專利名稱：一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法，具體地說(shuō)是一種采用水胺硫磷對(duì)SD大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期灌胃，通過(guò)水胺硫磷對(duì)SD大鼠血管及大腦神經(jīng)組織造成慢性損傷以建立血管性癡呆大鼠模型。
背景技術(shù)：
VD (Vascular Dementia，VD)是由于一系列血管損傷因素導(dǎo)致腦組織損害而引起的癡呆綜合癥。以記憶力受損、認(rèn)知功能下降為主，或伴有語(yǔ)言功能下降以及情感、人格障礙為主要臨床表現(xiàn)的一組神智異常癥候群。
在歐美國(guó)家中，VD占老年癡呆總數(shù)的15% ；在中國(guó)、日本等亞洲國(guó)家，VD占老年癡呆總數(shù)的50%。目前，我國(guó)的VD患病率為324/10萬(wàn)，彡65歲人群中VD的患病率為1. 3%。 并且，隨著人口老齡化和血管性疾病的發(fā)病率增高，VD的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，VD為多因素?fù)p傷性疾病，其病因可能包括高血壓、糖尿病、動(dòng)脈硬化、冠心病、腦梗塞、腦缺血再灌注損傷等，其誘因可能包括吸煙、飲酒、環(huán)境污染、電離輻射等。遺憾的是，迄今為止尚未確定VD發(fā)病的真正原因，更未找到理想的抗VD藥物。因此，無(wú)論從VD的病因或是誘因入手，找到正確的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)理想的干預(yù)藥物，將對(duì)保障人類健康及提高老年人生活質(zhì)量做出貢獻(xiàn)！動(dòng)物模型的建立是研究疾病發(fā)病機(jī)理的必要條件。目前，常見(jiàn)的VD模型建立方法包括①血管外阻斷法，如四血管阻斷法(four vessel occlusion，4V0)、三血管阻斷法 (three vessel occlusion, 3V0)、兩血管阻斷法(two vessel occlusion, 2V0)；②血管內(nèi)栓法；③大腦中動(dòng)脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion,MCA0)；④高血壓腦卒中自發(fā)大鼠動(dòng)物模型(stroke—prone spontaneously hypertensive rats, SPSHR)；(5)去大腦皮層VD動(dòng)物模型；⑥立體定向光化學(xué)誘導(dǎo)腦梗死模型；⑦腦內(nèi)注射內(nèi)皮素法。
雖然VD動(dòng)物模型的建立方法較多，但每種方法都是從模擬人類VD發(fā)病的某一個(gè)側(cè)面來(lái)完成的，與臨床實(shí)際情況尚有一定偏離，主要問(wèn)題有以下幾點(diǎn)①目前VD模型都是建立在有創(chuàng)傷的基礎(chǔ)之上，大鼠本身耐受性差，創(chuàng)傷性模型導(dǎo)致大鼠死亡率高；②VD病因復(fù)雜，影響因素較多，發(fā)病時(shí)程較長(zhǎng)。而目前的VD模型建立的時(shí)間一般較短，不能完全反應(yīng)實(shí)際情況；③創(chuàng)傷本身對(duì)機(jī)體造成的應(yīng)激對(duì)VD模型的穩(wěn)定性有一定的影響。因此，建立一種長(zhǎng)期、慢性的無(wú)創(chuàng)性VD模型對(duì)于研究VD的發(fā)病機(jī)理很有必要！一些社會(huì)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，長(zhǎng)期、低劑量接觸有機(jī)磷農(nóng)藥能夠?qū)е掠洃浟κ軗p、認(rèn)知及語(yǔ)言功能下降、情感障礙等癥狀。①ffesseling C對(duì)157名長(zhǎng)期暴露于有機(jī)磷環(huán)境中的香蕉工人進(jìn)行精神心理數(shù)字編碼分析，結(jié)果顯示，長(zhǎng)期、低劑量接觸有機(jī)磷農(nóng)藥造成明顯的語(yǔ)言功能下降及人格障礙(Wesseling C, Keifer M, Ahlbom A, McConnell R, Moon JD, Rosenstock L, Hogstedt C. Long-term neurobehavioral effects of mild poisonings with organophosphate and n—methyl carbamate pesticides among banana workers. Int J Occup Environ Health, 2002. ) ；(2) Stephens R 對(duì) 146 名長(zhǎng)期暴露于有機(jī)磷農(nóng)藥環(huán)境中的羊毛工人進(jìn)行神經(jīng)心理學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，長(zhǎng)期、低劑量接觸有機(jī)磷農(nóng)藥造成明顯的短期記憶力受損及語(yǔ)言功能下降，并出現(xiàn)認(rèn)知、情感障礙等癥狀(St印hens R, Spurgeon A, Calvert IAj Beach J，Levy LSj Berry H，Harrington JM. Neuropsychological effects of long-term exposure to organophosphates in sheep dip. Lancet, 1995. )0 通過(guò)上述調(diào)查我們猜測(cè)，“長(zhǎng)期、低劑量接觸有機(jī)磷”與“VD”存在一定的因果關(guān)系。于是，我們實(shí)驗(yàn)室于2010年7月-2011年4月開(kāi)展了長(zhǎng)期、低劑量接觸水胺硫磷誘發(fā)SD大鼠產(chǎn)生 VD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。通過(guò)水胺硫磷對(duì)SD大鼠的急性、慢性毒理實(shí)驗(yàn)，確定水胺硫磷的灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為M周。對(duì)照組采用2V0 法制備VD大鼠模型。采用大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)及Morris水迷宮試驗(yàn)(Morris Water Maze，MWM)來(lái)判斷大鼠記憶功能，并通過(guò)血管功能學(xué)實(shí)驗(yàn)、血管及大腦神經(jīng)元形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷VD大鼠模型是否成功。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種建立VD大鼠模型的新型方法。
本發(fā)明提供了一種無(wú)創(chuàng)性建立VD大鼠模型的新型方法。
本發(fā)明提供了一種利用水胺硫磷灌胃的方法建立VD大鼠模型。
本發(fā)明提供的SD大鼠為清潔級(jí)、健康SD大鼠，鼠齡為6周齡，性別為雄性，體質(zhì)量為 180 220g。
本發(fā)明提供的水胺硫磷灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為M周。
本發(fā)明應(yīng)用的水胺硫磷可以直接購(gòu)買(mǎi)，按照實(shí)際濃度進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明SD大鼠生長(zhǎng)環(huán)境要求為動(dòng)物房溫度為18 22°C，相對(duì)濕度為40 70%， 氣流速度為0. 1 0. 2米/秒，換氣次數(shù)為30次/小時(shí)，環(huán)境潔凈度為10000 100000級(jí)， 三級(jí)定向控制空氣壓差為0 20%，自動(dòng)定時(shí)器控制光照周期(08 00 20 00為光照期， 20 00 08 00為黑暗期)，常規(guī)大鼠飼料及凈化自來(lái)水飼養(yǎng)。
本發(fā)明采用的灌胃方法是常用的大鼠灌胃法，灌胃針經(jīng)大鼠口角插入口腔，輕壓大鼠舌根部，大鼠自主吞咽，操作人員順勢(shì)將灌胃針?biāo)腿氪笫笪钢?，將藥物推入?br> 經(jīng)跳臺(tái)試驗(yàn)、避暗試驗(yàn)、Morris水迷宮試驗(yàn)、血管功能學(xué)實(shí)驗(yàn)及形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)證明， 該方法建立的VD大鼠模型與傳統(tǒng)的有創(chuàng)性方法制備的VD大鼠模型沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明模型成功。


圖1水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠跳臺(tái)、避暗試驗(yàn)潛伏期結(jié)果(—± s)(與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0. 05 ；與正常對(duì)照組比較，#<0. 05)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，VD模型組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)潛伏期與正常對(duì)照組比較明顯縮短，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異； VD模型組大鼠避暗試驗(yàn)潛伏期與正常對(duì)照組比較明顯縮短，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。表明造模比較理想。
圖2水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠跳臺(tái)、避暗試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)結(jié)果(_ t s)(與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*P<0. 05 ；與正常對(duì)照組比較，#<0. 05)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，VD模型組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)與正常對(duì)照組比較明顯增多，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異；VD模型組大鼠避暗試驗(yàn)錯(cuò)誤次數(shù)與正常對(duì)照組比較明顯增多，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。表明造模比較理想。
圖3水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(endothe 1 ium dependence relaxation reaction，EDRR)女臺(tái)
圖4水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠頸總動(dòng)脈EDRR檢測(cè)Γ 士S)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，*Ρ<0. 05 ；與正常對(duì)照組比較，#<0. 05。與正常對(duì)照組比較，VD模型組EDRR反應(yīng)明顯降低， 血管內(nèi)皮功能顯著下降；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，VD模型組EDRR反應(yīng)無(wú)明顯差異。表明造模比較理想。
圖5水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜光鏡及電鏡觀察結(jié)果(光鏡照片采自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室；電鏡照片采自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院電鏡室)。光鏡下，VD模型組頸總動(dòng)脈血管內(nèi)膜出現(xiàn)明顯斷裂痕跡，內(nèi)膜皺褶增多，脂質(zhì)于內(nèi)皮下沉積，有動(dòng)脈硬化傾向；血管內(nèi)膜下平滑肌層細(xì)胞排列紊亂，肌層出現(xiàn)明顯斷裂、融合現(xiàn)象，延續(xù)性較差，肌細(xì)胞間纖維組織增生；肌層下纖維結(jié)締組織疏松，肌層與結(jié)締組織界限不清楚。電鏡下，VD模型組內(nèi)皮細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，平滑肌細(xì)胞延伸入內(nèi)皮細(xì)胞胞漿；內(nèi)皮基膜斷裂，斷裂處有大量膠原纖維組織增生；內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)高爾基體增多，線粒體腫脹、線粒體嵴融合或缺失。
圖6水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠海馬CAl區(qū)皮層光鏡及電鏡觀察結(jié)果(光鏡照片采自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室；電鏡照片采自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院電鏡室)。光鏡下，VD模型組海馬CAl區(qū)三層錐體細(xì)胞排列紊亂；部分錐體細(xì)胞腫脹，并有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生；部分錐體細(xì)胞胞體變小或呈三角形，頂樹(shù)突延長(zhǎng)，有核固縮和破裂現(xiàn)象，胞漿呈均勻嗜伊紅色；部分錐體細(xì)胞胞核變淺，基質(zhì)疏松伴明顯的微空泡形成；血管周?chē)屑t細(xì)胞滲出， 尚可見(jiàn)小血管增生。電鏡下，VD模型血腦屏障內(nèi)膜不光滑；神經(jīng)元細(xì)胞皺縮、膜結(jié)構(gòu)不清； 胞核固縮，染色質(zhì)聚集成團(tuán)、邊集，異染色質(zhì)增多，核周可見(jiàn)高電子密度團(tuán)塊；高爾基體增多，線粒體腫脹，線粒體嵴融合并出現(xiàn)空泡變性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施方式用于說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。大鼠體質(zhì)量為200g，水胺硫磷濃度為20%。按照灌胃濃度為0. 5mg/kg計(jì)算，該大鼠需水胺硫磷0. Img0移液管吸取20%的水胺硫磷0. 5ml移至量筒中，即為含0. Img水胺硫磷的溶液。灌胃容量要求為0. 6ml(3ml/ kgX0. ^cg)。因此，在量筒中添加蒸餾水至0. 6ml，灌胃針全部吸取后，對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃。
實(shí)驗(yàn)例檢測(cè)水胺硫磷灌胃法建立VD模型的可行性。
1、藥物水胺硫磷(LS93564，20%，湖北沙隆達(dá)股份有限公司)。
2、目的利用水胺硫磷對(duì)SD大鼠進(jìn)行灌胃M周建立VD模型。
3、儀器大鼠跳臺(tái)記錄系統(tǒng)、大鼠避暗儀、Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);MD3000生物信號(hào)采集系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);TS1000尼康顯微鏡(日本尼康公司)；HT7700日立透射電子顯(日本日立公司)。
4、動(dòng)物6周齡、雄性、18(T220g、清潔級(jí)、健康SD大鼠(河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。
5、實(shí)驗(yàn)分組①正常對(duì)照組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級(jí)、健康SD大鼠10只，5常規(guī)飼養(yǎng)M周；②VD模型組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級(jí)、健康SD大鼠10只，對(duì)其進(jìn)行水胺硫磷灌胃，灌胃濃度為0. 5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為對(duì)周；③陽(yáng)性對(duì)照組6周齡、雄性、18(T220g、清潔級(jí)、健康SD大鼠10只，采用2V0制備大鼠VD模型。術(shù)前1 禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0. 33ml/100g)腹腔注射麻醉， 保證手術(shù)期間有自主呼吸。仰臥固定，頸部去毛、強(qiáng)力碘消毒后沿頸正中切開(kāi)，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，并套以雙重“0”號(hào)線，在雙側(cè)頸總動(dòng)脈的近心端及遠(yuǎn)心端分別結(jié)扎，并從中間離斷，以確保阻斷動(dòng)脈血流。注意術(shù)中無(wú)菌操作，手術(shù)切口給予慶大霉素注射液2 ml，縫合切口。術(shù)后將動(dòng)物送至通風(fēng)良好的動(dòng)物房飼養(yǎng)；④陰性對(duì)照組16周齡、雄性、18(T220g、清潔級(jí)、健康SD大鼠10只，術(shù)前12h禁食，4h禁水。用10%水合氯醛(0.3:3ml/ IOOg)腹腔注射麻醉，保證手術(shù)期間有自主呼吸。大鼠麻醉后只分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎、不離斷動(dòng)脈。
6、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)、大鼠避暗試驗(yàn)、大鼠Morris水迷宮試驗(yàn)、EDRR檢測(cè)、 大鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)膜光鏡及電鏡觀察、大鼠大腦海馬CAl區(qū)皮層光鏡及電鏡觀察。
7、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(―士s)表示。組間差異比較用ANOVA 及Newman-Student多重比較；t檢驗(yàn)分析，由SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件完成，雙側(cè)P < 0. 05認(rèn)為差異有顯著性。
8、結(jié)果8.1水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。VD模型組大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)潛伏期與正常對(duì)照組比較明顯縮短，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異；VD模型組大鼠平均5分鐘錯(cuò)誤次數(shù)與正常對(duì)照組比較明顯增多，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。表明造模比較理想。
表1水胺硫磷誘發(fā)VD模型大鼠跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果G 士 s)
權(quán)利要求
1.一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大鼠，其特征在于清潔級(jí)、健康SD大鼠，鼠齡為6周齡，性別為雄性，體質(zhì)量為18(T220g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型方法，其特征在于采用水胺硫磷對(duì)SD大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期灌田冃°
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的灌胃，其特征在于灌胃容量為;3ml/kg，灌胃濃度為0.5mg/kg, 灌胃頻率為隔日1次。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長(zhǎng)期，其特征在于灌胃周期為M周。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種建立血管性癡呆大鼠模型的新型方法。該方法采用水胺硫磷對(duì)6周齡、雄性、180~220g、清潔級(jí)、健康Sprague-Dawley(SD)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)期灌胃。水胺硫磷的灌胃濃度為0.5mg/kg，灌胃容量為3ml/kg，灌胃頻率為隔日1次，灌胃周期為24周。通過(guò)水胺硫磷對(duì)SD大鼠腦血管及大腦神經(jīng)組織造成慢性損傷以建立血管性癡呆大鼠模型。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102512259SQ20111036630
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者侯軟玲, 尹雅玲, 張潔, 張群妹, 朱利紅, 李鵬, 楊帆, 畢凌云, 潘國(guó)聘, 王亞莉, 王倩倩, 王建剛, 王永霞, 袁向山, 陳杰, 馬麗娟 申請(qǐng)人:新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院