專利名稱：節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及節(jié)旋藻研究與開發(fā)應用的技術，特別涉及節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法。
背景技術：
節(jié)旋藻UriAro1^ira)是一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻，系藍藻門 (Cyanophyta)、亶員藻目(Oscillatoriales)、亶員藻禾斗(Oscillatoriaceae)的一個屬，通常又稱為螺旋藻(分[胡鴻鈞.武漢植物學研究，1997，15(4) 369-374]。因其富含優(yōu)質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，目前已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產(chǎn)業(yè)，并廣泛應用于食品、生物醫(yī)藥保健、飼料、精細化工等領域。該屬中的鈍頂節(jié)旋藻Urthrospim phte/^is)是國內外商業(yè)化養(yǎng)殖生產(chǎn)與開發(fā)應用最廣泛的品種。我國是全球生產(chǎn)與出口螺旋藻粉的主要國家，產(chǎn)量近占世界總產(chǎn)量的一半[Wang，et al. Journal of Phycology. 2005, 41: 622—628]。手性(chirality or handedness)系指左右對稱性的差異特征。手性在自然界普遍存在，如一些植物的藤蔓等往往呈螺旋狀，根據(jù)其螺旋取向可區(qū)分為左手性或左旋 (Left-handed)、右手性或右旋(Right-handed)，以及無手性特征的手中性(No_chiral )。 手性取向可按業(yè)內通用的左右手定則進行判別。節(jié)旋藻藻絲在分類學上典型的形態(tài)學特征為由多個柱狀細胞串聯(lián)成絲狀、不分枝、有規(guī)則、疏松或緊密的螺旋形，但在某些條件下會發(fā)生多形性變異甚至完全變直(手中性)[Wang，et al. Journal of Phycology. 2005， 41: 622-628]。節(jié)旋藻藻絲螺旋的本征取向為左手性，很難使其變成右手螺旋并獲得純培養(yǎng)物。節(jié)旋藻相對于擬南芥和蝸牛等其它生物而言，具有螺旋手性典型、遺傳背景簡單、生長周期短等優(yōu)點，因而是用于研究生物手性形成與調控的理想材料。為此，迫切需要建立將螺旋本征取向為左手性的節(jié)旋藻藻絲構建成右手性藻絲，以及使右手螺旋藻絲能穩(wěn)定生長繁殖獲得其純培養(yǎng)物的方法，以滿足當前節(jié)旋藻研究及開發(fā)利用的實際需要。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的問題是，克服現(xiàn)有技術中的不足，目的是提供一種節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法。為解決技術問題，本發(fā)明的方案是
提供節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法，包括以下步驟
(1)取3 ml 在AB培養(yǎng)液[Rippka, et al. Journal of General Microbiology, 1979， 111 1-61]中繼代培養(yǎng)至少1年、螺旋手性本征取向為左手的鈍頂節(jié)旋藻藻液于5 ml離心管中，在高速臺式離心機上以8000 12000 rpm的轉速離心1(T15 min，棄去上清，沉淀加入 3 ml Zarrouk 培養(yǎng)液[Zarrouk, Ph. Dr. These, Univ. Paris, France, 1966]并搖勻， 如此重復3次，以使Zarrouk培養(yǎng)液充分替代AB培養(yǎng)液；
(2)置于光照強度為40 68Mffl0Pnr2M-1,光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C，光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)；
(3)每隔2d取樣在顯微鏡上觀察藻絲螺旋取向，直至發(fā)現(xiàn)右手螺旋手性藻絲；
(4)挑出右手螺旋手性藻絲，并接入Zarrouk培養(yǎng)液，置于光照強度為 40 68|^01·!!!-2·^，光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C，光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)，約20 d后獲得右手性螺旋手性藻絲的純培養(yǎng)物。作為一種改進，所述在高速臺式離心機上的離心速率為11000 rpm，離心時間為10
min。作為一種改進，所述培養(yǎng)時的光照強度為54 μπιοΡπΓ2·^，光照時溫度為30°C。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明所通過更換培養(yǎng)液及限定培養(yǎng)光照強度和溫度的方法，可使螺旋本征手性為左手的節(jié)旋藻藻絲逆轉為右手螺旋藻絲，并獲得其純培養(yǎng)物。這種方法具有操作簡便、成本低、對操作人員的專業(yè)技術無特殊要求、應用性強等優(yōu)點。


圖1為左旋的鈍頂節(jié)旋藻品系ZJU0137 ；
圖2為利用本發(fā)明的方法將ZJU0137逆轉成為右手螺旋藻絲； 圖3為左旋的鈍頂節(jié)旋藻品系ZJU0145 ； 圖4為利用本發(fā)明的方法將ZJU0145逆轉成為右手螺旋藻絲。
具體實施例方式本發(fā)明的技術方案可以通過以下步驟實現(xiàn)。實例1
選用樣本材料；為公知的鈍頂節(jié)旋藻品系ZJU0137，其藻絲的螺旋本征手性為左手，這株節(jié)旋藻品是實驗室常用的品系，在發(fā)明人所在的浙江大學原子核農業(yè)科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存，可隨時提供樣本。試劑和儀器本發(fā)明中所用的培養(yǎng)液成分均為國產(chǎn)分析純。光學顯微鏡為日本 OLYMPUS生產(chǎn)，型號為CH-30。構建節(jié)旋藻右手螺旋藻絲及其純培養(yǎng)的方法的主要步驟如下
(1)取3 ml 在AB培養(yǎng)液[Rippka, et al. Journal of General Microbiology, 1979， 111 1-61]中繼代培養(yǎng)至少1年、螺旋手性本征取向為左手的鈍頂節(jié)旋藻藻液于5 ml離心管中，在高速臺式離心機上以8000 12000 rpm的轉速離心1(T15 min，棄去上清，沉淀加入 3 ml Zarrouk 培養(yǎng)液[Zarrouk, Ph. Dr. These, Univ. Paris, France, 1966]并搖勻， 如此重復3次，以使Zarrouk培養(yǎng)液充分替代AB培養(yǎng)液；
(2)置于光照強度為40 68Mfflol^nT2M-1,光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C， 光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)；
(3)每隔2d取樣在顯微鏡上觀察藻絲螺旋取向，直至發(fā)現(xiàn)右手螺旋手性藻絲；
(4)挑出右手螺旋手性藻絲，并接入Zarrouk培養(yǎng)液，置于光照強度為 40 68|^01·!!!-2·^，光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C，光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)，約20 d后獲得右手性螺旋手性藻絲的純培養(yǎng)物。
實例2 選取公知、藻絲螺旋本征手性為左手的頓頂節(jié)旋藻品系ZJU0145為樣本， 利用本發(fā)明的方法也構建出其右手螺旋藻絲，并獲得其純培養(yǎng)。
權利要求
1.節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)取3ml在AB培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)至少1年、螺旋手性本征取向為左手的鈍頂節(jié)旋藻藻液于5 ml離心管中，在高速臺式離心機上以8000 12000 rpm的轉速離心10 15 min，棄去上清，沉淀加入3 ml Zarrouk培養(yǎng)液并搖勻，如此重復3次，以使Zarrouk培養(yǎng)液充分替代AB培養(yǎng)液；(2)置于光照強度為40 68Mffl0Pnr2M-1,光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C， 光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)；(3)每隔2d取樣在顯微鏡上觀察藻絲螺旋取向，直至發(fā)現(xiàn)右手螺旋手性藻絲；(4)挑出右手螺旋手性藻絲，并接入Zarrouk培養(yǎng)液，置于光照強度為4(Γ68 μπιοΡπΓ2·^，光照時溫度為25 35°C、黑暗時溫度為25°C，光照12 h/黑暗12 h條件下培養(yǎng)，20 d后獲得右手性螺旋手性藻絲的純培養(yǎng)物。
2.根據(jù)權利要求1所述節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法，其特征在于，所述在高速臺式離心機上的離心速率為11000 rpm，離心時間為10 min。
3.根據(jù)權利要求1所述節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)時的光照強度為54 μπιοΡπΓ2·^，光照時溫度為30°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及節(jié)旋藻研究與開發(fā)應用的技術，旨在提供一種節(jié)旋藻右手螺旋藻絲的構建及純培養(yǎng)方法。包括步驟(1)取在AB培養(yǎng)液中繼代培養(yǎng)至少1年、螺旋手性本征取向為左手的鈍頂節(jié)旋藻藻液，高速離心，棄去上清，沉淀加入Zarrouk培養(yǎng)液并搖勻，重復以充分替代AB培養(yǎng)液；(2)置于光照強度為40~68μmol m-2 s-1，光照時溫度為25~35℃、黑暗時溫度為25℃，光照12h/黑暗12h條件下培養(yǎng)；(3)每隔2d取樣觀察；(4)挑出右手螺旋手性藻絲，并接入Zarrouk培養(yǎng)液，按前述方式培養(yǎng)20d后獲得純培養(yǎng)物。本發(fā)明的方法具有操作簡便、成本低、對操作人員的專業(yè)技術無特殊要求、應用性強等優(yōu)點。
文檔編號A01G33/00GK102177840SQ20111007702
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權日2011年3月29日
發(fā)明者劉新穎, 孫霖潤, 汪志平, 王景梅, 董丹丹, 藍瑾瑾, 謝彥廣, 邵斌 申請人:浙江大學