專利名稱：一個(gè)逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在控制基因在干旱誘導(dǎo)表達(dá)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗(yàn)證得到ー種受非生物逆境(干早，高鹽，ABA)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子能夠提高抗逆相關(guān)基因在非生物逆境環(huán)境中特異表達(dá)，應(yīng)用于遺傳改良水稻抵抗非生物逆境的能力。本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增及融合報(bào)告基因遺傳轉(zhuǎn)化的方法，克隆到控制水稻非生物逆境誘導(dǎo)啟動(dòng)子0sIP3KP，通過real time-PCR,報(bào)告基因GUS染色觀察及酶活測(cè)定，證明該啟動(dòng)子受非生物逆境(干早，高鹽， ABA)誘導(dǎo)，可應(yīng)用于水稻的遺傳改良。
背景技術(shù)：
植物的生長除了有其固有的遺傳基礎(chǔ)外，往往還會(huì)受到諸多環(huán)境因素的影響。干旱、高鹽、低溫是最為常見的非生物逆境，嚴(yán)重影響了植物的生長，限制了植物的分布。非生物逆境會(huì)造成作物產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，在許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，培育抗逆作物一直是農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究的主要目標(biāo)之一。為了適應(yīng)或抵御這些逆境條件，植物在經(jīng)過長期的生物馴化之后，形成了自己的ー套防御干旱、高鹽、低溫、紫外線等逆境脅迫的自我保護(hù)機(jī)制。干旱、高鹽和低溫脅迫，都破壞了植物細(xì)胞的離子平衡，致使細(xì)胞脫水，使植物細(xì)胞受到離子和水分脅迫，干旱、高鹽和紫外線還引起植物體得氧化脅迫，激發(fā)相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致植物在新陳代謝以及形態(tài)上的變化，如植物生長的減緩甚至停止，體內(nèi)激素(如ABA)的瞬時(shí)上升，體內(nèi)調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)的聚集等(Seki M，Umezawa T，Urano K， Shinozaki K. Regulatory metaoolicnetworks in drought stress responses. Curr Opin Plant Biol，2007，10 :296-302)。并且植物在進(jìn)化過程中也形成了一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑來介導(dǎo)對(duì)脅迫的反應(yīng)，從而控制植物的生長發(fā)育。植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，它是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)域調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，它能結(jié)合反式作用因子，使之與啟動(dòng)子準(zhǔn)確地結(jié)合，確保轉(zhuǎn)錄精確而有效地起始，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。根據(jù)基因表達(dá)情況，可將啟動(dòng)子分為兩類組成型啟動(dòng)子和特異型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子能在所有細(xì)胞、任何時(shí)候進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；特異型啟動(dòng)子又可分為組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子平時(shí)不啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄活性很低， 但在某些特定的逆境信號(hào)的刺激下，轉(zhuǎn)錄活性能夠顯著地提高。在轉(zhuǎn)基因植物中，組成型啟動(dòng)子持續(xù)過量地表達(dá)轉(zhuǎn)化的目的基因可能會(huì)阻礙植物正常的生長發(fā)育并且可能減少其產(chǎn)量，因?yàn)橥庠椿虻倪^量表達(dá)會(huì)競(jìng)爭植物在正常生長條件下需要的能源，并且對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的其他ー些生理代謝活動(dòng)卻有競(jìng)爭性抑制作用。因此，尋找植物內(nèi)源的逆境脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，使外源基因只在脅迫的情況下才表達(dá)，這樣不僅會(huì)獲得目的產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，而且也不會(huì)產(chǎn)生副作用。植物非生物逆境基因調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的，受多種順式作用元件和反式作用因子的相互協(xié)調(diào)控制下游目的基因的表達(dá)。在最近二十年中，科學(xué)家們通過對(duì)植物中逆境相關(guān)基因及其啟動(dòng)子的研究， 已經(jīng)鑒定了多種參與非生物逆境的順式作用元件，如干早，高鹽響應(yīng)元件ABRE(ACGTGGC/ACGTGTC)，DRE(TACCGACAT)，MYBR(TGGTTAG)，CRT(GGCCGACAT)等。(Yamaguchi-Shinozaki and K. Shinozaki, A novelcis—acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought,丄owtemperature, or high-salt stress, Plant Ce丄丄 6 (1994)， pp. 251—264. ；Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Organization of cis—acting regulatory elements in osmotic and cold stressresponsive promoters. Trends Plant Sci.2005 Feb ；10 (2) :88-94 ；Xiao B, Huang Y, Tang N, XiongL. Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions. Theor Appl Genet. 2007 Jun ；115(1) :35-46. Epub 2007 Apr 11 ；Xiao BZ,Chen X,Xiang CB,Tang N,Zhang QF, Xiong LZ. Evahation of seven function known candidate genes for their effects onimproving drought resistance of transgenic rice under field conditions. Mol Plant. 2009Jan ；2(1) :73-83. Epub 2008 Nov 2)禾Ij用逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)抗逆基因在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)是培育抗逆作物新品種的有效方法。 但是，目前能應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因研究的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子仍然很少，對(duì)于新的抗逆相關(guān)啟動(dòng)子的克隆及分析的研究仍然是今后研究的重點(diǎn)，將功能明確的抗逆啟動(dòng)子成功應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因植物中調(diào)控抗逆基因的表達(dá)是植物抗逆遺傳改良的研究方向。水稻是重要的糧食作物和模式植物，通過尋找水稻中受非生物逆境誘導(dǎo)較強(qiáng)的基因，尋找逆境誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子已成為ー種重要的研究手段。在申請(qǐng)人的前期研究中分離到一個(gè)受非生物逆境(干早，高鹽，ABA)強(qiáng)烈誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。鑒于水稻中0sIP3KP啟動(dòng)子是否能受非生物逆境(干早，高鹽，ABA)誘導(dǎo)特異提高下游目的基因的表達(dá)目前尚無相關(guān)報(bào)道。因此，從水稻中分離出0sIP3KP啟動(dòng)子，并鑒定它在提高特異提高下游目的基因的表達(dá)所發(fā)揮的功能，對(duì)于培育抗逆水稻新品種將具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的涉及ー個(gè)肌醇3磷酸激酶基因家族0sIP3KP啟動(dòng)子在水稻抗旱鹽性狀改良中的應(yīng)用。OsIPI基因是ー個(gè)編碼肌醇3磷酸激酶基因基因，該基因受干早，高鹽， 脫落酸(ABA)誘導(dǎo)表達(dá)量顯著上升。本發(fā)明分離和應(yīng)用ー種OsIPI基因的啟動(dòng)子DNA片段，該片段賦予下游目的基因在干早，高鹽及ABA)條件下表達(dá)量顯著上升的能力。其中，所述的0sIP3KP啟動(dòng)子核苷酸序列長度為2119bp，其核苷酸序列如序列表SEQ NO 1所示。攜帯有本發(fā)明0sIP3KP啟動(dòng)子啟動(dòng)目的基因的載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞(Weisskich， 1998,Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp. 411-463 ； Geiserson and Corey, 1998, Plant MolecularBiology)?？墒褂冒ū景l(fā)明的0sIP3KP啟動(dòng)子啟動(dòng)的抗逆基因的載體轉(zhuǎn)化宿主是包括水稻在內(nèi)多種植物，培育特異抗旱鹽的植物品種。本發(fā)明基因是受干早，高鹽，ABA誘導(dǎo)表達(dá)的，因此可將本發(fā)明的啟動(dòng)子與任何感興趣的抗逆相關(guān)基因結(jié)合后轉(zhuǎn)入合適的表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化植物宿主，在干早，高鹽條件下可特異誘導(dǎo)表達(dá)抗性基因，提高植物抗旱鹽的能力。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說明。


序列表SEQ ID N0:1是本發(fā)明克隆的0sIP3KP啟動(dòng)子核苷酸序列，序列長度為 2119bp。圖1.是本發(fā)明分離克隆0sIP3KP啟動(dòng)子及功能鑒定的總體技術(shù)路線圖。圖2. Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的啟動(dòng)子能受多種非生物逆境高鹽、干旱、脫落酸(ABA)等誘導(dǎo)，受紫外線(UV)誘導(dǎo)較弱，而該啟動(dòng)子受低溫、高溫的誘導(dǎo)下游基因下降表達(dá)。圖中上排從左至右依次是高鹽、ABA和高溫脅迫；下排從左至右依次是干早、UV和低溫脅迫。圖3.是本發(fā)明的0sIP3KP啟動(dòng)子是顯著的組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子(圖中編號(hào)分別為:1.節(jié)間，2.節(jié)，3.葉鞘，4.三葉期苗子，5.穎殼，6.種子，7. 二次枝梗，8.花藥，9. 一次繼代愈傷，10. 二次繼代愈傷，11.三次繼代愈傷，12.幼芽，13.幼根，14.上午的劍葉， 15.下午的劍葉，16.葉枕)。圖4. 0sIP3KP-DX2181G啟動(dòng)子載體示意圖。圖5.是本發(fā)明的0sIP3KP啟動(dòng)子在該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因水稻正常生長條件下驅(qū)動(dòng)下游⑶S報(bào)告基因的表達(dá)(圖中編號(hào)分別為1. 一次繼代愈傷，2.發(fā)芽七天的胚芽鞘和幼葉， 3.胚和胚乳，4.穎殼和花藥，5.節(jié)和節(jié)間，6.葉鞘、葉枕和葉耳，7.劍葉，8.分蘗期的根， 9.穗發(fā)育七期的小穗及二次枝梗)。圖6.是本發(fā)明的0sIP3KP啟動(dòng)子在該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽期間干旱及ABA處理下誘導(dǎo)下游⑶S報(bào)告基因的表達(dá)量顯著上升(圖中編號(hào)分別為1.轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽五天后在正常生長條件⑶S染液染色結(jié)果，2.轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽五天后在干旱脅迫30分鐘后⑶S 染液染色結(jié)果，3.轉(zhuǎn)基因水稻發(fā)芽五天后在用200uM脫落酸(ABA)處理1小時(shí)后GUS染液染色結(jié)果。圖7.本發(fā)明的0sIP3KP啟動(dòng)子在該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因水稻四葉苗期干旱脅迫前后GUS 報(bào)告基因的活性的測(cè)定(圖中灰色柱子代表的是該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因陰性植株，黒色柱子代表的是該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中編號(hào)分別為DR0，干旱脅迫前；DR1，干旱脅迫一天； DR2，干旱脅迫兩天；DR3.干旱脅迫三天)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施方式定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離0sIP3KP啟動(dòng)子，克隆包含有0sIP3KP啟動(dòng)子的DNA片段，以及驗(yàn)證0sIP3KP啟動(dòng)子功能的方法，實(shí)施流程如圖1所示。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。實(shí)施例11、分離OsIPI基因的啟動(dòng)子用Real-time PCR檢測(cè)出0sIP3KP受干旱，高鹽，脫落酸(ABA)誘導(dǎo)，該0sIP3KP 的誘導(dǎo)時(shí)由上游啟動(dòng)子序列調(diào)控的，從水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫(本發(fā)明的啟動(dòng)子下游基因檢索地址:http://rice. ρ lantbio logy. msu. edu/cgi-bin/ORF_infopage. cgi,)中ロ以找到該基因在上述網(wǎng)站突變體庫中登錄號(hào)是L0C_0s03gl2840. 1，該啟動(dòng)子上游就是該基因的啟動(dòng)子序列。根據(jù)Os IPI基因基因序列在美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)數(shù)據(jù)庫中做序列比對(duì)，找到OsIPI基因在已經(jīng)測(cè)序提交的水稻全基因組上的匹配位置，可以確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)ATG在基因組上的位置其上游2. 5kb內(nèi)就是此基因候選啟動(dòng)子所在位置，再根據(jù)啟動(dòng)子所在位置設(shè)計(jì)PCR引物，其具體步驟如下所述的操作。選用粳稻品種“中花11號(hào)”(一個(gè)公開推廣應(yīng)用的水稻品種，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所商業(yè)品種)作為材料，從基因組中擴(kuò)增OsIPI基因啟動(dòng)子DNA序列的引物如下引物 PO1 5，CTCAAGCTTCGTCCAACGAATCCATCC 3，，引物 P02 5，CTCGGATCCGAATCCGCAGGCAAAGG 3，，其中PO1引物5 ’端加有限制性酶切割位點(diǎn)HindIII (AAGCTT)(用斜體加下劃線表示，酶切位點(diǎn)前的三個(gè)堿基為保護(hù)堿基)，P02引物5’端加有限制性酶切割位點(diǎn) BamHl (GGATCC)(用斜體加下劃線表示，酶切位點(diǎn)前的三個(gè)堿基為保護(hù)堿基)。PCR反應(yīng)體系的總體積為50μ 1，中花11水稻基因組DNA模板約100ng、2XGC bufferl (購自寶生物工程(大連)有限公司)酶反應(yīng)緩沖液、IOmM dNTP 0.5ul、10uM引物 0. 5ul、2単位LA-Taq酶(購自寶生物工程(大連)有限公司)，加雙蒸水至50 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?94°C變性 5min，94°C 30s、50°C 30s、72°C anin、30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 7min。擴(kuò)增結(jié)果測(cè)序(ABI3730測(cè)序儀，Applied Biosystem，測(cè)序在國家植物基因中心[武漢]完成)就可以得到該啟動(dòng)子及其序列如序列表SEQ ID NO :1。2、檢測(cè)水稻0sIP3KP啟動(dòng)子啟動(dòng)內(nèi)源下游基因表達(dá)的水平申請(qǐng)人:選用粳稻品種“中花11”作為表達(dá)譜分析的材料。種子催芽后，在小桶正常土壌中生長至四葉期時(shí)進(jìn)行各種逆境和激素的處理。干旱處理是不再澆水讓其自然干燥，分別在脅迫前、脅迫后1天、2天、3天、4天取樣；高鹽脅迫是向桶中加入含有300mmol/ L NaCl的溶液，分別在脅迫前，2小吋、6小吋、12小吋、72小時(shí)取樣；低溫脅迫是把四葉期將水稻幼苗放入4°C人工氣候室，分別于脅迫前、脅迫后2小吋、6小吋、12小吋、24小吋、 36小吋、48小時(shí)取樣。脫落酸(ABA)處理是用200 μ M脫落酸(ABA)均勻的噴灑水稻植株表面后并加到苗子生長的土壌中，分別在脅迫前、脅迫后30min，30分鐘、1小吋、2小吋、3 小吋、6小吋、12小時(shí)后取樣。高溫脅迫是把四葉期水稻幼苗放入42°C人工氣候室，分別于脅迫前、脅迫后0.3小吋、0.6小吋、1小吋、3小吋、6小吋、12小時(shí)取樣。紫外線(UV)脅迫是把四葉期水稻幼苗放入42°C人工氣候室，分別于脅迫前、脅迫后3小吋、6小吋、12小吋、24小時(shí)、恢復(fù)12小時(shí)取樣。水稻總RNA的提取采用TRIZOL試劑(購自hvitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL試劑說明書)，利用反轉(zhuǎn)錄酶SSIII (購自hVitrogen 公司)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA (方法根據(jù)hvitrogen公司反轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書)，反應(yīng)條件為65°C 5min,50°C 120min,70°C IOmin0以上述反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物 P03(5，-GGCGAGGAAGAAGGGAATTAAT-3，)和弓丨物 P04(5，-AAATGGGCCTTGTTCTGCAA-3，)對(duì) 0sIP3K基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增。同時(shí)用引物AF(5，-TGGCATCTCTCAGCACATTCC-3，)和 AR (5 ‘ -TGCACAATGGATGGGTCAGA-3’ )對(duì)水稻 Actinl 基因(基因登錄號(hào) X16^0)做特異擴(kuò)增，以作為內(nèi)對(duì)照進(jìn)行定量分析。反應(yīng)條件為95°C 5min ；95°C 10sec,60°C 5sec,72°C 34sec，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)過程中進(jìn)行熒光檢測(cè)實(shí)時(shí)定量分析。結(jié)果表明，0sIP3KP啟動(dòng)子(其序列如SEQ N0:1所示)在干旱、高鹽、和ABA處理下誘導(dǎo)OsIPI基因上升表達(dá)，在紫外線UV誘導(dǎo)下輕微上升表達(dá)，而在低溫和高溫脅迫中輕微地下降表達(dá)(圖幻。組織表達(dá)譜分析仍以粳稻品種“中花11”為材料，取各個(gè)發(fā)育時(shí)期的組織樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0sIP3KP存在典型的組織發(fā)育特異性，除葉片中表達(dá)量較高外，其余各組織表達(dá)量均較低(圖3)。3、0sIP3KP啟動(dòng)子載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化為了能更好的分析0sIP3KP啟動(dòng)子的功能，本發(fā)明的實(shí)施方案就是構(gòu)建OsIPIP 的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到粳稻品種中花11號(hào)中，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中0sIP3KP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S基因在逆境包括干旱、高鹽、脫落酸(ABA)、紫外線(UV)、高溫、低溫等逆境迫下的誘導(dǎo)表達(dá)活性，從而驗(yàn)證該基因啟動(dòng)子的功能。具體操作如下首先將分離的0sIP3KP啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物連入pGEM_T Easy載體(購自普洛麥格 (北京)生物技術(shù)有限公司，即美國!Iomega公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (購自普洛麥格 (北京)生物技術(shù)有限公司，即美國!3romega公司)并獲得陽性克隆。通過HindIII，BamHI 雙酶切從PGEM-T Easy陽性克隆上回收0sIP3KP再將其連接到⑶S表達(dá)載體DX2181G (華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室林擁軍教授惠贈(zèng)，載體含有GUS報(bào)告基因，該載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示)，酶切驗(yàn)證陽性克隆并檢測(cè)插入方向正確后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到水稻品種“中花11”中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)、侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻(粳稻亞種)遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人報(bào)道的方法(參見Efficient transformation οι rice, Oryza sativa L. , mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant Journal 6 :271-282,1994)并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行改良和優(yōu)化。主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫本發(fā)明中培養(yǎng)基所用到的植物激素的縮寫表示如下 6-BA(6-BenzyIaminoPurine,6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧節(jié)青霉素)； KT(Kinetin, 1 ] ) ；NAA(Napthalene acetic acid, ΜΖλΜ) ；IAA(Indole-3-acetic acid,吲哚乙酸)；2，4-DQ，4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4- ニ 氯苯氧乙酸)； AS (Acetosringone， Zj酉先了) ；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate,& )； HN (HygromycinB，潮霉素)；DMSO (Dimethyl Sulfoxide，ニ 甲基亞砜)；N6max (N6 大量成分溶液)；N6mix (N6微量成分溶液)；MSmax (MS大量成分溶液)；MSmix (MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方1)N6培養(yǎng)基大量元素母液[10倍濃縮液(IOX)]的配制硝酸鉀(KNO3)28. 3g磷酸ニ氫鉀(KH2PO4)4. Og硫酸銨((NH4)2SO4)4. 63g硫酸鎂(MgSO4· 7H20) 1. 85g氯化鈣(CaCl2· 2H20) 1. 66g逐一溶解，然后室溫下用蒸餾水定容至1000ml。2)N6培養(yǎng)基微量元素母液[100倍濃縮液(100X)]的配制碘化鉀(KI)0. 08g硼酸(H3BO3)0. 16g
硫酸錳(MnSO4· 4H20) 0. 44g硫酸鋅(ZnSO4· 7H20) 0. 15g室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。3)鐵鹽(Fe2EDTA)貯存液(100X)的配制準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙ニ銨四乙酸ニ鈉(Na2EDTA · 2H20) 3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小吋，用蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?)維生素貯存液(100X)配制
煙酸(Nicotinic acid)0. Ig
維生素 Bl (Thiamine HCl)0. Ig
維生素 B6(Pyridoxine HCl)0. Ig
甘氨酸(Glycine)0. 2g
肌醇(Inositol)IOg
用蒸餾水定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 5)MS培養(yǎng)基大量元素母液(IOX)的配制
硝酸銨(NH4NO3)16. 5g
硝酸鉀19. Og
磷酸ニ氫鉀1.7g
硫酸鎂3. 7g
氯化鈣4. 4g
室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。
6) MS培養(yǎng)基微量元素母液(100X)的配制
碘化鉀0. 083g
硼酸0. 62g
硫酸錳0. 86g
鉬酸鈉(Na2MoO4 · 2H20)0. 025g
硫酸銅(CuSO4 · 5H20)0. 0025g
室溫下溶解并用蒸餾水定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(lmg/ml)的配制
秤取2，4-D lOOmg，用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全
后定容至100ml，于室溫下保存。8)6_BA 貯存液(lmg/ml)的配制秤取6-BA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。9)萘乙酸(NAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取NAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)溆谩?0)吲哚乙酸(IAA)貯存液(lmg/ml)的配制秤取IAA IOOmg,用Iml IN氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加IOml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4°C保存?zhèn)湓讴`個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4 7H20) 2. 78g。在另ー個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水。11)葡萄糖貯存液(0. 5g/ml)的配制秤取葡萄糖125g，然后用蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4°C保存?zhèn)溆谩?2) AS貯存液的配制秤取AS 0. 392g, DMSO 10ml，分裝至I. 5ml離心管內(nèi)，4°C保存?zhèn)溆谩?3) IN氫氧化鉀貯存液秤取氫氧化鉀5. 6g,并用蒸懼水溶解定容至100ml,室溫保存?zhèn)溆谩?3)用于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基配方I)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.5ml脯氨酸(Proline)0. 3gCH0. 6g鹿糖(Sucrose)30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封ロ滅菌。2)繼代培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml2，4_D 貯存液2.0ml脯氨酸0. 5gCH0. 6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(25ml/瓶)，封ロ滅菌。3)預(yù)培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)12.5mlN6mix 母液(100X)1.25mlFe2+EDTA 貯存液(100X)2. 5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D 貯存液0.75mlCH0. 15g
蔗糖5g瓊脂粉(Agarose)1. 75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封ロ滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中Q5ml/皿)。
0118]4)共培養(yǎng)基0119]N6max 母液(IOX)12. 5ml0120]N6mix 母液(100X)1. 25ml0121] ^+EDTA 貯存液(100X)2. 5ml0122]維生素貯存液(100X)2. 5m 10123]2，4-D貯存液0. 75ml0124]CH0. 2g0125]蔗糖5g0126]瓊脂粉1.75g0127]加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 6，封ロ滅菌。使用前加熱溶解培養(yǎng)
基并加入5ml葡萄糖貯存液和250 μ 1 AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中Q5ml/每皿)。
0128]5)懸浮培養(yǎng)基0129]N6max 母液(IOX)5ml0130]N6mix 母液(100X)0. 5ml0131] ^+EDTA 貯存液(100X)0. 5ml0132]維生素貯存液(100X)Iml0133]2，4-D貯存液0. 2m 10134]CH0. 08g0135]蔗糖2g0136]加蒸餾水至IOOml，調(diào)節(jié)pH值到5. 4，分裝到兩個(gè)IOOml的三角瓶中，封ロ滅菌。使電前加入Iml葡萄糖貯存液和100 μ1 AS貯存液。0137]6)選擇培養(yǎng)基0138]N6max 母液(IOX)25ml0139]N6mix 母液(100X)2. 5ml0140] ^+EDTA 貯存液(100X)2. 5ml0141]維生素貯存液(100X)2. 5ml0142]2，4-D貯存液0. 625ml0143]CH0. 15g0144]蔗糖7. 5g0145]瓊脂粉1.75g0146]加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6. 0，封ロ滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基，加入250 μ 1
HN和400ppmCN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)25mlN6mix 母液(100X)2.5ml
Fe2+EDTA 貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml6-BA 貯存液0.5mlKT C存液0.5mlNAA C存液50 μ 1IAA C存液50 μ 1CH0. 15g蔗糖7. 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 9，封ロ滅菌。使用前溶解培養(yǎng)基， 加入250 μ 1 HN和200ppm CN,分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。8)分化培養(yǎng)基N6max 母液(IOX)IOOmlN6mix 母液(100X)IOmlFe2+EDTA 貯存液(100X)IOml維生素貯存液(100X)IOml6-BA 貯存液2mlKT C存液2mlNAA C存液0.2mlIAA 貯存液0.2mlCHIg蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分裝到 50ml三角瓶(50ml/瓶)，封ロ滅菌。9)生根培養(yǎng)基MSmax 母液(IOX)50mlMSmix 母液(100X)5mlFe2+EDTA 貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，IN氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5. 8。煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中05ml/管)，封ロ滅菌。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟1)愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞 (HgCl2)種子表面消毒15分鐘；(2)用滅菌水洗種子4-5次；
(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)將接種后的培養(yǎng)基置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25士 1°C。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度 25 士 1°C。預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度
25士 1°C。3)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105(購自澳大利 CAMBIA實(shí)驗(yàn)室，為商用菌株)兩天，溫度觀で；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小吋。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6J). 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，溫度 19-20 "C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，毎次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為 400ppm，第二次以后為250ppm)7)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度^TC。8)生根剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，光照下培養(yǎng)2-3周，溫度
260C ο9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入大田生長至收種。4、0sIP3KP啟動(dòng)子逆境誘導(dǎo)活性鑒定將0sIP3KP啟動(dòng)子(即SEQ ID NO :1所示DNA片段)控制⑶S報(bào)告基因構(gòu)建出的轉(zhuǎn)化載體OsIP3KP-DX218IG (見圖40sIP3KP-DX2181G)轉(zhuǎn)化上述所述的中花11，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在不同發(fā)育階段組織部位進(jìn)行了⑶S活性染色(染色液配方Na2HP04、NaH2PO0O. 2mol/ L Na3PO4 緩沖液，雙蒸水，0. 2mol/LN￡i2HP04，0· 2mol/L NaH2PO4 ;0· lmol/L K3 [Fe (CN)6]； 0. lmol/L K3 [Fe (CN) 6], 1 % triton χ-100 ；0. 5% X-Gluc)。通過 GUS 組織染色(染色方法 轉(zhuǎn)基因植株不同組織器官用染液于37°C恒溫箱中過夜染色，倒掉染色液加入脫色液處理后觀察拍照)，證實(shí)⑶S報(bào)告基因在正常生長條件下在愈傷、莖、葉舌、葉耳、雄蕊、雌蕊、穎殼和護(hù)穎有較低的GUS活性，在葉、莖各組織部位中有相對(duì)較高的GUS表達(dá)(見圖幻。發(fā)芽7 天后的幼苗在干旱及ABA處理后做⑶S染色，發(fā)現(xiàn)干早，及200μΜ脫落酸(ABA)處理后⑶S 有較高的活性(圖6)。5、0sIP3KP啟動(dòng)子逆境誘導(dǎo)活性鑒定本發(fā)明的實(shí)施方案就是構(gòu)建0sIP3KP啟動(dòng)子的GUS基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到水稻品種“中花11”中，定量地檢測(cè)0SIP3KP啟動(dòng)子在干旱誘導(dǎo)表達(dá)活性。具體操作如下申請(qǐng)人:采用構(gòu)建的0sIP3KP-DX2181G表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻“中花1”，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株18株；不連接外源片段的DX2181G空載體轉(zhuǎn)化水稻“中花11中”得到轉(zhuǎn)基因陽性植株8株。選取3個(gè)轉(zhuǎn)啟動(dòng)子陽性家系和1個(gè)轉(zhuǎn)空載體DX2181G陽性對(duì)照家系對(duì)Tl代種子進(jìn)行潮霉素(HN)抗性篩選發(fā)芽試驗(yàn)，將發(fā)芽的上述水稻苗一部分種于小紅桶的沙土內(nèi)長至4 葉期用做干旱脅迫試驗(yàn)，一部分種于小方盒內(nèi)長至4葉期用做干旱脅迫試驗(yàn)。其中干旱脅迫方法如實(shí)施例2中所述，取脅迫前(記為DR0)，葉片微卷(干旱脅迫一天，記為DRl)，葉片半卷(干旱脅迫2天，記為DR2)，葉片全卷(干旱脅迫3天，記為DR3，得到四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，每份樣品取自該家系的混合樣(不少于10株)。樣品用液氮磨樣，通過⑶S抽提液(50mM Na2HPO4, pH7. 0, IOmM β -mercaptoethanol, IOmM Na2EDTA,0. 1% Sarkosyl,0. 1% Triton-100)抽提總蛋白，從樣品中取出一定量的蛋白著進(jìn)行GUS活性定量分析。通過分析熒光結(jié)果獲得原樣品的GUS 比醇活。具體步驟如下通過Bradford法(參見A rapid andsensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding. 1976，Anal Biochem，72 :248-254)測(cè)得樣品的總蛋白濃度，再根據(jù)測(cè)定的總蛋白濃度用移液器量取一定體積的相同質(zhì)量約IOug的總蛋白，向其中加入0. 4ml GUS 提取緩沖液(5OmMNa2HPO4 [PH 7. 0],10mM β -mercaptoethanol, IOmM Na2-EDTA, 0. 1% sarkosyl，1 % Triton X-100)、10 μ 1 40mM 底物 4-甲基微型酮-葡萄糖醛酸苷(MUG) (4_me thylumbelifferyl-β -D-glucuronide)在 37°C 水浴(lh 以內(nèi))后，加入 1. 6ml 反應(yīng)終止液 (0. 2M Na2CO3)；每個(gè)反應(yīng)設(shè)置三個(gè)重復(fù)。用Tecan光柵型酶標(biāo)儀(型號(hào)infinite M200) 測(cè)量各個(gè)樣品在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm處的熒光值，同時(shí)以50nM MU的熒光值作為參比，進(jìn)而通過以上數(shù)據(jù)計(jì)算出各個(gè)樣品中⑶S蛋白的比酶活，S卩Iug總蛋白毎分鐘反應(yīng)底物 MU的量(単位pmol MU/min/ug protein)。通過⑶S蛋白活性定量測(cè)量發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明克隆的 0sIP3KP啟動(dòng)子控制下的GUS蛋白活性受到干旱脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，在獨(dú)立轉(zhuǎn)基因家系中GUS 蛋白在葉片全卷時(shí)的活性是脅迫前的約7至8倍(如圖7)。這ー結(jié)果再次證實(shí)0sIP3KP啟動(dòng)子是ー個(gè)干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可以用于目標(biāo)基因的干旱誘導(dǎo)性表達(dá)。
權(quán)利要求
1.一種被干旱誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子0sIP3KP，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子0sIP3KP在控制基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子0sIP3KP在控制基因在干旱誘導(dǎo)表達(dá)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及分離、克隆和通過功能驗(yàn)證得到一種受非生物逆境(干旱，高鹽，脫落酸ABA)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子OsIP3KP，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，序列長度為2119bp。該啟動(dòng)子能夠提高抗逆相關(guān)基因在非生物逆境環(huán)境中特異表達(dá)，應(yīng)用于遺傳改良水稻抵抗非生物逆境的能力。本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增及融合報(bào)告基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，克隆到控制水稻非生物逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子OsIP3KP，通過realtime-PCR，報(bào)告基因GUS染色觀察及酶活測(cè)定，證明本發(fā)明克隆的啟動(dòng)子受非生物逆境(干旱，高鹽，ABA)誘導(dǎo)，可應(yīng)用于水稻等植物的遺傳改良。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102586247SQ20111000488
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者熊立仲, 都浩 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)