專利名稱：用于控制秋粘蟲(chóng)和歐洲玉米螟的殺蟲(chóng)蛋白組合和用于昆蟲(chóng)抗性管理的方法
用于控制秋粘蟲(chóng)和歐洲玉米螟的殺蟲(chóng)蛋白組合和用于昆蟲(chóng)抗性管理的方法背景人類種植作物用于食物和能源應(yīng)用。昆蟲(chóng)吃掉并毀壞谷物植物從而破壞了人類的努力。造成谷物的主要破壞的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)是秋粘蟲(chóng)(FAW, Spodoptera frugiperda)和歐洲玉米螟(ECB, Ostrinia nubilalis)。當(dāng)前用植物內(nèi)(in-plant)轉(zhuǎn)基因控制這些害蟲(chóng)是通過(guò)使植物表達(dá)來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的編碼CrylFa蛋白的晶體(Cry) 6內(nèi)毒素基因?qū)崿F(xiàn)的。CrylFa是一種蛋白毒素，目前在 Dow AgroSciences 的 Herculex 牌的轉(zhuǎn)基因作物種子(Herculex, Herculex-Extra,和Herculex-RW)中存在，其對(duì)FAW和ECB害蟲(chóng)有抗性。這種蛋白通過(guò)與位于昆蟲(chóng)中腸內(nèi)的特異受體結(jié)合發(fā)揮作用，并在腸細(xì)胞內(nèi)形成孔。這些孔的形成使昆蟲(chóng)不能調(diào)節(jié)滲透壓平衡，而導(dǎo)致它們死亡。
然而，一些人擔(dān)心昆蟲(chóng)可能通過(guò)其腸道內(nèi)與CrylFa結(jié)合的受體的遺傳改變而能夠形成對(duì)CrylFa活性的抗性?？僧a(chǎn)生與CrylFa結(jié)合能力降低的受體的昆蟲(chóng)會(huì)對(duì)CrylFa的活性具有抗性，因此在表達(dá)這種蛋白的植物上存活下來(lái)。在生長(zhǎng)條件下植物中持續(xù)存在單一的Cry毒素，關(guān)注的是昆蟲(chóng)能夠通過(guò)其腸道內(nèi)與CrylFa毒素結(jié)合的受體的遺傳改變而形成對(duì)這種蛋白的活性的抗性。由于受體的這些改變導(dǎo)致的與毒素的結(jié)合降低會(huì)使CrylFa的毒性減小，可能最終使在作物內(nèi)表達(dá)時(shí)，這種蛋白的有效性降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明部分地涉及將某些Cry基因與CtylFa混雜，從而使所得產(chǎn)物更加持久并且使引發(fā)昆蟲(chóng)對(duì)該產(chǎn)物中任一毒素(例如CtylFa)的活性產(chǎn)生抗性的傾向性更低(andless prone towards insects developing resistance towards the acivity of any ofthe toxins (such as CrylFa)by itself)。CrylF 混雜對(duì)(stacking partner)的實(shí)例包括Cry2Aa和/或針對(duì)秋粘蟲(chóng)(FAW; Spodoptera frugiperda)的CrylI和針對(duì)歐洲玉米螟(ECB;0strinia nubilalis)的 CrylE0發(fā)明詳述本發(fā)明包括使用至少一種混雜對(duì)毒素與CiylFa毒素作為一對(duì)。針對(duì)FAW(秋粘蟲(chóng)；Spodoptera frugiperda)的一些優(yōu)選配對(duì)是CrylFa蛋白+CrylEa蛋白。針對(duì)ECB(歐洲玉米螟；Ostrinia nubilalis)的一些優(yōu)選配對(duì)包括CrylFa蛋白+CrylI和/或Cry2Aa蛋白本發(fā)明還部分地涉及三種(或更多種)毒素的三重混雜或者“錐形混雜(pyramids) ”，其中以CrylFa和一種混雜對(duì)毒素作為基礎(chǔ)配對(duì)(base pair)。優(yōu)選的錐形混雜針對(duì)兩種害蟲(chóng)(即FAW和ECB)提供了兩種作用模式?！?M0A”型錐形混雜包括Cry lFa+Cry2Aa+Cry IAb ( 一種用于控制ECB的優(yōu)選實(shí)施方案)，和CrylFa+CrylEa ( —種用于控制FAW的優(yōu)選實(shí)施方案)。“分離的作用模式”的意思是蛋白彼此之間不會(huì)引起交叉抗性。在一些優(yōu)選的錐形混雜實(shí)施方案中，所選毒素可針對(duì)ECB提供三種分離的作用模式(活性成分不會(huì)產(chǎn)生交叉抗性)。優(yōu)選的錐形混雜組合是CrylFa+第二種IRM毒素+第三種IRM毒素。這樣的實(shí)施例如下。本發(fā)明的ECB錐形混雜包括CrylFa+作為第二 IRM毒素的Cry2Aa毒素+ —種第三IRM毒素，其從由CrylBe，CrylAb, DIG-3和CrylI毒素組成的組中選出。本發(fā)明的ECB錐形混雜包括CrylFa毒素+作為第二 IRM毒素的CrylI毒素+ —種第三IRM毒素，其從由CrylAb，CrylBe, DIG-3和Cry2Aa毒素組成的組中選出。各種毒素(及其它)在所附的附錄A中列出。那些GENBANK號(hào)還可用于獲得本文公開(kāi)或提到的任何基因和蛋白的序列。也可使用一些專利獲得相關(guān)的序列。例如，美國(guó)專利No. 5，188，960和美國(guó)專 利No. 5，827，514描述了適用于執(zhí)行本發(fā)明的含Cry IFa核心毒素的蛋白質(zhì)。美國(guó)專利No. 6，218，188描述了編碼適用于本發(fā)明的含CrylFa核心毒素的蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化DNA序列。US 2010-00269223 涉及 DIG-3 蛋白。本發(fā)明還一般地涉及使用三種殺蟲(chóng)蛋白(在一些優(yōu)選實(shí)施方案中是Cry蛋白)，它們不會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)，不會(huì)產(chǎn)生交叉抗性，但對(duì)單一的靶害蟲(chóng)有活性?？僧a(chǎn)生任意目標(biāo)對(duì)或者三種(或者更多種)毒素的植物(和種植有這些植物的田畝(acreage))均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。也可以添加額外的毒素/基因，但是根據(jù)本發(fā)明，這些特定的三重混雜可以針對(duì)FAW和/或ECB有利地并且令人驚訝地提供三種作用模式(非交叉抗性活性)。這有助于降低或者消除避難所田畝的需要(例如少于40%，少于20%，少于10%，少于5%，或者甚至0%避難所)。因此覆蓋(over) 10英畝的種植田地包含在本發(fā)明之內(nèi)。本多核苷酸優(yōu)選地位于在非蘇云金芽孢桿菌啟動(dòng)子控制下(與之可操作連接/包含)的遺傳構(gòu)建體內(nèi)。本多核苷酸可以包括植物密碼子選擇，以提高在植物中表達(dá)。為了抵抗昆蟲(chóng)產(chǎn)生針對(duì)CrylFa的抗性的能力，我們鑒定了(與CrylFa)非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FAW和/或ECB腸細(xì)胞制備物的Cry毒素。在FAW和ECB幼蟲(chóng)的昆蟲(chóng)腸內(nèi)，CrylFa不會(huì)取代本發(fā)明所鑒定的Cry蛋白與Cry蛋白例如Cry2Aa的結(jié)合。這些Cry毒素對(duì)FAW和/或ECB幼蟲(chóng)有毒性的能力但作用位點(diǎn)與CrylFa不完全相同，顯示出它們的毒性不會(huì)受到作為機(jī)制已經(jīng)在CrylFa受體發(fā)生遺傳改變從而對(duì)CrylFa的毒性變得有抗性的昆蟲(chóng)的影響。因此,通過(guò)降低其腸受體與CrylFa的結(jié)合能力從而產(chǎn)生對(duì)CrylFa抗性的昆蟲(chóng)仍然對(duì)例如結(jié)合不同位點(diǎn)的Cry2Aa蛋白的毒性易感。我們已經(jīng)獲得了支持這個(gè)觀點(diǎn)的生化數(shù)據(jù)。因此，在轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)表達(dá)這些蛋白的組合提供了一種有用并且很有價(jià)值的機(jī)制，可降低田地內(nèi)昆蟲(chóng)產(chǎn)生抗性的可能性，從而導(dǎo)致減少對(duì)避難所的需求。已經(jīng)研究了其它Cry蛋白針對(duì)其他主要蟲(chóng)害(無(wú)論是對(duì)CrylFa敏感的還是抗性的(rFAW和rECB))的活性。如表I所示，CrylI和Cry2Aa對(duì)抗性和易感的ECB幼蟲(chóng)均有活性。CrylEa對(duì)抗性和易感的FAW均有活性?？梢垣@得這些Cry毒素針對(duì)這些害蟲(chóng)的結(jié)合數(shù)據(jù)。在任何情況下，本發(fā)明下面所述的數(shù)據(jù)顯示了在昆蟲(chóng)腸內(nèi)與CrylFa相比在不同靶位點(diǎn)相互作用的毒素，因此可以制成優(yōu)異的混雜配對(duì)。將表達(dá)CrylFa的作物與一種或多種額外的Cry基因混雜，例如本文所述的那些Cry基因，可以產(chǎn)生一種有效的管理策略，防止昆蟲(chóng)對(duì)表達(dá)這些蛋白毒素的轉(zhuǎn)基因植物的活性產(chǎn)生抗性的能力。因?yàn)槲覀冿@示這些Cry蛋白在與CrylFa相比不同和/或重疊的位點(diǎn)相互作用，所以如果要通過(guò)改變與Cry毒素結(jié)合的昆蟲(chóng)腸道受體的親和性而發(fā)生抗性，則該變化必須同時(shí)在至少兩個(gè)不同的受體上發(fā)生以使昆蟲(chóng)在表達(dá)多種蛋白的植物上存活。發(fā)生這種情況的概率極小，因此增加了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物針對(duì)能夠?qū)@些蛋白產(chǎn)生抗性的昆蟲(chóng)的耐久性。我們放射性碘化標(biāo)記了(radio-iodinated)Cry蛋白毒素的胰蛋白酶截短形式，并使用放射性受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)技術(shù)測(cè)量了它們與位于昆蟲(chóng)腸膜內(nèi)的推定受體蛋白的結(jié)合相互作用。這些腸膜通過(guò)Wolfersberger的方法制備成刷狀緣膜泡(brush border membranevesicle, BBMV)。毒素的碘化標(biāo)記使用來(lái)自Pierce Chemicals的碘珠或Iodogen (非水溶性碘化試劑)處理的管進(jìn)行。放射性標(biāo)記毒素的比活性為大約HiiCi/yg蛋白。結(jié)合試驗(yàn)基本上按照Liang的步驟進(jìn)行。這里提供的數(shù)據(jù)顯示，毒素在昆蟲(chóng)腸道內(nèi)在與CrylFa相比不同的靶位點(diǎn)相互作 用，因此可以制備優(yōu)異的混雜對(duì)。本發(fā)明可以用于多種植物。實(shí)例包括谷物(玉米)、大豆和棉花?？捎糜诒景l(fā)明的基因和毒素不僅包括公開(kāi)的全長(zhǎng)序列，還包括保留了本發(fā)明具體例示的毒素的特征殺蟲(chóng)活性的這些序列的片段、變體、突變體以及融合蛋白。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)基因“變體”或“變異”是指編碼相同毒素或者編碼具有殺蟲(chóng)活性的等價(jià)毒素的核苷酸序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“等價(jià)毒素”是指對(duì)靶害蟲(chóng)具有與所要求保護(hù)的毒素相同或基本上相同的生物活性的毒素。如本文所使用的，邊界表示大約95%(例如CrylFa的)、78%(例如CrylF的)和 45%(Cryl 的)序列同一性，參見(jiàn) “Revision of the Nomenclature for theBacilus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins,，，N. Crickmore, D. R. Zeigler,J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum,和 D. H. Dean. Microbiology andMolecular Biology Reviews (1998) Vol 62:807-813。這些截?cái)嘀?cut offs)也可僅應(yīng)用于核心蛋白(例如CrylF和CrylFa核心蛋白)。參見(jiàn)相關(guān)的Crickmore等，網(wǎng)址為Iifesci.sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/。保留了例示的毒素的殺蟲(chóng)活性的片段和等價(jià)物也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，由于遺傳密碼的冗余，多種不同的DNA序列可以編碼本文所公開(kāi)的氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以生成這些編碼相同的或者基本上相同的毒素的可替換的DAN序列。這些變體DNA序列也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。如本文所使用的，“基本上相同的”序列是指具有不會(huì)實(shí)質(zhì)上影響殺蟲(chóng)活性的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。編碼保留了殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的基因片段也包含在這個(gè)定義內(nèi)。另一種用于鑒定根據(jù)本發(fā)明有用的編碼毒素的基因和基因部分的方法是通過(guò)使用寡核苷酸探針。這些探針是可檢測(cè)的核苷酸序列。這些序列可以通過(guò)用合適的標(biāo)記加以檢測(cè)或者可制成固有地發(fā)熒光，如國(guó)際申請(qǐng)No. W093/16094中所述。如本領(lǐng)域眾所熟知的，如果探針?lè)肿优c核酸樣品通過(guò)在兩分子之間形成強(qiáng)鍵而雜交，則有理由假定，探針和樣品具有相當(dāng)?shù)耐葱浴?yōu)選地，雜交通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，如例如在Keller, G. H. , M. M. Manak(1987)DNA Probes, Stockton Press, New York, N. Y. , pp. 169-170中所述。鹽濃度和溫度組合的一些實(shí)例如下(按照嚴(yán)格性增強(qiáng)的順序)2X SSPE或SSC，室溫；1X SSPE 或 SSC, 420C ；0. IX SSPE 或 SSC, 42°C ；0. IX SSPE 或 SSC, 650C0 探針的檢測(cè)提供了一種用已知的方式確定雜交是否發(fā)生的方法。這種探針?lè)治鎏峁┝擞糜阼b定本發(fā)明毒素編碼基因的快速方法。根據(jù)本發(fā)明用作探針的核苷酸區(qū)段可以用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的步驟合成。這些核苷酸序列也可以用作PCR引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因。本文特別例示了本發(fā)明的某些蛋白質(zhì)。因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)僅僅是本發(fā)明蛋白質(zhì)的實(shí)例，因此應(yīng)當(dāng)顯而易見(jiàn)，本發(fā)明包括具有與例示蛋白質(zhì)相同或相似殺蟲(chóng)活性的變體或等價(jià)蛋白(和編碼等價(jià)蛋白的核苷酸序列)。等價(jià)蛋白質(zhì)與例示蛋白質(zhì)具有氨基酸同源性。該氨基酸同源性通常為大于75%,優(yōu)選大于90%,最優(yōu)選大于95%。氨基酸同源性在蛋白的關(guān)鍵區(qū)域最高，所述關(guān)鍵區(qū)域決定其生物活性或者涉及最終負(fù)責(zé)生物活性的三維構(gòu)型的確定。在此方面，某些氨基酸取代是可以接受的，并且如果這些取代位于對(duì)于活性非關(guān)鍵的區(qū)域內(nèi)或者是不影響分子三維構(gòu)型的保守氨基酸取代的話，其是可以預(yù)期的。例如，氨基酸可以在下面的分類中被替換非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要取代不會(huì)實(shí)質(zhì)改變化合物的生物活性，一個(gè)類型的氨基酸被相同類型的另一種氨基酸代替的保守取代就屬于本發(fā)明的范圍。下面是屬于每種類型的氨基酸的實(shí)例的列表。在一些情況下，也可以進(jìn)行非 保守取代。關(guān)鍵的因素是這些取代不會(huì)顯著降低蛋白的生物活性。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包括編碼CrylFa殺蟲(chóng)蛋白的DNA和編碼選自Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白和CrylI殺蟲(chóng)蛋白的第二殺蟲(chóng)蛋白的DNA。
2.—種轉(zhuǎn)基因植物，包括編碼CrylFa殺蟲(chóng)蛋白的DNA和編碼CrylE殺蟲(chóng)蛋白的DNA。
3.權(quán)利要求I的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包括編碼第三殺蟲(chóng)蛋白的DNA，所述第三蛋白選自 CrylBe, CrylAb 和 DIG-3。
4.權(quán)利要求3的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述第三蛋白選自CrylBe，所述植物進(jìn)一步包括編碼第四殺蟲(chóng)蛋白的DNA，其選自Cry ICa、CrylDa和Vip3Ab。
5.權(quán)利要求2的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物進(jìn)一步包括編碼第三殺蟲(chóng)蛋白的DNA，所述第三蛋白選自 CrylBe、Cry I Ca > CrylDa 和 Vip3Ab。
6.權(quán)利要求5的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述第三蛋白選自CrylBe，所述植物進(jìn)一步包括編碼第四殺蟲(chóng)蛋白的DNA，其選自Cry IAb、Cry 11、Cry2A和DIG-3。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的植物的種子，其中所述種子包括所述DNA。
8.—種植物田，其包括非Bt避難所植物(refuge plant)和多個(gè)根據(jù)權(quán)利要求1_6中任一項(xiàng)的植物,所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的不到40%。
9.權(quán)利要求8的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的不到30%。
10.權(quán)利要求8的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的不到20%。
11.權(quán)利要求8的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的不到10%。
12.權(quán)利要求8的植物田，其中所述避難所植物占所述田地中全部作物植物的不到5%。
13.權(quán)利要求8的植物田，其中所述避難所植物成塊狀或條狀種植。
14.一種種子混合物，包括來(lái)自非Bt避難所植物的避難所種子和多個(gè)權(quán)利要求7的種子，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的不到40%。
15.權(quán)利要求14的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的不到30%。
16.權(quán)利要求14的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的不到20%。
17.權(quán)利要求14的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的不到10%。
18.權(quán)利要求14的種子混合物，其中所述避難所種子占混合物中全部種子的不到5%。
19.一種管理昆蟲(chóng)對(duì)Cry蛋白產(chǎn)生抗性的方法，所述方法包括種植種子以產(chǎn)生權(quán)利要求8的植物田。
20.權(quán)利要求8-13中任一項(xiàng)的田，其中所述植物占地超過(guò)10英畝。
21.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的植物，其中所述植物選自玉米、大豆和棉花。
22.權(quán)利要求21的植物，其中所述植物是玉米植物。
23.一種控制歐洲玉米螟的方法，使所述昆蟲(chóng)與CrylF殺蟲(chóng)蛋白和第二殺蟲(chóng)蛋白相接觸，所述第二殺蟲(chóng)蛋白選自Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白和CrylI殺蟲(chóng)蛋白。
24.一種分離的多核苷酸，其編碼CrylF殺蟲(chóng)蛋白與第二殺蟲(chóng)蛋白的組合，所述第二殺蟲(chóng)蛋白選自Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白和CrylI殺蟲(chóng)蛋白。
25.—種使CrylF殺蟲(chóng)蛋白與第二種從由Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白和CrylI殺蟲(chóng)蛋白組成的組中選出的殺蟲(chóng)蛋白相組合的方法。
26.—種控制秋粘蟲(chóng)的方法,使所述昆蟲(chóng)與CrylF殺蟲(chóng)蛋白和CrylE殺蟲(chóng)蛋白接觸。
27.—種分離的多核苷酸,其編碼CrylF殺蟲(chóng)蛋白與CrylE殺蟲(chóng)蛋白的組合。
28.—種使CrylF殺蟲(chóng)蛋白與CrylE殺蟲(chóng)蛋白相組合的方法。
29.權(quán)利要求I的植物的植物細(xì)胞，其中所述CrylFa殺蟲(chóng)蛋白與SEQIDNO: I為至少99%同一，所述Cry2Aa殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO: 2為至少99%同一，并且所述CrylI殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID NO:3為至少99%同一。
30.權(quán)利要求2的植物的植物細(xì)胞，其中所述CrylFa殺蟲(chóng)蛋白與SEQIDNO: I為至少99%同一，并且所述CrylE殺蟲(chóng)蛋白與SEQ ID N0:4為至少99%同一。
全文摘要
本發(fā)明部分地涉及將某些Cry基因與Cry 1Fa混雜(stacking)，從而使所得產(chǎn)物更加持久并且使引發(fā)昆蟲(chóng)對(duì)該產(chǎn)物中任一毒素(例如Cry1Fa)的活性產(chǎn)生抗性的傾向性更低。Cry1F混雜對(duì)的實(shí)例包括Cry2Aa、Cry 1I和Cry1E。這些混雜可用于如本文所述地控制FAW和/或ECB。
文檔編號(hào)A01P7/00GK102753012SQ201080063822
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月16日
發(fā)明者J.J.希茨, K.納瓦, N.P.斯托爾, S.L.伯頓, T.米德 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司