生產(chǎn)工藝流程中首要關(guān)鍵的工序。 自然赤霉菌株多數(shù)是孢子型菌絲，由于孢子型菌絲產(chǎn)生小孢子，難過(guò)濾，不利于赤霉素的提取，故不宜直接用作生產(chǎn)菌株，須通過(guò)理化手段，迫使其孢子型菌株轉(zhuǎn)變?yōu)榫z型菌株，才能用于工業(yè)生產(chǎn)。由于赤霉菌絲是有隔的多核體，它正象細(xì)胞內(nèi)含有幾個(gè)核一樣，如果直接以菌絲進(jìn)行誘變育種，誘變劑只能引起其中的某個(gè)核發(fā)生變異，其它幾個(gè)核不變，仍為野生型狀態(tài)，這樣的突變株必然會(huì)在其繁殖過(guò)程中發(fā)生遺傳分離，造成混雜群體和不穩(wěn)定現(xiàn)象而拋棄，難以取得預(yù)期效果。即使得到的變種，第一代發(fā)酵效價(jià)高于出發(fā)菌株，但經(jīng)過(guò)幾次傳代移種后，必然又恢復(fù)到原水平，表現(xiàn)為高產(chǎn)性狀不穩(wěn)定。針對(duì)赤霉素工業(yè)生產(chǎn)菌株為不產(chǎn)孢子、是多核菌絲體的特性，將赤霉素菌絲體經(jīng)酶解破壁，使其成為單一游離的原生質(zhì)體，是進(jìn)行赤霉素理化誘變育種前首要而關(guān)鍵的一步。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上面所述缺陷，提供一種能大大提高原生質(zhì)體的釋放量，并且其再生活性明顯增強(qiáng)的赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，包括如下步驟。(1)、幼嫩菌絲體的制取將出發(fā)菌株接種于含有斜面培養(yǎng)基的試管內(nèi)恒溫培養(yǎng)后，從新鮮斜面上挑取菌絲體，放入無(wú)菌的含有石英砂、玻璃珠、生理鹽水的三角瓶中，搖床振蕩10-20分鐘，得到菌絲斷片懸浮液，用無(wú)菌吸管吸取菌絲斷片懸浮液點(diǎn)種平鋪于菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板上的微孔濾膜紙表面，每個(gè)平板點(diǎn)種0. 5-1. 5mL，經(jīng)25-35°C培養(yǎng)1_2天可見(jiàn)薄層白色菌絲時(shí)，供下一步制取原生質(zhì)體用。(2)、原生質(zhì)體的制備將長(zhǎng)有幼嫩菌絲體的微孔濾膜紙輕輕揭下，在復(fù)合破壁酶液中將幼嫩菌絲體漂洗下來(lái)，置25-35°C進(jìn)行酶解，在酶解過(guò)程中，應(yīng)間歇搖動(dòng)使酶解充分， 菌絲及原生質(zhì)體混合物經(jīng)1200-1700rpm離心5-15分鐘，沉淀除去殘留酶液，再用高滲溶液洗滌二次，用漏斗過(guò)濾除去菌絲斷片，以供原生質(zhì)體的理化誘變處理。(3)、原生質(zhì)體的處理。(4)、原生質(zhì)體的定向再生將誘變處理后的原生質(zhì)體，用高滲溶液稀釋 100-10000倍后，涂布于耐性再生培養(yǎng)基平板上，于25-35°C恒溫培養(yǎng)6_10天，使耐性突變型菌株得到再生。步驟(1)中所述出發(fā)菌株為藤倉(cāng)赤霉菌4303-N菌株，所述斜面培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖 0. 8-1. 2%, KNO3 0. 1-0. 5%, K2HPO4 0. 03-0. 07%, MgSO4 0. 03-0. 07%,瓊脂1.5- ，余量為水。步驟(1)中所述玻璃珠的直徑為5-7mm，生理鹽水的濃度為0. 7-0. 9%。步驟(1)中所述菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為甘氨酸1_3%，糊精2-4%， 蔗糖 1-3%，NH4Ac 0. 2-0. 6%, KH2PO4 0. 08-0. 12%, MgSO4 0. 03-0. 07%,瓊脂 1. 5-2%,余量為水。步驟(2)中所述復(fù)合破壁酶液的制備方法是將重量百分?jǐn)?shù)為纖維素酶1_3%，蝸牛酶0. 5-1. 5%，果膠酶0. 2-0. 5%進(jìn)行配比，依次稱取并用無(wú)菌高滲溶液溶解，用孔徑0. 2微米的微孔濾膜進(jìn)行真空抽濾除菌，加水補(bǔ)足100%即得無(wú)菌復(fù)合破壁酶液。步驟(3)所述原生質(zhì)體懸浮液置于無(wú)菌平皿內(nèi)，置于已預(yù)熱30分鐘的UV燈直下 20-40cm處，開(kāi)蓋振蕩照射60-120秒。步驟(3)所述的原生質(zhì)體的處理還可為將原生質(zhì)體懸浮液，用20-40 μ g/mg NTG 處理20-40min，以大量稀釋法終止反應(yīng)。步驟(3)所述的原生質(zhì)體的處理均需在避光條件下進(jìn)行。步驟(4)所述耐性再生培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為蔗糖1_3%，聚胨0. 1-0. 5%， 葡萄糖 0. 3-0. 7%,酵母膏 0. 1-0. 3%, FeS047H20 0. 001-0. 002%, KNO3 0. 05-0. 15%, KH2PO4 0. 03-0. 07%, MgSO4 0. 03-0. 07%, NaCl 3. 5-4. 1%,瓊脂 1. 5-2%,耐性物質(zhì) 0. 001-0. 01%,余量為水。所述高滲溶液為0. 6-0. 8MNaCl溶液。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過(guò)微孔濾膜作點(diǎn)種培養(yǎng)載體，得到的菌絲體比較干凈，無(wú)需洗滌，可直接酶解，大大簡(jiǎn)化了操作步驟；在含甘氨酸的菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基固體平板上，培養(yǎng)取得幼嫩菌絲體，培養(yǎng)出的菌絲體能使破壁酶類易于滲入和瓦解細(xì)胞壁，釋放出的原生質(zhì)體數(shù)量較多；在原生質(zhì)體純化過(guò)程中采用先慢速離心沉淀、后用高滲溶液洗滌處理，可使無(wú)壁嬌嫩易碎的原生質(zhì)體依附菌絲斷片作緩沖載體一起沉淀，便于洗滌純化收集原生質(zhì)體，保護(hù)原生質(zhì)體的完整性，提高原生質(zhì)體再生率。另外對(duì)復(fù)合破壁酶液組分配比、 酶解時(shí)間、原生質(zhì)體再生工藝等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化調(diào)整，使原生質(zhì)體的釋放量從IO5升至106， 并且其再生活性有了明顯的增強(qiáng)，再生率可達(dá)16%以上。原生質(zhì)體制備工藝的完善與成熟， 確保了基因突變后的遺傳個(gè)體絕大部分都是純合體，避免了高產(chǎn)性狀經(jīng)傳代后水平回復(fù)的現(xiàn)象，為其理化誘變育種創(chuàng)造了良好的條件。


圖1為幼嫩菌絲體顯微照片(IOX 10倍)。圖2為酶解2小時(shí)顯微照片(10X40倍)。圖3為酶解3小時(shí)顯微照片(10 X 40倍)。圖4為酶解4小時(shí)顯微照片(10 X 40倍)。圖5為純化后原生質(zhì)體顯微照片(10 X 40倍)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
(1).材料與方法。(1.1)材料。(1. 1. 1)出發(fā)菌株藤倉(cāng)赤霉菌4303-N菌株。(1.1.2)高滲溶液0. 7MNaCl 溶液。(1. 1.3)酶液與試劑。纖維素酶(cellulose)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，每mg酶使25mg細(xì)胞壁破碎
彡 90%ο蝸牛酶(snailase)上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司生產(chǎn)，酶活性彡10000u/g。果膠酶上海耕奔生物技術(shù)有限公司，酶活力> 20000u/g。溶菌酶酶活力彡20000u/mgo其余試劑均為BR、CP或AR級(jí)。(1.1. 4)培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基(MM)葡萄糖1 %、KNO3 0.3%, K2HPO4 0.05 %, MgSO4 0.05%、瓊月旨 1. 5-2%，余量為水。菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MGM)甘氨酸2%、糊精2.5%、蔗糖2%、NH4Ac 0.45%, KH2PO4 0. 1%, MgSO4 0. 05%、瓊脂 1. 5-2%，余量為水。再生培養(yǎng)基(RM):蔗糖2%、聚胨0.3%、葡萄糖0.5%、酵母膏0.2%、FeS047H20 0. 001%、KNO3 0. 1 %, KH2PO4 0. 05%, MgSO4 0. 05%, NaCl 3. 5 — 4. 1%、瓊月旨 1. 5_2%，余量為水。耐性再生培養(yǎng)基(RRM)在RM培養(yǎng)基中添加耐性物質(zhì)。(1. 1. 5)儀器與用具旋轉(zhuǎn)式搖床、生物顯微鏡、800型離心沉淀器、G2漏斗、血球計(jì)數(shù)板、微孔濾膜(孔徑0. 45um和0. 2um)、不銹鋼負(fù)壓濾器、抽濾瓶、0. 85%生理鹽水、石英砂、Φ5-7πιπι玻璃珠、培養(yǎng)皿、吸管、接種鏟、玻璃扒子、不銹鋼鑷子等。(1.2)方法。(1. 2. 1)幼嫩菌絲體的制取從新鮮斜面上挑取少量菌絲體，放入無(wú)菌的含有石英砂、玻璃珠、生理鹽水的三角瓶中，搖床振蕩10-20分鐘，得到菌絲斷片懸浮液，用ImL無(wú)菌吸管吸取菌絲斷片懸浮液點(diǎn)種在平鋪于MGM平板上的濾膜紙表面，每個(gè)平板點(diǎn)種ImL (約 50 - 80滴)，經(jīng)培養(yǎng)1-2天可見(jiàn)薄層白色菌絲時(shí)，供下一步制取原生質(zhì)體用。(1.2.2)無(wú)菌復(fù)合破壁酶液的制備按照纖維素酶2%、蝸牛酶1%、果膠酶0. 4%的配比，依次稱取并用無(wú)菌高滲溶液溶解，用孔徑0. 2um微孔濾膜進(jìn)行真空抽濾除菌，即得無(wú)菌復(fù)合破壁酶液，供原生質(zhì)體制備用。(1. 2. 3)原生質(zhì)體的制備將長(zhǎng)有幼嫩菌絲體的微孔濾膜紙輕輕揭下，在復(fù)合破壁酶液中將幼嫩菌絲體漂洗下來(lái)，置進(jìn)行酶解，在酶解過(guò)程中，應(yīng)間歇搖動(dòng)使酶解充分，并定時(shí)取樣，在生物顯微鏡下進(jìn)行原生質(zhì)體形成的觀察、計(jì)數(shù)。菌絲及原生質(zhì)體混合物經(jīng)1500rpm離心10分鐘，沉淀除去殘留酶液，再用高滲溶液洗滌二次，用G2漏斗過(guò)濾除去菌絲斷片，以供原生質(zhì)體的理化誘變處理。(1.2. 4)原生質(zhì)體的UV或NTG處理將上述原生質(zhì)體懸浮液約5mL于無(wú)菌平皿內(nèi)， 置于已預(yù)熱30分鐘的UV燈直下30cm處，開(kāi)蓋振蕩照射100秒鐘左右；或?qū)⑸鲜鲈|(zhì)體懸浮液，用25 48/1^附6分別處理301^11，以大量稀釋法終止反應(yīng)。上述處理均要在避光條件下進(jìn)行。(1. 2. 5)原生質(zhì)體的定向再生將誘變處理后的原生質(zhì)體，用高滲溶液作適當(dāng)稀釋后，分別涂布于RM平板上(作存活率測(cè)定)和RRM平板上，于恒溫培養(yǎng)6 — 10天。使耐性突變型菌株得到再生。同時(shí)取兩份未經(jīng)誘變處理的原生質(zhì)體懸浮液，一份用高滲溶液稀釋后，涂布于RM平板上作存活率對(duì)照測(cè)定；另一份用無(wú)菌水稀釋以休克原生質(zhì)體，涂布于RM平板上作再生率對(duì)照測(cè)定。待耐性再生培養(yǎng)平板上長(zhǎng)出耐性單菌落后，分別接種于 MM斜面試管上，繼續(xù)培養(yǎng)3 — 4天，放4°C冰箱保存待篩選。
高滲液稀釋生長(zhǎng)的菌落數(shù)一無(wú)菌水稀釋生長(zhǎng)的菌落數(shù)再生率( )=- 。
在血球計(jì)數(shù)板上原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)(2).結(jié)果與討論。(2. 1)菌絲狀態(tài)的選擇。菌絲的狀態(tài)是影響原生質(zhì)體釋放的重要因素，取得幼嫩而易于酶解的菌絲體是成功的前提，幼嫩菌絲細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)均勻。用微孔濾膜平板法易于控制菌齡，只要看到微孔濾膜上有白色薄層菌絲體出現(xiàn)時(shí)即可用于酶解，生長(zhǎng)在微孔濾膜上的菌絲體不混雜有多余的培養(yǎng)基成份，因此得到的菌絲體比較干凈，不必經(jīng)洗滌，可直接酶解，簡(jiǎn)化了操作步驟。(2. 2)菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇。A)MM 培養(yǎng)基葡萄糖 1 %、KNO3 0. 3 K2HPO4 0. 05 MgSO4 0. 05%、瓊脂 1. 5% -2%，余量為水。B) PDA培養(yǎng)基去皮土豆200g切成小塊，加水IOOOmL煮沸30’，過(guò)濾得濾液補(bǔ)足 lOOOmL，加葡萄糖20g、瓊脂15_20g，溶化后分裝滅菌倒平板，余量為水。C)MCM 培養(yǎng)基蔗糖 1.5%、甘氨酸 1·0%、ΚΗ2Ρ04 0.2 %、MgS04 0 . 05 %, NaCl 0. 3%、瓊脂1. 5-2%，余量為水。D)MGM 培養(yǎng)基甘氨酸 2%、糊精 2. 5%、蔗糖 2%、NH4Ac 0. 45%, KH2PO4 0.1%、 MgSO4 0. 05%、瓊脂 1. 5%—2%，余量為水。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)證明A、B培養(yǎng)基盡管菌絲體生長(zhǎng)豐滿，但破壁酶解較困難，釋放出原生質(zhì)體數(shù)量較少。而C、D培養(yǎng)基因加入了甘氨酸，培養(yǎng)出來(lái)的菌絲體能使酶類易于滲入和瓦解細(xì)胞壁，釋放出的原生質(zhì)體數(shù)量較多。選擇了 D培養(yǎng)基(MGM)作為菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，并制作成固體平板。(2. 3)酶液的選擇。由于酶的專一性，采用幾種不同酶液來(lái)制備原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)混合的復(fù)合破壁酶比單獨(dú)使用效果較好(見(jiàn)表1)。表1 幾種酶液對(duì)赤霉菌原生質(zhì)體形成的影響。
權(quán)利要求
1.一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，包括如下步驟(1)、幼嫩菌絲體的制取將出發(fā)菌株接種于含有斜面培養(yǎng)基的試管內(nèi)恒溫培養(yǎng)后，從新鮮斜面上挑取菌絲體，放入無(wú)菌的含有石英砂、玻璃珠、生理鹽水的三角瓶中，搖床振蕩 10-20分鐘，得到菌絲斷片懸浮液，用無(wú)菌吸管吸取菌絲斷片懸浮液點(diǎn)種平鋪于菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基平板上的微孔濾膜紙表面，每個(gè)平板點(diǎn)種0. 5-1. 5mL，經(jīng)25-35°C培養(yǎng)1_2天可見(jiàn)薄層白色菌絲時(shí)，供下一步制取原生質(zhì)體用；(2)、原生質(zhì)體的制備將長(zhǎng)有幼嫩菌絲體的微孔濾膜紙輕輕揭下，在復(fù)合破壁酶液中將幼嫩菌絲體漂洗下來(lái)，置25-35°C進(jìn)行酶解，在酶解過(guò)程中，應(yīng)間歇搖動(dòng)使酶解充分，菌絲及原生質(zhì)體混合物經(jīng)1200-1700rpm離心5-15分鐘，沉淀除去殘留酶液，再用高滲溶液洗滌二次，用漏斗過(guò)濾除去菌絲斷片，以供原生質(zhì)體的理化誘變處理；(3)、原生質(zhì)體的處理；(4)、原生質(zhì)體的定向再生將誘變處理后的原生質(zhì)體，用高滲溶液稀釋100-10000倍后，涂布于耐性再生培養(yǎng)基平板上，于25-35°C恒溫培養(yǎng)6-10天，使耐性突變型菌株得到再生。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(1)中所述出發(fā)菌株為藤倉(cāng)赤霉菌4303-N菌株，所述斜面培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為葡萄糖 0. 8-1. 2%, KNO3 0. 1-0. 5%, K2HPO4 0. 03-0. 07%, MgSO4 0. 03-0. 07%,瓊脂 1. 5-2%，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(1)中所述玻璃珠的直徑為5-7mm，生理鹽水的濃度為0. 7-0. 9%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(1)中所述菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為甘氨酸1_3%，糊精2-4%，蔗糖 1-3%, NH4Ac 0. 2-0. 6%, KH2PO4 0. 08-0. 12%, MgSO4 0. 03-0. 07%,瓊脂 1. 5_2%，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(2)中所述復(fù)合破壁酶液的制備方法是將重量百分?jǐn)?shù)為纖維素酶1_3%，蝸牛酶 0. 5-1. 5%，果膠酶0. 2-0. 5%進(jìn)行配比，依次稱取并用無(wú)菌高滲溶液溶解，用孔徑0. 2微米的微孔濾膜進(jìn)行真空抽濾除菌，加水補(bǔ)足100%即得無(wú)菌復(fù)合破壁酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(3)所述的原生質(zhì)體的處理為將原生質(zhì)體懸浮液，用20-40 μ g/mg NTG處理 20-40min,以大量稀釋法終止反應(yīng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(3)所述的原生質(zhì)體的處理為將原生質(zhì)體懸浮液置于無(wú)菌平皿內(nèi)，置于已預(yù)熱30 分鐘的UV燈直下20-40cm處，開(kāi)蓋振蕩照射60-120秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或6或7所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(3)所述的原生質(zhì)體的處理需在避光條件下進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于步驟(4)所述再生培養(yǎng)基的配方的重量百分?jǐn)?shù)為蔗糖1_3%，聚胨0. 1-0. 5%，葡萄糖 0. 3-0. 7%,酵母膏 0. 1-0. 3%, FeS047H20 0. 001-0. 002%, KNO3 0. 05-0. 15%, KH2PO4 0. 03-0. 07%, MgSO4 0. 03-0. 07%, NaCl 3. 5-4. 1%,瓊脂 1. 5-2%,耐性物質(zhì) 0. 001-0. 01%,余量為水。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的一種赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，其特征在于所述高滲溶液為0. 6-0. 8MNaCl溶液。
全文摘要
赤霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生方法，涉及赤霉素的生物學(xué)領(lǐng)域。包括如下步驟幼嫩菌絲體的制??；原生質(zhì)體的制備；原生質(zhì)體的處理；原生質(zhì)體的定向再生。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明通過(guò)微孔濾膜作點(diǎn)種培養(yǎng)載體，得到的菌絲體比較干凈，無(wú)需洗滌，可直接酶解，大大簡(jiǎn)化了操作步驟；在含甘氨酸的菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基固體平板上，培養(yǎng)取得幼嫩菌絲體，培養(yǎng)出的菌絲體能使破壁酶類易于滲入和瓦解細(xì)胞壁，釋放出的原生質(zhì)體數(shù)量較多，使原生質(zhì)體的釋放量從105升至106，并且其再生活性有了明顯的增強(qiáng)，再生率可達(dá)16%以上。
文檔編號(hào)C12N13/00GK102352321SQ201110302170
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者張文宣, 朱江萍, 趙南 申請(qǐng)人:江西新瑞豐生化有限公司