專利名稱：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域和植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)法，以及不需要組織培養(yǎng)的基因槍法、花粉管通道法和子房注射法等，簡(jiǎn)介如下基因槍法利用基因槍，將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對(duì)簡(jiǎn)單，因此也是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法，但是其轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較低?；ǚ酃芡ǖ婪ㄔ谑诜酆笙蜃臃孔⑸浜康幕虻腄NA溶液，利用植物在開花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于80年代初期由我國(guó)學(xué)者周光宇提出，我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的。 該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握，和基因槍法類似，其轉(zhuǎn)化效率較低。子房注射法子房注射法是對(duì)整體植株的早期胚細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA。直接將質(zhì)粒DNA注射到植物的子房，此法更適用于子房較大的植物，如西瓜、黃瓜、西瓜等。采用這種方法，無(wú)需進(jìn)行細(xì)胞或原生質(zhì)體的組織培養(yǎng)，可以在田間或溫室進(jìn)行，比花粉管通道或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等方法導(dǎo)入外緣DNA更簡(jiǎn)單，但是假陽(yáng)性率較高。在甜瓜再生體系中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的組織培養(yǎng)法主要是利用根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有的Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染甜瓜傷口細(xì)胞后，可將T-DNA插入到甜瓜基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物轉(zhuǎn)化體系，人們將目的基因插入到改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。但是由于甜瓜的再生體系建立起來(lái)相對(duì)比較困難，特別是由于甜瓜組培苗的玻璃化現(xiàn)象比較嚴(yán)重，造成了成苗及其困難的情況，大多數(shù)情況下，難以獲得真正的轉(zhuǎn)基因植株。這一關(guān)鍵技術(shù)的限制因素在于獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞之后，難以從轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性細(xì)胞獲得植株。所以說(shuō)，盡管該方法理論基礎(chǔ)相對(duì)清楚，技術(shù)方法最成熟，但是相對(duì)于一些組織培養(yǎng)再生能力較差的植物來(lái)說(shuō)，該方法的應(yīng)用卻存在著一定的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種改良的通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，以獲得高頻率的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行甜瓜的基因工程改良。該方法可以避免誘導(dǎo)愈傷組織以及愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，整個(gè)工作周期短，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株?？梢栽谝欢ǔ潭壬峡朔蛐偷南拗?。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，步驟如下(1)甜瓜無(wú)菌苗的生成；(2)含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸；(3)轉(zhuǎn)化對(duì)適宜大小的甜瓜幼苗進(jìn)行剪切，去其子葉， 暴露或損傷頂端生長(zhǎng)點(diǎn)，然后將含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹至幼苗切口處；(4)篩選 從生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出幼苗，剪下并將其轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)；( 使經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)的幼苗生根，并進(jìn)行移栽，得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行子代鑒定。所述步驟(1)具體如下甜瓜無(wú)菌苗的生成甜瓜種子去殼后，用70%乙醇(體積濃度)浸泡30 45s，用無(wú)菌水洗1 2次，而后用0. 1 %的HgCl2溶液(質(zhì)量濃度)浸泡 8 lOmin，再用無(wú)菌水沖洗4 5次，用濾紙吸干表面殘留液體后，接種于不含抗生素的MS 發(fā)芽培養(yǎng)基上，26士 1°C暗培養(yǎng)2 3天，待胚根長(zhǎng)出后于3000Lx光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)5 7天，得甜瓜無(wú)菌苗。所述步驟( 具體如下含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸用無(wú)菌牙簽從平板上挑取含有目的基因的農(nóng)桿菌單菌落接種至20ml附加抗生素的pH為7. O的LB液體培養(yǎng)基上，280C，180r/min培養(yǎng)至OD600 = 0 . 6 0. 8 ；取菌液加至相同培養(yǎng)基上，28°C，180r/min 繼續(xù)培養(yǎng)5 6小時(shí)，培養(yǎng)至菌液濃度OD600 = O. 5 O. 6 ；5000r/min，4°C離心5min,收集菌體，去上清，用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，再次用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸菌體后，即可以用于轉(zhuǎn)化，備用。所述附加的抗生素為50mg/L的利福平。所述菌液培養(yǎng)至0D_ = 0. 6 0. 8時(shí)，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH 為7. O的LB液體培養(yǎng)基上。所述步驟(3)具體如下轉(zhuǎn)化待步驟(1)得到的甜瓜無(wú)菌苗的子葉將要展開時(shí)， 從子葉的基部將子葉剪切掉，然后用牙簽粘取少量經(jīng)步驟( 活化了的農(nóng)桿菌菌液輕輕地涂抹在切口處，沈士 1°C暗培養(yǎng)2 3天，再在3000LX光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)。所述步驟(4)具體如下蹄選當(dāng)切口處長(zhǎng)出的再生芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，剪切，移到篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，得幼苗。若底部葉片變黃可繼續(xù)剪切頂端新芽繼續(xù)選擇培養(yǎng)，直至成苗。所述篩選培養(yǎng)基的配方為MS+含有選擇標(biāo)記抗性的抗生素+羧芐青霉素300mg/ L所述步驟( 具體如下生根及移栽將幼苗從選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長(zhǎng)出不定根后(約兩周后)，打開瓶口，室內(nèi)煉苗3天左右，然后從培養(yǎng)基中取出，洗凈培養(yǎng)基后在水中浸泡至長(zhǎng)出新根，而后移栽至大田。所述含有選擇壓的生根培養(yǎng)基的配方為l/2MS+0. 05mg/L 6-BA+lmg/L NAA+瓊脂 7g/L, PH5. 8。本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，克服了基因型對(duì)甜瓜再生的限制，并可以避免誘導(dǎo)愈傷組織以及愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，整個(gè)工作周期短，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株。


圖1為甜瓜子葉被剪切后照片。圖2涂抹農(nóng)桿菌后甜瓜生長(zhǎng)點(diǎn)再生情況。圖3為PCR反應(yīng)程序示意圖。圖4為熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定電泳圖，泳道1、2為轉(zhuǎn)化植株，泳道3為野生型植株 P為質(zhì)粒對(duì)照。圖6為轉(zhuǎn)基因植株、野生植株和PreC008-CmMlo2質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線和熔點(diǎn)曲線示意圖，其中，A 轉(zhuǎn)化植株1擴(kuò)增曲線；B 轉(zhuǎn)化植株1熔點(diǎn)曲線；C 轉(zhuǎn)化植株2擴(kuò)增曲線；D 轉(zhuǎn)化植株2熔點(diǎn)曲線；E 野生型植株擴(kuò)增曲線；F 野生型植株熔點(diǎn)曲線；G :PFGC1008-CmMlo2 質(zhì)粒擴(kuò)增曲線；H :PFGC1008-CmMlo2質(zhì)粒熔點(diǎn)曲線。圖7為轉(zhuǎn)化植株和野生型植株的表觀差異示意圖，其中A =WT-I為甜瓜野生型， C5-6為獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株。B 左，接種后的WT-1，感白粉病。右接種后的轉(zhuǎn)化植株C5-6， 表現(xiàn)為抗白粉病。C:左，感病的WT-I后期生長(zhǎng)情況。右，轉(zhuǎn)化植株后期生長(zhǎng)情況。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化CmMlo2基因，獲得抗白粉病甜瓜種質(zhì)，步驟如下一、甜瓜CmMlo2基因的克隆l、cDNA第一鏈的合成Trizol 法提取葉片總 RNA。Smart RACE cDNA Amplification Kit 合成 cDNA。2、甜瓜CmMlo2基因的克隆根據(jù)擬南芥，大麥等作物Mlo的保守序列，設(shè)計(jì)如下引物上游引物CA[C/T] CAGCTGCA [C/T/G] AT [A/C/T] TTCATCTT，下游引物CCCATCTGAGT[A/T/G] AC [A/T/G] AG [T/A/C/G] GC [A/G/C] TA。以甜瓜葉片cDNA為模板擴(kuò)增中間片段，反應(yīng)體系為25ul，反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性!Bmin ;941變性308、561復(fù)性308、721延伸508，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0 12%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根)回收PCR產(chǎn)物。回收的PCR產(chǎn)物與PGEM-T easy vector (Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10，菌落在含有X-gal和IPTG的平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，分別挑選若干白斑菌落提取質(zhì)粒，通過(guò)質(zhì)粒 DNA酶切和PCR鑒定后克隆的PCR產(chǎn)物由北京博尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。根據(jù)中間片段測(cè)序結(jié)果分別設(shè)計(jì)5' RACE和3' RACE的特異引物M3' GSP :GATAACCCAGCTGGCTCATGAGG ；M5' GSP :GCAACCAACCAAGAAGAGCTGAATC。采用Clontech的SMATR技術(shù)，通過(guò)RACE方法分別獲得5' RACE和3' RACE的序列，拼接后得到cDNA全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)引物上游引物GAGAAGAACACGGAGCCGAAATG，
下游引物TTTCTCCTACGGAACGGGGTAAG。以cDNA第一鏈為模板，PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)cDNA。二、構(gòu)建反義干擾表達(dá)載體結(jié)合hvitrogen公司的在線設(shè)計(jì)軟件，確定CmMlo2的+3 到+690共367bp為
最終靶標(biāo)。通過(guò)PCR方法在目標(biāo)片段的5’端和3’端分別加上酶切位點(diǎn)SpeI-AscI和 Swal-BamH I，引物序列如下上游引物TAACTAGT GGCGCGCCAACAGTCGTCTTAGACTTC ；下游引物GCGGATCC ATTTAAATAACAAACAATCCAGAGGG。三、利用苗端轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化甜瓜感病種質(zhì)1、甜瓜無(wú)菌苗的生成甜瓜種子去殼后，用70%乙醇(體積濃度)浸泡30s，用無(wú)菌水洗2次，而后用0. 1 %的HgCl2溶液(質(zhì)量濃度)浸泡8min，再用無(wú)菌水沖洗4次，用濾紙吸干表面殘留液體后，接種于不含抗生素的MS發(fā)芽培養(yǎng)基上，沈士 1 °C暗培養(yǎng)2天，待培根長(zhǎng)出后于3000Lx光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)5天，得甜瓜無(wú)菌苗。2、含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸用無(wú)菌牙簽從平板上挑取含有目的基因的農(nóng)桿菌單菌落接種至20ml附加抗生素(50mg/L的氯霉素和50mg/L的利福平)的pH為7. 0 的LB液體培養(yǎng)基上，280C，180r/min培養(yǎng)至OD600 = 0 . 6 0. 8 ；取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH為7. 0的LB液體培養(yǎng)基上，28°C，180r/min繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，培養(yǎng)至菌液濃度OD6tltl = 0. 5 0. 6 ；5000r/min, 4°C離心5min，收集菌體，去上清，用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，再次用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/ min，4°C離心5min，收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸菌體后，即可以用于轉(zhuǎn)化，備用。3、轉(zhuǎn)化待步驟(1)得到的甜瓜無(wú)菌苗的子葉將要展開時(shí)，從基部將子葉剪切掉(圖1)，然后用牙簽粘取少量經(jīng)步驟( 活化了的農(nóng)桿菌菌液輕輕地涂抹在切口處，
暗培養(yǎng)3天，再在3000LX光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)。4、篩選當(dāng)切口處長(zhǎng)出的不定芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，剪切，移到篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，得幼苗。若底部葉片變黃可繼續(xù)剪切頂端新芽繼續(xù)選擇培養(yǎng)，直至成苗(圖幻。篩選培養(yǎng)基的配方為MS+潮霉素10mg/L+羧芐青霉素300mg/L。5、生根及移栽將幼苗從選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長(zhǎng)出不定根后(約兩周后)，打開瓶口，室內(nèi)煉苗3天左右，然后從培養(yǎng)基中取出， 洗凈培養(yǎng)基后在水中浸泡至長(zhǎng)出新根，而后移栽至大田。所述含有選擇壓的生根培養(yǎng)基的配方為生根培養(yǎng)基1/2MS、0. 05mg/L 6-BA、 lmg/LNAA、瓊脂 7g/L、PH5. 8。四、轉(zhuǎn)化植株的抗白粉病檢測(cè)1、植株的PCR檢測(cè)將通過(guò)篩選壓選擇，經(jīng)不定芽伸長(zhǎng)、誘導(dǎo)生根后的TO代植株提取葉片DNA，PCR檢測(cè)利用載體preC100835S啟動(dòng)子上的一段序列作為上游引物，下游引物為CmMlo2RNAi片段的下游引物。上游引物TCATTCAAGATCTCTCTGCCGACAGTG；下游引物GCGGATCCATTTAAATAACAAACAATCCAGAGGG。
混勻后，短暫離心，進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件如下940C 3min，25 個(gè)循環(huán)為-MV 50s, 59°C 50s, 72°C lmin，最后，72°C延伸 IOmin0PCR 產(chǎn)物用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳電泳。2、轉(zhuǎn)基因植株的Real-Time PCR檢測(cè)定量分析在BIO-RAD iQ5Real_Time PCR system 上進(jìn)行。利用 takara 試劑盒 DRR041 SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，在冰上操作，保持試劑的活性；因?yàn)镾TOR熒光染料的緣故，要避免中強(qiáng)光，照射；在移液準(zhǔn)確的前提下，盡量縮短操作時(shí)間， 減少非特異擴(kuò)增；充分振蕩，使成分均勻。按下列組分配制PCR反應(yīng)液(表1)表 權(quán)利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，步驟如下(1)甜瓜無(wú)菌苗的生成；( 含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸；C3)轉(zhuǎn)化對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行剪切，去其子葉，暴露或損傷頂端生長(zhǎng)點(diǎn)，然后將含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹至幼苗切口處；(4)篩選從生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出幼苗，剪下并將其轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)；( 使經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)的幼苗生根，并進(jìn)行移栽，得轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟(1)具體如下甜瓜無(wú)菌苗的生成甜瓜種子去殼后，用70%乙醇浸泡30 45s，用無(wú)菌水洗1 2次，而后用0. 1 %的HgCl2溶液浸泡8 lOmin，再用無(wú)菌水沖洗4 5次，用濾紙吸干表面殘留液體后，接種于不含抗生素的MS發(fā)芽培養(yǎng)基上J6±rC暗培養(yǎng)2 3天， 待培根長(zhǎng)出后于3000Lx光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)5 7天，得甜瓜無(wú)菌苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟( 具體如下含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸用無(wú)菌牙簽從平板上挑取含有目的基因的農(nóng)桿菌單菌落接種至附加抗生素的PH為7. O的LB液體培養(yǎng)基上，28°C，180r/min培養(yǎng)至OD600 = 0 . 6 0. 8 ；取菌液加至相同培養(yǎng)基上J8°C，180r/min繼續(xù)培養(yǎng)5 6小時(shí)， 培養(yǎng)至菌液濃度OD6tltl = 0. 5 0. 6 ；5000r/min, 4°C離心5min，收集菌體，去上清，用液體MS 培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，再次用液體MS培養(yǎng)基重懸菌體，而后5000r/min，4°C離心5min，收集菌體，用MS培養(yǎng)基重懸菌體，備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述附加的抗生素為50mg/L的利福平。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述菌液培養(yǎng)至OD6tltl = 0. 6 0. 8時(shí)，取200ul菌液加至20ml附加抗生素的pH為7. O的LB液體培養(yǎng)基上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟(3)具體如下轉(zhuǎn)化待步驟(1)得到的甜瓜無(wú)菌苗的子葉將要展開時(shí)，從基部將子葉剪切掉，然后取經(jīng)步驟( 活化了的農(nóng)桿菌菌液涂抹在切口處，26 士 1°C暗培養(yǎng)2 3天，再在 3000Lx光照強(qiáng)度、1 / 光周期下培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟(4)具體如下篩選當(dāng)切口處長(zhǎng)出的不定芽長(zhǎng)到Icm以上時(shí)，剪切，移到篩選培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)，得幼苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述篩選培養(yǎng)基的配方為MS+含有選擇標(biāo)記抗性的抗生素+羧芐青霉素300mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述步驟( 具體如下生根及移栽將幼苗從選擇培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移至含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長(zhǎng)出不定根后，打開瓶口，室內(nèi)煉苗3天，然后從培養(yǎng)基中取出，洗凈培養(yǎng)基后在水中浸泡至長(zhǎng)出新根，而后移栽至大田。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，其特征在于所述含有選擇壓的生根培養(yǎng)基的配方為l/2MS+0. 05mg/L 6-BA+lmg/L NAA+瓊脂7g/L，PH5. 8。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜瓜苗端轉(zhuǎn)化方法，步驟如下(1)甜瓜無(wú)菌苗的生成；(2)含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸；(3)轉(zhuǎn)化對(duì)適宜大小的甜瓜幼苗進(jìn)行剪切，去其子葉，暴露或損傷頂端生長(zhǎng)點(diǎn)(附圖1)，然后將含有目的基因的農(nóng)桿菌菌液涂抹至幼苗切口處；(4)篩選從生長(zhǎng)點(diǎn)長(zhǎng)出幼苗(附圖2)，剪下并將其轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng)；(5)使經(jīng)過(guò)選擇培養(yǎng)的幼苗生根，并進(jìn)行移栽，得轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行子代鑒定。該方法可以避免誘導(dǎo)愈傷組織以及愈傷組織培養(yǎng)中引起的不利變異，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，整個(gè)工作周期短，可以在較短時(shí)間內(nèi)獲得轉(zhuǎn)基因植株?？梢栽谝欢ǔ潭壬峡朔蛐偷南拗啤?br> 文檔編號(hào)A01H4/00GK102337295SQ20111031577
公開日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者孔維萍, 程鴻 申請(qǐng)人:甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所