亞洲玉米螟OfAK基因及其編碼蛋白和OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法
【專利摘要】亞洲玉米螟OfAK基因及其編碼蛋白和OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法，它涉及玉米螟OfAK基因片段及其RNAi干擾載體，本發(fā)明提供亞洲玉米螟精氨酸激酶部分cDNA序列及其RNAi干擾載體工程菌株構(gòu)建，目的為降低亞洲玉米螟對(duì)幾種殺蟲(chóng)劑的耐受性，增強(qiáng)玉米自身防御反應(yīng)對(duì)亞洲玉米螟的作用，減少田間殺蟲(chóng)劑使用。本發(fā)明亞洲玉米螟OfAK基因序列如序列表Seq?ID?No：1所示。亞洲玉米螟OfAK基因編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq?ID?No：2所示。本發(fā)明OfAK基因RNAi干擾菌株，降低亞洲玉米螟對(duì)幾種殺蟲(chóng)劑的耐受性，增強(qiáng)玉米自身防御反應(yīng)對(duì)亞洲玉米螟的作用，滿足綠色農(nóng)業(yè)、安全農(nóng)業(yè)的要求。
【專利說(shuō)明】亞洲玉米螟OfAK基因及其編碼蛋白和OfAK基因RNA i干擾
工程菌株構(gòu)建的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及亞洲玉米螟OfAK基因及其編碼蛋白和OfAK基因干擾工程菌株構(gòu)建?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]亞洲玉米螟分布廣泛，分布于在我國(guó)華北、東北、西北地區(qū)等糧食產(chǎn)區(qū)。據(jù)推測(cè)，春玉米受玉米螟危害減產(chǎn)量達(dá)7-10%，夏玉米減產(chǎn)達(dá)15%左右。在東北，玉米螟的危害尤其嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)2011年，齊齊哈爾玉米螟發(fā)生面積為79.84萬(wàn)hm2，占全市玉米播種面積的72.58%，造成玉米產(chǎn)量損失8.4萬(wàn)噸。同時(shí)亞洲玉米螟的危害也顯著加重了玉米病害的發(fā)生。
[0003]精氨酸激酶(ArginineKinaSe，AK，EC2.7.3.3)為磷酸源激酶家族一員。廣泛存在于昆蟲(chóng)中。該酶在昆蟲(chóng)體內(nèi)的能量貯存與代謝中起到重要作用。通過(guò)催化ATP和精氨酸之間的可逆反應(yīng)，可將能量貯存于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中。精氨酸激酶在昆蟲(chóng)與昆蟲(chóng)肌肉收縮和細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)運(yùn)中起到重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供的是亞洲玉米螟精氨酸激酶的部分cDNA序列及其RNAi干擾載體工程菌株構(gòu)建的方法，目的增強(qiáng)玉米自身防御反應(yīng)及幾種農(nóng)藥對(duì)亞洲玉米螟的毒殺作用，減少田間高效氯氰菊酯的使用量，為綠色農(nóng)業(yè)和昆蟲(chóng)防治提供一條新的途徑。
[0005]本發(fā)明的亞洲玉米螟OfAK基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No:1所示。
[0006]本發(fā)明的亞洲玉米螟OfAK基因編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所
/Jn ο
[0007]本發(fā)明的亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法，它的構(gòu)建方法如下:
[0008]一、OfAK基因克隆
[0009]以由亞洲玉米螟三齡幼蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為PCR模板，采用如下引物:
[0010]Pl，5，-GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3，；
[0011]P2，5 ’ -GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3，；
[0012]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，回收純化PCR產(chǎn)物；
[0013]二、OfAK基因干擾工程菌株的構(gòu)建
[0014] 使用BgI II和Hind III分別酶切步驟一回收純化的PCR產(chǎn)物和L4440載體，對(duì)酶切后的PCR產(chǎn)物和L4440載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌HTl 15感受態(tài)細(xì)胞中，將驗(yàn)證為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功的菌株，即為亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株。
[0015]本發(fā)明包含以下有益效果:
[0016]本發(fā)明的OfAK基因能夠有效的殺死亞洲玉米螟，這是因?yàn)樵趲追N殺蟲(chóng)劑的作用過(guò)程中，OfAK通過(guò)抑制昆蟲(chóng)肌肉的能量供應(yīng)，降低昆蟲(chóng)的運(yùn)動(dòng)能力。使昆蟲(chóng)無(wú)法趨避殺蟲(chóng)劑。同時(shí)，阻礙亞洲玉米螟運(yùn)動(dòng)，使蟲(chóng)體產(chǎn)生新的神經(jīng)沖動(dòng)，從而增強(qiáng)幾種農(nóng)藥的作用。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0017]圖1為【具體實(shí)施方式】三中OfAK片段克隆電泳結(jié)果圖；其中，M為MarkerDL2000條帶，10為OfAK片段電泳條帶；
[0018]圖2為【具體實(shí)施方式】三中重組載體L4440_0fAK酶切鑒定電泳圖；M為Marker條帶，I為重組載體L4440-0fAK酶切電泳圖；
[0019]圖3為【具體實(shí)施方式】三中重組工程菌株HT115-L4440-0fAKPCR鑒定結(jié)果電泳圖；其中，M為Marker條帶；
[0020]圖4為【具體實(shí)施方式】三中HT115_0fAK RNAi干擾工程菌對(duì)玉米防御反應(yīng)的增效作用圖；
[0021]圖5為【具體實(shí)施方式】三中HT115_0fAK RNAi干擾工程菌對(duì)氯蟲(chóng)腈的增效作用圖；
[0022]圖6為【具體實(shí)施方式】三中HT115_0fAK RNAi干擾工程菌對(duì)溴蟲(chóng)腈的增效作用圖；
[0023]圖7為【具體實(shí)施方式】三中HT115_0fAK RNAi干擾工程菌對(duì)該高效氯氰菊酯的增效作用圖；
[0024]圖8為亞洲玉米螟取食響應(yīng)過(guò)程中精氨酸激酶表達(dá)水平半定量驗(yàn)證電泳圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0025]【具體實(shí)施方式】一:本實(shí)施方式的亞洲玉米螟OfAK基因的核苷酸序列如序列表SeqID No:1 所示。
[0026]本實(shí)施方式的亞洲玉米螟OfAK基因的cDNA片段共計(jì)1064bp，與預(yù)期一致；保守結(jié)構(gòu)域分析表明此基因片段屬于磷酸激酶超家族。包括ADP結(jié)合位點(diǎn)、磷酸結(jié)合位點(diǎn)，特異性底物結(jié)合位點(diǎn)。經(jīng)Blast分析表明此基因片段的閱讀框?yàn)?1，共編碼354個(gè)氨基酸，OfAK基因表達(dá)的氣基酸序列如Seq ID No:2所不。
[0027]本實(shí)施方式的亞洲玉米螟幼蟲(chóng)取食響應(yīng)中OfAK基因表達(dá)特異性分析:
[0028]分別提取取食正常玉米葉片的亞洲玉米螟中腸的總RNA和取食經(jīng)茉莉酸誘導(dǎo)亞洲玉米螟三齡幼蟲(chóng)中腸的總RNA，分別進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)三次重復(fù)，并對(duì)其亮度進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)OfAK基因表達(dá)情況，結(jié)果見(jiàn)圖1所示，由圖1可知OfAK基因片段大小為 1064bp。
[0029]【具體實(shí)施方式】二:本實(shí)施方式的亞洲玉米螟OfAK基因編碼蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No:2所示。
[0030]本實(shí)施方式的亞洲玉米螟OfAK基因編碼蛋白的氨基酸序列，共計(jì)354個(gè)氨基酸。本實(shí)施方式的氨基酸序列包含一個(gè)保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。
[0031]【具體實(shí)施方式】三:本實(shí)施方式的亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法，它的構(gòu)建方法如下:
[0032]一、OfAK基因克隆
[0033]以由亞洲玉米螟三齡幼蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為PCR模板，采用如下引物:
[0034]PI，5，-GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3，；
[0035]P2，5’ -GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3’ ；[0036]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，回收純化PCR產(chǎn)物；
[0037]二、OfAK基因干擾工程菌株的構(gòu)建
[0038]使用BgI II和Hind III分別酶切步驟一回收純化的PCR產(chǎn)物和L4440載體，對(duì)酶切后的PCR產(chǎn)物和14440載體進(jìn)行連接，得重組載體1^4440-0伙1(，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌!11'115感受態(tài)細(xì)胞中，得重組工程菌株HT115-L4440-0fAK，將PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功的菌株，即為亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株(以下稱為HT115-0fAK RNAi干擾工程菌)。
[0039]本實(shí)施方式的BgI II和Hind III是市售產(chǎn)品，酶切體系參見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。本實(shí)施方式的PCR產(chǎn)物和L4440載體的連接采用市售的T4連接酶進(jìn)行連接，連接體系詳見(jiàn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。
[0040]本實(shí)施方式步驟一中純化PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖1所示，由圖1可知，圖中右邊泳道的條帶即為PCR產(chǎn)物，即OfAK基因(大小為1064bp);其中，M為購(gòu)買自Takara公司的DL2000。
[0041]圖2為【具體實(shí)施方式】三中重組載體L4440_0fAK酶切鑒定電泳圖；從圖2可知，酶切后的OfAK基因大小為1064bp，說(shuō)明重組載體L4440-0fAK構(gòu)建成功。
[0042]圖3為【具體實(shí)施方式】三中重組工程菌株HT115-L4440_0fAK PCR鑒定結(jié)果電泳圖，從圖3可知重組工程菌株HT115-L4440-0fAK構(gòu)建成功。
[0043]【具體實(shí)施方式】四:本實(shí)施方式與【具體實(shí)施方式】三不同的是:步驟一中所述的PCR反應(yīng)條件如下:
[0044]PCR反應(yīng)體系為:
[0045]
【權(quán)利要求】
1.亞洲玉米螟OfAK基因，其特征在于所述的亞洲玉米螟OfAK基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No:1所示。
2.亞洲玉米螟OfAK基因編碼的蛋白，其特征在于所述的亞洲玉米螟OfAK基因編碼蛋白的氣基酸序列如序列表Seq ID No:2所不。
3.亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法，其特征在于它的構(gòu)建方法如下: 一、OfAK基因克隆 以由亞洲玉米螟三齡幼蟲(chóng)總RNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA為PCR模板，采用如下引物:
Pl，5’ -GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3’ ；
P2，5’ -GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3’ ； 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后，純化PCR產(chǎn)物，回收純化PCR產(chǎn)物； 二、OfAK基因干擾工程菌株的構(gòu)建 使用BgI II和Hind III分別酶切步驟一回收純化的PCR產(chǎn)物和L4440載體，對(duì)酶切后的PCR產(chǎn)物和L4440載體進(jìn) 行連接，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌HTl 15感受態(tài)細(xì)胞中，將驗(yàn)證為陽(yáng)性的克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序成功的菌株，即為亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的亞洲玉米螟OfAK基因RNAi干擾工程菌株構(gòu)建的方法，其特征在于步驟一中所述的PCR反應(yīng)條件如下: PCR反應(yīng)體系為: 成分用量
I HgZLiL UcDNA4μ?

20pmol4iL 引物



lμL
Pl, 5，-GTAGATCTATGGTGGACGCCGCAAC-3，

20pmoL^L 引物



IpL
P2，5 ’-GGAAGCTTGATCAGTTCAGCGATGCC-3 ’
I OxEx Taq BuHcr5μ?
dNTP3μ?
ExTaqDNA 聚合酶Ιμ?
無(wú)菌水35pL PCR程序如下:94°C預(yù)變性10min，94°C變性lmin，55.8°C退火lmin，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，再72°C延伸10min，4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK103710352SQ201410001379
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】趙丹丹, 楊澤眾, 劉春光, 張一桐, 李大飛, 陳思學(xué), 楊峰山 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)