專利名稱：：具有鱗翅目活性的新的蘇云金芽孢桿菌基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從新的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)基因獲得的天然存在的核酸和重組核酸，所述基因編碼以針對(duì)害蟲的殺蟲活性為特征的殺蟲多肽。本發(fā)明的組合物和方法使用所公開的核酸及其所編碼的殺蟲多肽來控制植物害蟲。
背景技術(shù)：
：害蟲是世界農(nóng)作物損失的主要因素。例如，粘蟲進(jìn)食、黑切根蟲損害或歐洲玉米螟損害可以在經(jīng)濟(jì)上摧毀農(nóng)業(yè)生產(chǎn)者。僅歐洲玉米螟攻擊田地和甜玉米帶來的害蟲相關(guān)的農(nóng)作物損失就已在損害和控制開銷上達(dá)到每年十億美元。傳統(tǒng)地，影響害蟲群體的主要方法是應(yīng)用廣譜化學(xué)殺昆蟲劑。然而，消費(fèi)者與政府調(diào)節(jié)員一樣越來越關(guān)心與生產(chǎn)和使用合成的化學(xué)殺蟲劑相關(guān)的環(huán)境危害。調(diào)節(jié)員出于這種關(guān)心已禁止或限制使用一些更為危險(xiǎn)的殺蟲劑。因此，開發(fā)替代殺蟲劑具有實(shí)質(zhì)性利益。使用諸如真菌、細(xì)菌或其它昆蟲物種的微生物劑對(duì)農(nóng)業(yè)上重要的害蟲進(jìn)行生物學(xué)控制，這為合成的化學(xué)殺蟲劑提供了對(duì)環(huán)境友好且具有商業(yè)吸引力的替代途徑。一般來講，使用生物殺蟲劑造成污染和環(huán)境危害的風(fēng)險(xiǎn)較低，并且生物殺蟲劑相對(duì)于傳統(tǒng)廣譜化學(xué)殺昆蟲劑的性質(zhì)提供了更強(qiáng)的靶標(biāo)特異性。此外，生物殺蟲劑的生產(chǎn)成本通常更低，并因而提高大量品種的農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)收益。已知芽孢桿菌屬微生物的某些種具有針對(duì)寬范圍害蟲的殺蟲活性，所述害蟲包括鱗翅目(L印idoptera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)及其它。蘇云金芽孢桿菌(Bt)和甲蟲芽孢桿菌(Bacilluspapilliae)屬于迄今所發(fā)現(xiàn)的最為成功的生物控制劑。昆蟲致病性還歸因于幼蟲芽孢桿菌(B.larvae)、緩病芽孢桿菌(B.Ientimorbus)、球形芽孢桿菌(B.sphaericus)(Harwook,ed.,((1989)Bacillus(芽孢桿菌)(PlenumPress),306)和賭狀芽孢桿菌(B.cereus)(W096/10083)菌株。雖然也已從營養(yǎng)生長期的芽孢桿菌分離出殺蟲蛋白，但是殺蟲活性看上去集中在伴孢晶體蛋白包涵體上。已分離并表征編碼這些殺蟲蛋白的數(shù)種基因(參見，例如，美國專利第5，366，892號(hào)和第5，840，868號(hào))。微生物殺昆蟲劑，特別是獲自芽孢桿菌菌株的那些，作為化學(xué)害蟲控制的替代品在農(nóng)業(yè)上起重要作用。近來，農(nóng)業(yè)科研工作者通過基因工程改造農(nóng)作物植物來產(chǎn)生來自芽孢桿菌的殺蟲蛋白，已開發(fā)出具有增強(qiáng)的昆蟲抗性的農(nóng)作物植物。例如，玉米和棉花植物已被基因工程化以產(chǎn)生分離自Bt菌株的殺蟲蛋白(參見，例如，Aronson(2002)CellMol.LifeSci.59(3):417-425；Schnepfetal.(1998)MicrobiolMolBiolRev.62(3)775-806)。這些基因工程農(nóng)作物現(xiàn)在廣泛用于美國農(nóng)業(yè)，并且向農(nóng)民提供了傳統(tǒng)昆蟲控制方法的環(huán)境友好替代品。此外，已向美國農(nóng)民銷售經(jīng)基因工程改造而包含殺蟲的Cry毒素的馬鈴薯。盡管這些基因工程改造的抗昆蟲的農(nóng)作物已被證明在商業(yè)上非常成功，但是它們僅提供針對(duì)窄范圍的商業(yè)上重要害蟲的抗性。因此，仍需要具有更寬范圍的抗害蟲殺昆蟲活性的新的Bt毒素，例如對(duì)鱗翅目中更多種昆蟲具有活性的毒素。此外，仍需要具有抗多種害蟲活性的生物殺蟲劑和具有改良?xì)⒗ハx活性的生物殺蟲劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供影響害蟲的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明的實(shí)施方式涉及影響昆蟲的方法，所述方法利用編碼殺昆蟲肽的核苷酸序列，從而產(chǎn)生表達(dá)實(shí)施方式中的殺昆蟲多肽的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。這些害蟲包括農(nóng)業(yè)上重要的害蟲，諸如，例如，歐洲玉米螟(Europeancornborer),例如歐洲玉米蟲冥(OstrinianubilalisHubner)；棉鈴蟲，例如谷實(shí)夜蛾(HelicoverpazeaBoddie)；大豆尺蠖，例如大豆夜蛾(PseudoplusiaincludensWalker)和黎豆毛蟲，例如黎豆夜蛾(AnticarsiagemmatalisHiibner)。在一些實(shí)施方式中，該核苷酸序列編碼對(duì)屬于鱗翅目的至少一種昆蟲具有殺蟲性的多肽。實(shí)施方式提供核酸及其片段和變體(例如，編碼SEQIDNO2的SEQIDNO1和編碼SEQIDNO:4的SEQIDNO:3)，其編碼具有抗害蟲殺蟲活性的多肽。實(shí)施方式的野生型(例如，天然存在的)核苷酸序列編碼新的殺昆蟲肽，所述核苷酸序列獲得自Bt。實(shí)施方式還提供所公開的編碼生物學(xué)活性(例如，殺昆蟲)多肽的核苷酸序列的片段及變體。實(shí)施方式還提供分離的殺蟲(例如，殺昆蟲)多肽，其由實(shí)施方式的天然存在的核酸或經(jīng)修飾的(例如，突變的或經(jīng)操作的)核酸所編碼。在特定實(shí)例中，實(shí)施方式的殺蟲蛋白包括全長蛋白和多肽的片段，其產(chǎn)生自突變的核酸，所述核酸經(jīng)設(shè)計(jì)以將特定氨基酸序列引入實(shí)施方式的多肽。在特定實(shí)施方式中，所述多肽經(jīng)過誘變并且相對(duì)于其衍生自的天然存在的多肽具有增強(qiáng)的殺蟲活性(例如，編碼SEQIDNO4的SEQIDNO3)。實(shí)施方式的核酸還可以用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的(例如，轉(zhuǎn)化的)單子葉或雙子葉植物，所述植物的特征在于基因組包含至少一個(gè)穩(wěn)定并入的核苷酸構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含實(shí)施方式的編碼序列，所述編碼序列與驅(qū)動(dòng)所編碼殺蟲多肽表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。因此，還提供轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物組織、植物及其種子。在特定實(shí)施方式中，可以使用經(jīng)優(yōu)化而在宿主植物中提高表達(dá)的核酸來產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物。例如，可以回譯(backtranslate)實(shí)施方式的一種殺蟲多肽，從而產(chǎn)生包含為在特定宿主中表達(dá)而優(yōu)化的密碼子的核酸，所述特定宿主例如諸如玉米(Zeamays)植物的農(nóng)作物植物。這種轉(zhuǎn)化的植物(例如，雙子葉或單子葉植物)表達(dá)編碼序列，從而導(dǎo)致產(chǎn)生殺蟲多肽，并賦予所述植物增加的昆蟲抗性。一些實(shí)施方式提供表達(dá)殺蟲多肽的轉(zhuǎn)基因植物，所述殺蟲多肽用于影響各種害蟲的方法。實(shí)施方式還包括含有實(shí)施方式的殺昆蟲多肽的殺蟲或殺昆蟲組合物，并且可以任選地包括另外的殺昆蟲肽。實(shí)施方式包括將該組合物應(yīng)用于害蟲環(huán)境，從而影響害蟲。發(fā)明詳述本發(fā)明的實(shí)施方式涉及影響害蟲、特別是植物害蟲的組合物和方法。更為具體地，實(shí)施方式的分離的核酸及其片段和變體包含編碼殺蟲多肽(例如蛋白)的核苷酸序列。所公開的殺蟲蛋白對(duì)諸如但不限于鱗翅目害蟲的害蟲具有生物學(xué)活性(例如殺蟲性)。目的害蟲包括但不限于歐洲玉米螟(Europeancornborer)，例如歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)；棉鈴蟲,例如谷實(shí)夜蛾；普通鉆心蟲(commonstalkborer)，例如，Papiapemanebris；西南玉米螟(Southwesterncornborer)，例如，西南玉米螟(Diatraeagrandiosella)；舌甘菜夜蛾(beetarmyworm),例如，舌甘菜夜蛾(Spodopteraexigua)；小菜蛾(diamond-backmoth)，例如，小菜蛾(Plutellaxylostella)；棉鈴蟲，例如谷實(shí)夜蛾;大豆尺蠖，例如大豆夜蛾；和黎豆毛蟲，例如黎豆夜蛾。實(shí)施方式的組合物包含分離的核酸及其片段和變體，其編碼殺蟲多肽、包含實(shí)施方式的核苷酸序列的表達(dá)盒、分離的殺蟲蛋白和殺蟲組合物。一些實(shí)施方式提供經(jīng)修飾的殺蟲多肽，所述多肽的特征在于相對(duì)于相應(yīng)野生型蛋白的殺蟲活性具有改良的抗鱗翅目殺昆蟲活性。實(shí)施方式還提供用這些新的核酸轉(zhuǎn)化的植物和微生物，以及涉及將該核酸、殺蟲組合物、轉(zhuǎn)化生物體及其產(chǎn)物用于影響害蟲的方法。實(shí)施方式的核酸和核苷酸序列可以用于轉(zhuǎn)化任何生物體，從而產(chǎn)生所編碼的殺蟲蛋白。所提供的方法涉及將該轉(zhuǎn)化生物體用于影響或控制植物害蟲。實(shí)施方式的核酸和核苷酸序列還可以用于轉(zhuǎn)化諸如葉綠體的細(xì)胞器(McBrideetal.(1995)Biotechnology13:362-365；和Kotaetal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:1840-1845)。實(shí)施方式還涉及鑒定編碼生物學(xué)活性殺蟲蛋白的天然存在的編碼序列片段和變體。實(shí)施方式的核苷酸序列直接用于影響害蟲、特別是諸如鱗翅目害蟲的害蟲的方法。因此，實(shí)施方式提供影響害蟲的新方法，所述方法不依賴傳統(tǒng)的合成的化學(xué)殺昆蟲劑的使用。實(shí)施方式涉及發(fā)現(xiàn)天然存在的、可生物降解的殺蟲劑以及編碼它們的基因。實(shí)施方式還提供同樣編碼生物學(xué)活性(例如，殺蟲)多肽的天然存在的編碼序列片段和變體。實(shí)施方式的核酸包括經(jīng)優(yōu)化用于特定生物體的細(xì)胞表達(dá)的核酸或核苷酸序列，例如使用植物偏好密碼子，以具有增強(qiáng)殺蟲活性的多肽氨基酸序列為基礎(chǔ)而回譯(即反向翻譯)的核酸序列。實(shí)施方式還提供突變，所述突變賦予實(shí)施方式的多肽改良的或改變的性質(zhì)。參見，例如，共同未決的2003年6月25日提交的美國申請(qǐng)第10/606,320號(hào)和2003年12月24日提交的第10/746，914號(hào)。在隨后的描述中，廣泛使用了大量術(shù)語。為促進(jìn)對(duì)實(shí)施方式的理解，提供以下定義?？梢杂肧I可接受的形式表示單位、前綴和符號(hào)。除非另有所指，分別地，核酸以5’至3’方向從左向右書寫；氨基酸序列以氨基至羧基方向從左向右書寫。數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符號(hào)或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一字母符號(hào)來表示。同樣地，可以用通常接受的單字母碼表示核苷酸。參考說明書整體更為充分地定義以上定義的術(shù)語。如本文所用，“核酸”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物與天然存在的核苷酸以類似的方式與單鏈核酸雜交。如本文所用，術(shù)語“編碼”或“所編碼的”用于特定核酸的上下文時(shí)，指該核酸包含指導(dǎo)該核苷酸序列翻譯成特定蛋白的必需信息。使用密碼子表示編碼蛋白的信息。編碼蛋白的核酸可以包含位于該核酸翻譯區(qū)內(nèi)的非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)或者可以缺少這樣的居間非翻譯序列(例如，在cDNA中)。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所編碼的蛋白的“全長序列”指具有天然(非合成)內(nèi)源序列的整個(gè)核酸序列或整個(gè)氨基酸序列。全長多核苷酸編碼該特定蛋白的全長、催化活性形式。如本文所用，用于核苷酸序列方向上下文的術(shù)語“反義”涉及雙鏈體多核苷酸序列，所述多核苷酸序列以轉(zhuǎn)錄該反義鏈的方向與啟動(dòng)子可操作地連接。該反義鏈與內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物充分互補(bǔ)，以致該內(nèi)源轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻譯通常受抑制。因而，將術(shù)語“反義”用于特定核苷酸序列的上下文時(shí)，該術(shù)語涉及該參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈。本文可互換地使用術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白”，以指氨基酸殘基的多聚物。該術(shù)語用于氨基酸多聚物，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)類似物。該術(shù)語還用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互換地使用術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(統(tǒng)稱“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知類似物，所述類似物可以與天然存在的氨基酸以相似的方式起作用?？梢詮谋疚墓_的核酸或者使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)制備實(shí)施方式的多肽。例如，可以通過在適當(dāng)宿主細(xì)胞中表達(dá)實(shí)施方式的重組核酸，或可選擇地通過離體(exvivo)方法的組合，來制備實(shí)施方式的蛋白。如本文所用，可以互換地使用術(shù)語“分離的，，和“純化的”，以涉及核酸或多肽或其生物學(xué)活性部分，其基本上或本質(zhì)上不含如在其天然存在的環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的通常伴隨或反應(yīng)于該核酸或多肽的組分。因而，用重組技術(shù)產(chǎn)生分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，分離的或純化的核酸或多肽基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者化學(xué)合成分離的或純化的核酸或多肽時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)品?！胺蛛x的”核酸通常不含在該核酸所衍生自的生物體的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸(即位于該核酸5’和3’端的序列)的序列(諸如，例如編碼蛋白的序列)。例如，在各種實(shí)施方式中，所分離的核酸可以包含少于約5吐，41^，31^，21^，11^，0.51Λ或0.Ikb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在該核酸所衍生自的細(xì)胞的基因組DNA中天然側(cè)翼于該核酸。如本文所用，將術(shù)語“分離的”或“純化的”用于涉及實(shí)施方式的多肽時(shí)，指分離的蛋白基本上不含細(xì)胞物質(zhì)并且包含具有少于約30^,20^,10%或5%(干重計(jì))的污染蛋白的蛋白制備物。當(dāng)重組地產(chǎn)生實(shí)施方式的蛋白或其生物學(xué)活性部分時(shí)，培養(yǎng)基代表少于約30^,20^,10%或5%(干重計(jì))的化學(xué)前體或非目的蛋白化學(xué)品。貫穿申請(qǐng)文件，將詞語“包括(comprising)”或諸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)，，的變體理解成提示包含所稱元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組，而非排除任何其它元素、整數(shù)或步驟，或者元素、整數(shù)或步驟的組。如本文所用，術(shù)語“影響害蟲”指對(duì)任何發(fā)育階段的昆蟲進(jìn)食、生長和/或行為的有影響的改變，包括但不限于殺滅昆蟲、延遲生長、阻礙生殖能力、拒食素活性等等。如本文所用，將術(shù)語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”同義地使用以指生物體或物質(zhì)(諸如，例如蛋白)的活性，其測(cè)量可以通過但不限于害蟲死亡率、害蟲體重減少、害蟲驅(qū)避性(r印ellency)以及進(jìn)食和暴露適當(dāng)長時(shí)間后害蟲的其它行為和物理變化。因而，具有殺蟲活性的生物體或物質(zhì)不利地影響至少一種可測(cè)量的害蟲健康參數(shù)。例如，“殺蟲蛋白”是自身顯示或與其它蛋白組合顯示殺蟲活性的蛋白。如本文所用，術(shù)語“殺蟲有效量”指存在于害蟲環(huán)境的具有殺蟲活性的物質(zhì)或生物體的量。對(duì)每一物質(zhì)或生物體而言，通過經(jīng)驗(yàn)來確定在特定環(huán)境中受影響的每一害蟲的殺蟲有效量。類似地，當(dāng)害蟲是昆蟲時(shí)，“殺昆蟲有效量”可以用于指“殺蟲有效量”。如本文所用，術(shù)語“重組工程化的，，或“工程化的，，指利用重組DNA技術(shù)引入(例如工程化)蛋白結(jié)構(gòu)的改變，這基于對(duì)蛋白作用機(jī)制的理解以及對(duì)被引入、被缺失或被取代的氨基酸的考慮。如本文所用，術(shù)語“突變核苷酸序列”或“突變”或“誘變的核苷酸序列”指經(jīng)誘變或改變而包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基(例如堿基對(duì))的核苷酸序列，所述核苷酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的誘變或改變由核酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或取代或替換所組成。當(dāng)通過添加、移除或替換蛋白水解位點(diǎn)的氨基酸來制備突變時(shí)，這樣的添加、移除或替換可以在該蛋白水解位點(diǎn)基序內(nèi)或鄰近該基序，只要完成了突變的目的(即只要改變了該位點(diǎn)的蛋白水解)。突變體核苷酸序列可以編碼突變體殺昆蟲毒素，所述毒素顯示改良的或降低的殺昆蟲活性，或者可以編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的或降低的殺昆蟲活性。如本文所用的，蛋白、多肽或氨基酸序列上下文的術(shù)語“突變體”或“突變”指經(jīng)突變或經(jīng)改造而包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列，所述氨基酸殘基不存在于相應(yīng)的野生型序列中。這樣的突變或改變由氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)添加、缺失或取代或替換所組成。突變體多肽顯示改良的或降低的殺昆蟲活性，或者代表氨基酸序列，所述氨基酸序列賦予包含它的多肽改良的殺昆蟲活性。因而，術(shù)語“突變體”或“突變”指突變體核苷酸序列和所編碼的氨基酸之一或兩者。突變體可以單獨(dú)使用或者與其它突變體或與實(shí)施方式的其它突變體相容地任意組合使用?！巴蛔凅w多肽”可以相反地顯示殺昆蟲活性的降低。將超過一個(gè)突變添加至特定核酸或蛋白時(shí)，所述突變可以同時(shí)或順序添加；如果順序添加，突變可以以任何合適的次序添加。如本文所用，術(shù)語“改良的殺昆蟲活性”或“改良的殺蟲活性”涉及實(shí)施方式的殺昆蟲多肽，所述多肽相對(duì)于其相應(yīng)的野生型蛋白具有增強(qiáng)的殺昆蟲活性，和/或涉及對(duì)更廣譜的昆蟲有效的殺昆蟲多肽，和/或涉及對(duì)不易受野生型蛋白毒性影響的昆蟲具有特異性的殺昆蟲多肽。改良的或增強(qiáng)的殺蟲活性的發(fā)現(xiàn)需要證明相對(duì)于野生型殺昆蟲多肽的殺蟲活性，對(duì)昆蟲靶標(biāo)的殺蟲活性提高至少10%，或者殺蟲活性提高至少20%，25%，30%，35%，40%，45%，50%，60%，70%，100%，150%，200%或300%或更多，所述活性的確定是針對(duì)同樣的昆蟲。例如，提供改良的殺蟲或殺昆蟲活性，其中相對(duì)于受野生型Bt毒素影響的昆蟲的范圍，受該多肽影響的昆蟲的范圍更寬或者更窄。當(dāng)需要多功能性時(shí)，可能需要較寬的影響范圍，而當(dāng)例如有益的昆蟲另外有可能受該毒素的使用或存在所影響時(shí)，可能需要較窄的影響范圍。雖然實(shí)施方式不受任何特別的作用機(jī)制的限制，但是也可以通過改變多肽的一個(gè)或多個(gè)特性來提供改良的殺蟲活性；例如，可以增加多肽在昆蟲腸內(nèi)的穩(wěn)定性或壽命，所述增加相對(duì)于相應(yīng)野生型蛋白的穩(wěn)定性或壽命。本文所用術(shù)語“毒素”指表現(xiàn)殺蟲活性或殺昆蟲活性或改良的殺蟲活性或改良的殺昆蟲活性的多肽?！癇t”或“蘇云金芽孢桿菌”毒素意在包括在Bt的各種菌株中發(fā)現(xiàn)的較寬種類的Cry毒素，其包括諸如例如Cryls，Cry2s或Cry3s的毒素。術(shù)語“蛋白水解位點(diǎn)，，或“切割位點(diǎn)，，指氨基酸序列，其將敏感性賦予一類蛋白酶或特定蛋白酶，以致包含所述氨基酸序列的多肽被該類蛋白酶或特別的蛋白酶所消化。據(jù)稱，蛋白水解位點(diǎn)對(duì)識(shí)別該位點(diǎn)的一種或多種蛋白酶“敏感”。本領(lǐng)域理解，消化效率各不相同，并且消化效率的降低可以導(dǎo)致該多肽在昆蟲腸內(nèi)穩(wěn)定性或壽命的增加。因而，蛋白水解位點(diǎn)可以將敏感性賦予不止一種蛋白酶或者不止一類蛋白酶，但是各種蛋白酶對(duì)該位點(diǎn)的消化效率可以各不相同。蛋白水解位點(diǎn)包括，例如，胰蛋白酶位點(diǎn)、糜蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶位點(diǎn)。研究已表明鱗翅目的昆蟲腸蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶和彈性蛋白酶。參見，例如，Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16:201-212；禾PHedegusetal.(2003)Arch.InsectBiochem.Physiol.53:30_47o例如，已在Helicoverpaarmigera幼蟲的中腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)約18種不同的胰蛋白酶(參見Gatehouseetal.(1997)InsectBiochem.Mol.Biol.27:929-944).已研究了這些蛋白酶所優(yōu)選的蛋白水解底物位點(diǎn)。參見，例如Petersonetal.(1995)InsectBiochem.Mol.Biol.25:765_774。已努力理解Bt毒素的作用機(jī)制并利用改良的性質(zhì)改造毒素。已表明昆蟲腸蛋白酶可以影響B(tài)tCry蛋白對(duì)該昆蟲的影響。一些蛋白酶通過將Cry蛋白從“毒素原(protoxin)，，形式加工至毒性形式或“毒素”，來活化Cry蛋白。參見Oppert(1999)Arch.InsectBiochem.Phys.421~12；禾口Carrolletal.(1997)J.InvertebratePathology70:41-49。該毒素的活化可以包括從所述蛋白移除N末端和C末端肽，并且還可以包括從內(nèi)部切割該蛋白。其它蛋白酶可以降解所述Cry蛋白。參見Oppert，如前。不同特異性的Cry毒素的氨基酸序列的比較揭示了5個(gè)高度保守的序列單元(block)。所述毒素在結(jié)構(gòu)上包含3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域，從N末端到C末端為涉及孔形成的7個(gè)α螺旋的簇(稱作“結(jié)構(gòu)域1”)、涉及細(xì)胞結(jié)合的3個(gè)反平行β片層(稱作“結(jié)構(gòu)域2”)以及β三明治(稱作“結(jié)構(gòu)域3”)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些結(jié)構(gòu)域的位置和性質(zhì)。參見，例如，Lietal.(1991)Nature，305:815-821禾口Morseetal.(2001)Structure,9409-417。涉及特定結(jié)構(gòu)域，例如涉及結(jié)構(gòu)域1時(shí)，應(yīng)理解關(guān)于特定序列的結(jié)構(gòu)域的確切終點(diǎn)并不是關(guān)鍵的，只要該序列或其部分包含提供歸因于該特定結(jié)構(gòu)域的至少一些功能的序列。因而，例如，當(dāng)提及“結(jié)構(gòu)域1”時(shí)，意在指特定序列包括7個(gè)α螺旋的簇，但所用序列或關(guān)于該簇的序列的確切終點(diǎn)并不關(guān)鍵。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這類終點(diǎn)的確定以及對(duì)這類功能的評(píng)價(jià)。為了嘗試更好地表征和改良Bt毒素，研究了Bt細(xì)菌菌株。發(fā)現(xiàn)從Bt菌株培養(yǎng)物制備的晶體制備物具有抗歐洲玉米螟的殺蟲活性(參見，例如，實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例1、2和3)。嘗試鑒定來自所選菌株的編碼晶體蛋白的核苷酸序列，從這些細(xì)菌菌株分離實(shí)施方式的野生型(即天然存在的)核酸，將其克隆至表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌。依賴給定制備物的特性，認(rèn)識(shí)到殺蟲活性的證明有時(shí)需要胰蛋白酶預(yù)處理以活化該殺蟲蛋白。因而，應(yīng)理解一些殺蟲蛋白的活化需要蛋白酶消化(例如，通過胰蛋白酶、糜蛋白酶等等)，而其它蛋白在無活化作用下便是生物活性的(例如，殺蟲性)?？梢酝ㄟ^2003年6月25日提交的美國申請(qǐng)第10/606，320號(hào)和2003年12月M日提交的第10/746，914號(hào)所述的方法改造所述分子。此外，可以將核酸序列工程化，以編碼包含另外的突變的多肽，所述突變賦予相對(duì)于天然存在的多肽的殺蟲活性的改良的或改變的殺蟲活性。該工程化的核酸的核苷酸序列包含未在野生型序列中發(fā)現(xiàn)的突變。通常通過包括以下步驟的方法制備實(shí)施方式的突變體多肽獲得編碼Cry家族多肽的核酸序列；分析所述多肽的結(jié)構(gòu)，以鑒定特定“靶”位點(diǎn)的潛在基因序列的誘變，這基于9對(duì)所述靶結(jié)構(gòu)域在毒素作用模式中的所提議功能的考慮；將一個(gè)或多個(gè)突變引入核酸序列以產(chǎn)生對(duì)所編碼多肽序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的所需改變；以及測(cè)定所產(chǎn)生多肽的殺蟲活性。Bt殺昆蟲毒素中的許多都是相關(guān)的，其氨基酸序列和三級(jí)結(jié)構(gòu)的相似程度各不相同，并且公知獲得Bt毒素晶體結(jié)構(gòu)的方法。從文獻(xiàn)可獲得示例性的Cry3A和CryIBB多肽兩者的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)解析。解析到的Cry3A基因結(jié)構(gòu)(Lietal.(1991)Nature353815-821)提供了對(duì)該毒素結(jié)構(gòu)與功能間關(guān)系的深刻理解。組合考慮Bt毒素的已公開的結(jié)構(gòu)分析和所報(bào)道的與特定結(jié)構(gòu)、基序等等相關(guān)的功能，說明該毒素的特定區(qū)域與該蛋白的特定功能和特定作用模式的不連續(xù)步驟相關(guān)。例如，通常將分離自Bt的許多毒素描述為包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域涉及孔形成的7螺旋束、涉及受體結(jié)合的3片層結(jié)構(gòu)域和β三明治基序(Lietal.(1991)Nature353:815-821)。如美國專利第7，105，332號(hào)和2003年12月M日提交的未決美國申請(qǐng)第10/746,914號(hào)所報(bào)道，可以通過將位于該毒素結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的區(qū)域作為靶標(biāo)，來改良Cry蛋白的毒性。這一理論建立于關(guān)于殺昆蟲毒素的知識(shí)體系，包括1)據(jù)報(bào)道Cry3A毒素結(jié)構(gòu)域1的α螺旋4和5插入內(nèi)襯易感昆蟲中腸的細(xì)胞的脂雙分子層(iazitetal.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:12289-12294)；2)發(fā)明人了解野生型蛋白氨基酸序列內(nèi)胰蛋白酶和糜蛋白酶切割位點(diǎn)的位置；3)觀察到在借助胰蛋白酶或糜蛋白酶處理的體外活化之后，野生型蛋白對(duì)某些昆蟲更具活性；以及4)報(bào)道從3’端消化毒素導(dǎo)致了對(duì)昆蟲毒性的降低?？梢灾苽湟幌盗型蛔?，并將其置于各種背景序列中，從而制備具有增強(qiáng)的或者改變的殺蟲活性的新的多肽。參見，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國申請(qǐng)第10/606，320號(hào)以及2003年12月M日提交的第10/746，914號(hào)。這些突變體包括但不限于在位于結(jié)構(gòu)域1的螺旋3和4之間的區(qū)域另外添加至少一個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)(例如胰蛋白酶切割位點(diǎn))；用不同蛋白酶敏感的位點(diǎn)替換野生型序列的原始蛋白酶敏感的位點(diǎn)；在特定位置添加多蛋白酶敏感位點(diǎn)；在一個(gè)或多個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)附近添加氨基酸殘基，從而改變所述多肽的折疊并因而增強(qiáng)在該一個(gè)或多個(gè)蛋白酶敏感的位點(diǎn)處的多肽消化；和添加突變以保護(hù)該多肽免受使毒性降低的降解性消化(例如，制備一系列突變，其中用纈氨酸替換野生型氨基酸以保護(hù)所述多肽免于消化)?？梢詥为?dú)或以任意組合使用突變，從而提供實(shí)施方式的多肽。實(shí)施方式以這種方式提供包含各種突變的序列，所述突變諸如，例如包含位于所編碼多肽結(jié)構(gòu)域1的α螺旋3和4之間的另外的或可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變。另外的或可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可以對(duì)諸如絲氨酸蛋白酶的數(shù)種蛋白酶或者諸如彈性蛋白酶的酶敏感，所述絲氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶和糜蛋白酶。因而，另外的或者可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)的突變可以經(jīng)設(shè)計(jì)以致該位點(diǎn)被蛋白酶類容易地識(shí)別和/或切割，所述蛋白酶諸如哺乳動(dòng)物蛋白酶或昆蟲蛋白酶。還可以將蛋白酶敏感的位點(diǎn)設(shè)計(jì)為被已知產(chǎn)生于生物體的特定種類的酶或特定酶切割，所述酶諸如，例如棉鈴蟲Heliothiszea產(chǎn)生的糜蛋白酶(Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16:201-212)。突變還可以賦予對(duì)蛋白水解消化的抗性，例如對(duì)糜蛋白酶在所述肽的C末端的消化的抗性。所編碼多肽的氨基酸序列存在另外的和/或可選擇的蛋白酶敏感位點(diǎn)，這可以提高實(shí)施方式的核酸編碼的多肽的殺蟲活性和/或殺蟲特異性。因此，實(shí)施方式的核苷酸序列可以被重組工程化或者被操作以產(chǎn)生具有改良的或改變的殺蟲活性和/或特異性的多肽，所述改良或改變相對(duì)于未經(jīng)修飾的野生型毒素。另外，本文公開的突變可以被置于其它核苷酸序列或與其它核苷酸序列聯(lián)用，從而提供改良的性質(zhì)。例如，昆蟲糜蛋白酶容易切割的蛋白酶敏感位點(diǎn)可以被置于Cry背景序列，以提供針對(duì)該序列的改良的毒性，所述昆蟲糜蛋白酶例如在花邊粘蟲(berthaarmyworm)或棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)的糜蛋白酶(Hegedusetal.(2003)Arch.InsectBiochem.Physiol.53:30-47；禾口Lenzetal.(1991)Arch.InsectBiochem.Physiol.16:201-212)。實(shí)施方式以這種方式提供具有改良性質(zhì)的毒性多肽。例如，突變的Cry核苷酸序列可以包含另外的突變體，所述突變體包含將第二胰蛋白酶敏感的氨基酸序列(除開天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn))引入所編碼多肽的另外的密碼子。實(shí)施方式的可選擇的添加突變體包含另外的密碼子，所述密碼子經(jīng)設(shè)計(jì)以將至少一個(gè)另外的不同的蛋白酶敏感的位點(diǎn)引入該多肽，例如，緊靠天然存在的胰蛋白酶位點(diǎn)5’或3’的糜蛋白酶敏感的位點(diǎn)?？蛇x擇地，可以制備取代突變體，其中破壞編碼天然存在的蛋白酶敏感位點(diǎn)的核酸的至少一個(gè)密碼子，并且將可選擇的密碼子引入核酸序列，從而提供不同的(例如取代的)蛋白酶敏感的位點(diǎn)。還可以將替換突變體添加至Cry序列，其中破壞所編碼多肽中存在的天然存在的胰蛋白酶切割位點(diǎn)，并且將糜蛋白酶或彈性蛋白酶切割位點(diǎn)引入它的位置。認(rèn)識(shí)到可以使用編碼蛋白水解位點(diǎn)或推定的蛋白水解位點(diǎn)(例如諸如NGSR、RR或LKM的序列)氨基酸序列的任何核苷酸序列，并且用于將這些切割位點(diǎn)中的任何位點(diǎn)引入變體多肽的密碼子的確切身份可以根據(jù)用途而不同，所述用途即在特定植物物種中的表達(dá)。還認(rèn)識(shí)到所公開突變中的任何突變可以被引入實(shí)施方式的任一多核苷酸序列，所述序列包含提供天然胰蛋白酶切割位點(diǎn)的氨基酸殘基的密碼子，所述切割位點(diǎn)是修飾的靶標(biāo)。因此，可以修飾全長毒素或其片段的變體，以包含另外的或可選擇的切割位點(diǎn)，并且這些實(shí)施方式意在為本文公開的實(shí)施方式的范圍所包括。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，只要所編碼多肽保留殺蟲活性，任何有用的突變可以被添加至實(shí)施方式的序列。因而，也可以突變序列，以致所編碼多肽對(duì)糜蛋白酶的蛋白水解消化具有抗性?？梢砸匀魏谓M合在特定位置添加超過一個(gè)的識(shí)別位點(diǎn)，并且可以向所述毒素添加或從所述毒素移除多識(shí)別位點(diǎn)。因而，另外的突變可以包括3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。將認(rèn)識(shí)到可以在任一合適的多核苷酸序列中工程化多突變；因此，可以修飾全長序列或其片段，以包含另外的或可選擇的切割位點(diǎn)以及對(duì)蛋白水解消化具有抗性。如此，實(shí)施方式提供包含突變的Cry毒素，所述突變改善殺蟲活性，實(shí)施方式還提供改良的組合物以及使用其它Bt毒素影響害蟲的方法。突變可以保護(hù)該多肽免于蛋白酶降解，所述保護(hù)例如是通過從不同區(qū)域移除諸如推定的絲氨酸蛋白酶位點(diǎn)和彈性蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的推定的蛋白水解位點(diǎn)?？梢砸瞥蚋脑爝@些推定位點(diǎn)的一些或全部，以致原始位點(diǎn)位置的蛋白水解被降低。可以通過比較突變體多肽和野生型毒素或者通過比較氨基酸序列各不相同的突變體毒素，來評(píng)價(jià)蛋白水解的變化。蛋白水解位點(diǎn)和推定的蛋白水解位點(diǎn)包括但不限于以下序列RR，胰蛋白酶切割位點(diǎn)；LKM，糜蛋白酶位點(diǎn)；和NGSR，胰蛋白酶位點(diǎn)。只要所述多肽的殺蟲活性被提高，可以通過添加或缺失任意數(shù)目和種類的氨基酸殘基來改造這些位點(diǎn)。因而，相對(duì)于天然序列或背景序列，由包含突變的核苷酸序列編碼的多肽將包含至少1個(gè)氨基酸改變或添加，或者2，3,4,5,6,7,8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，32，35，38，40，45，47，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190,200,210，220，230，240,250，260,270或280或更多個(gè)氨基酸改變或添加。如本領(lǐng)域所知，還可以通過截短天然或全長序列來提高多肽的殺蟲活性。實(shí)施方式的組合物包括核酸及其片段和變體，其編碼殺蟲多肽。特別地，實(shí)施方式提供分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼SEQIDNOs:2和4所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者包含編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，例如SEQIDNOs:1和3所示的核苷酸序列，及其片段和變體。另外受到關(guān)注的是編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。如本文所用，短語“優(yōu)化核苷酸序列”指為在特定生物體表達(dá)而優(yōu)化的核酸，所述特定生物體例如是植物。可以使用本領(lǐng)域已知方法制備用于任何目的生物體的優(yōu)化核苷酸序列。參見，例如，如今已放棄的、2003年6月25日提交的美國申請(qǐng)第10/606，320號(hào)以及2003年12月M日提交的第10/746，914號(hào)，它們描述了編碼所公開殺蟲蛋白的優(yōu)化核苷酸序列。在本實(shí)施例中，所述核苷酸序列的制備是通過反向翻譯蛋白的氨基酸序列，并改變核苷酸序列以致包含玉米偏好密碼子但仍編碼相同的氨基酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高殺蟲蛋白在植物中的表達(dá)，所述植物例如禾本科(Gramineae)(Poaceae)單子葉植物，例如玉米(maize或corn)植物。實(shí)施方式還提供分離的殺蟲(例如殺昆蟲)多肽，其由實(shí)施方式的天然存在的或修飾的核酸所編碼。更為具體地，實(shí)施方式提供包含SEQIDNOs:2和4所示氨基酸序列的多肽，以及由本文所述核酸編碼的多肽，本文所述核酸例如SEQIDNOs:1和3所示的核酸，及其片段和變體。在特定實(shí)施方式中，所述多肽被進(jìn)行修飾并且相對(duì)于其衍生自的天然存在的多肽具有增強(qiáng)的殺蟲活性(例如，編碼SEQIDNO4的SEQIDNO3)。在特定實(shí)施方式中，實(shí)施方式的殺蟲蛋白提供全長殺昆蟲多肽、全長殺昆蟲多肽的片段以及由突變核酸產(chǎn)生的變體多肽，所述突變核酸經(jīng)設(shè)計(jì)將特定氨基酸序列引入實(shí)施方式的多肽。在特定實(shí)施方式中，被引入所述多肽的氨基酸序列包括提供諸如蛋白酶的酶的切割位點(diǎn)的序列。本領(lǐng)域已知Bt毒素的殺蟲活性通常通過各種蛋白酶在昆蟲腸內(nèi)對(duì)所述肽的切割被活化。因?yàn)殡脑诶ハx腸內(nèi)不總是以全效切割，所以全長毒素的片段相對(duì)于全長毒素自身可以具有增強(qiáng)的殺蟲活性。因而，實(shí)施方式的多肽中的一些包括全長殺昆蟲多肽的片段，并且多肽片段、變異體和突變中的一些將相對(duì)于其衍生自的天然存在的殺昆蟲多肽的活性，具有增強(qiáng)的殺蟲活性，特別是如果天然存在的殺昆蟲多肽在篩選活性前未用蛋白酶進(jìn)行體外活化。因而，本申請(qǐng)包括所述序列的截短形式或片段?？梢詫⑼蛔冎萌氚ㄋ霰唤囟潭嚯牡娜我槐尘靶蛄?，只要所述多肽保留殺蟲活性。使用本領(lǐng)域已知的測(cè)定或本文他處描述的測(cè)定，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地比較兩種或更多種蛋白的殺蟲活性。將理解實(shí)施方式的多肽可以通過表達(dá)本文所公開的核酸或通過使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生。認(rèn)識(shí)到所述殺蟲蛋白可以是寡聚的并且會(huì)在分子量、殘基數(shù)目、組分多肽、抗特定害蟲活性以及其它特性上各不相同。然而，通過本文所述方法，可以分離并表征對(duì)各種害蟲有活性的蛋白。實(shí)施方式的殺蟲蛋白可以與其它Bt毒素或其它殺昆蟲蛋白組合使用，從而提高靶昆蟲范圍。此外，實(shí)施方式的殺蟲蛋白與其它Bt毒素或不同性質(zhì)的其它殺昆蟲原則的組合使用具有預(yù)防和/或處理昆蟲抗性的特定功效。其它殺昆蟲劑包括蛋白酶抑制劑(絲氨酸和半胱氨酸類型)、α淀粉酶以及過氧化物酶。實(shí)施方式還包括核苷酸及其編碼的氨基酸序列和多肽的片段和變體。如本文所用，術(shù)語“片段”指實(shí)施方式的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相應(yīng)全長蛋白的生物學(xué)活性，并因而具有殺蟲活性。因而，已知實(shí)施方式的多核苷酸和氨基酸序列中的一些可以正確地稱為片段和突變體。應(yīng)理解如術(shù)語“片段”用于提及實(shí)施方式的核酸序列時(shí)，該術(shù)語還包括可用作雜交探針的序列。這類核苷酸序列通常不編碼保留生物學(xué)活性的片段蛋白。因而，核苷酸序列的片段的范圍可以從至少約20個(gè)核苷酸，約50個(gè)核苷酸，約100個(gè)核苷酸到編碼實(shí)施方式的蛋白的全長核苷酸序列。編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白生物學(xué)活性部分的實(shí)施方式的核苷酸序列片段將編碼至少15,25,30,50,100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200個(gè)連續(xù)的氨基酸，或者編碼多達(dá)實(shí)施方式的殺蟲多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸(例如SEQIDNO2的711個(gè)氨基酸和SEQIDNO:4的712個(gè)氨基酸)。因而，應(yīng)理解實(shí)施方式還包括多肽，所述多肽是實(shí)施方式的示例性殺蟲蛋白的片段并且具有至少長15，25，30，50，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100或1200個(gè)連續(xù)氨基酸或者多達(dá)實(shí)施方式的殺蟲多肽中存在的全部數(shù)量的氨基酸(例如分別SEQIDNOs2和4的711和722個(gè)氨基酸)?？梢杂米麟s交探針或PCR引物的實(shí)施方式的核苷酸序列片段通常不需要編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分。因而，實(shí)施方式的核酸片段可以編碼殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分，或者它可以是能夠用作使用本文所公開方法的雜交探針或PCR引物的片段。殺蟲蛋白的生物學(xué)活性部分的制備可以通過分離實(shí)施方式的核苷酸序列中的一種的一部分，表達(dá)殺蟲蛋白的所編碼部分(例如通過體外重組表達(dá))，和評(píng)價(jià)所述殺蟲蛋白所編碼部分的活性。作為實(shí)施方式核苷酸序列片段的核酸包括至少16，20，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，600，700，800，1000，1200，1400，1600，1800或2000個(gè)核苷酸，或者多達(dá)本文公開的核苷酸序列中所存在數(shù)量的核苷酸(例如分別SEQIDNO:1和SEQIDNO3的2136和2139個(gè)核苷酸)。特定實(shí)施方式涉及衍生自(例如產(chǎn)生自)實(shí)施方式的第一核酸的片段，其中所述片段編碼以殺蟲活性為特征的截短的毒素。實(shí)施方式的多核苷酸片段所編碼的截短的多肽的特征在于等價(jià)或改良的殺蟲活性，所述等價(jià)或改良是相對(duì)于該片段衍生自的第一核酸所編碼的相應(yīng)全長多肽的活性。所涉及的是實(shí)施方式的該核酸片段可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的3’端被截短。核酸片段還可以在天然或相應(yīng)全長編碼序列的5’和3’端均被截短。本文所用術(shù)語“變體”指基本上相似的序列。對(duì)于核苷酸序列，保守變體包括由于遺傳密碼子簡(jiǎn)并性而編碼實(shí)施方式的殺蟲多肽中的一種的氨基酸序列的那些序列。諸如這些的天然存在的等位基因變體可以使用公知的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定，所述技術(shù)諸如，例如本文所列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和雜交技術(shù)。變體核苷酸序列還包括合成衍生的核苷酸序列，諸如使用例如位點(diǎn)定向誘變而產(chǎn)生的仍編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的那些，諸如突變體毒素。一般來講，實(shí)施方式的特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或更高的序列一致性，一致性的確定是通過本文他處所述的序列比對(duì)程序，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。實(shí)施方式的核苷酸序列變體與該序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4，3，2或甚至1個(gè)核苷酸。評(píng)價(jià)實(shí)施方式的特定核苷酸序列(即示例性核苷酸序列)的變體還可以通過比較變體核苷酸序列所編碼多肽和該參考核苷酸序列所編碼多肽的序列一致性百分比。因而，例如，公開了編碼與SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的多肽具有給定序列一致性百分比的多肽的分離的核酸?？梢允褂帽疚乃幩鲂蛄斜葘?duì)程序計(jì)算任兩個(gè)多肽之間的序列一致性百分比，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。如果通過比較實(shí)施方式的任意給定對(duì)多核苷酸所編碼的兩個(gè)多肽所享有的序列一致性百分比，來評(píng)價(jià)所述任意給定對(duì)，那么該兩個(gè)所編碼多肽之間的序列一致性百分比為至少約40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，一般至少約75%，80%，85%，至少約90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，或者至少約98%，99%或更高的序列一致性。如本文所用，術(shù)語“變體蛋白，，包括衍生自天然蛋白的多肽，所述衍生是通過缺失(所謂的截短)天然蛋白N末端和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸或?qū)⒁粋€(gè)或多個(gè)氨基酸添加至所述天然蛋白的N末端和/或C末端；在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或者在天然蛋白的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸。因而，術(shù)語“變體蛋白”包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天熱蛋白生物學(xué)活性，即具有殺蟲活性的足夠數(shù)目的連續(xù)氨基酸殘基。這樣的殺蟲活性相對(duì)天然蛋白可以是不同的或者是改良的，或者它可以是不變的，只要保留了殺蟲活性。實(shí)施方式包括的變體蛋白具有生物學(xué)活性，即它們繼續(xù)具有天然蛋白的所需的生物學(xué)活性，所述活性即本文所述的殺蟲活性。所述變體可以得自例如基因多態(tài)性或人類的操作。實(shí)施方式的天然殺蟲蛋白的生物學(xué)活性變體將與天然蛋白氨基酸序列具有至少約60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%,96%,97%,98%,99%或更高的序列一致性，一致性的確定是通過本文他處描述的序列比對(duì)程序，所述程序使用默認(rèn)參數(shù)。實(shí)施方式的蛋白的生物學(xué)活性變體與該蛋白的差異可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4，3，2或甚至1個(gè)氨基酸殘基。實(shí)施方式還包括轉(zhuǎn)化的微生物，所述轉(zhuǎn)化使用至少一種實(shí)施方式的核酸、包含所述核酸的表達(dá)盒或者包含所述表達(dá)盒的載體。在一些實(shí)施方式中，所述微生物是依靠植物增殖的微生物。本發(fā)明的實(shí)施方式涉及封裝的殺蟲蛋白，所述蛋白包括能夠表達(dá)至少一種實(shí)施方式的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)化的微生物。實(shí)施方式提供殺蟲組合物，包括實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化的微生物。在該實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)化的微生物通常以殺蟲有效量與適當(dāng)?shù)妮d體共同存在于所述殺蟲組合物中。實(shí)施方式還包括殺蟲組合物，所述組合物包括殺昆蟲有效量的實(shí)施方式的分離的蛋白，以及適當(dāng)?shù)妮d體，所述分離的蛋白單獨(dú)存在或者與實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化的生物體和/或?qū)嵤┓绞降姆庋b的殺蟲蛋白組合。實(shí)施方式還提供使用實(shí)施方式的殺蟲蛋白與至少一種其它的或“第二”殺蟲蛋白的組合，來增加昆蟲靶范圍的方法?？梢詫⒈绢I(lǐng)域已知的任意殺蟲蛋白用于實(shí)施方式的方法。所述殺蟲蛋白包括但不限于Bt毒素、蛋白酶抑制劑、α淀粉酶以及過氧化物酶。實(shí)施方式還包括轉(zhuǎn)化的植物或轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列。在一些實(shí)施方式中，使用核苷酸構(gòu)建體穩(wěn)定地構(gòu)建植物，所述構(gòu)建體包含與在植物細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接的至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的植物”和“轉(zhuǎn)基因植物”表示基因組內(nèi)包含異源多核苷酸的植物。一般來說，所述異源多核苷酸被穩(wěn)定地整合入轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的植物的基因組內(nèi)，以致將所述多核苷酸傳遞給后代?？梢詫⑺霎愒炊嗪塑账釂为?dú)地或作為重組表達(dá)盒的一部分整合進(jìn)基因組。應(yīng)理解如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”包括基因型已通過異源核酸的存在而被改變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或者植物，包括最初如此改變的那些轉(zhuǎn)基因，以及通過有性雜交或無性繁殖從所述最初的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的那些。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”不包括借助常規(guī)植物育種方法或者借助天然發(fā)生的事件對(duì)基因組(染色體或染色體外)的改變，所述天然發(fā)生的事件諸如隨機(jī)異花受精、非重組病毒感染、非重組細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組轉(zhuǎn)座或者自發(fā)突變。如本文所用，術(shù)語“植物”包括整體植物、植物器官(例如葉、莖、根等等)、種子、植物細(xì)胞及其子代。轉(zhuǎn)基因植物的部分屬于實(shí)施方式的范圍，包括，例如，源于轉(zhuǎn)基因植物或其子代并因而至少部分由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞組成的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚胎以及花、莖、果實(shí)、葉以及根，所述轉(zhuǎn)基因植物先用實(shí)施方式的DNA分子轉(zhuǎn)化。如本文所用，術(shù)語植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可以再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物團(tuán)塊和植物細(xì)胞，其為完整的植物或者植物的部分，諸如胚胎，花粉，胚珠，種子，葉，花，枝，果實(shí)，果仁，穗，穗軸，殼，秸稈，根，根尖，花藥等等?？梢杂糜趯?shí)施方式的方法的植物種類通常與適于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物種類一樣寬泛，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者。所述植物包括例如馬鈴薯(Solanumtuberosum)和玉米(Zeamays)。雖然實(shí)施方式不依賴特定生物學(xué)機(jī)制來增加植物對(duì)植物害蟲的抗性，但是實(shí)施方式的核苷酸序列在植物中的表達(dá)可以導(dǎo)致產(chǎn)生實(shí)施方式的殺蟲蛋白以及提高所述植物對(duì)植物害蟲的抗性。實(shí)施方式的植物可以用于農(nóng)業(yè)上影響害蟲的方法。某些實(shí)施方式提供轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物植物，諸如例如玉米植物，其可以用于影響該植物的害蟲的方法，所述害蟲諸如例如歐洲玉米螟?！笆茉囍参锘蛑参锛?xì)胞”是對(duì)目的基因的諸如轉(zhuǎn)化的遺傳改造已經(jīng)生效的植物或植物細(xì)胞，或者是傳自如此改造的植物或細(xì)胞并且包含所述改造的植物或植物細(xì)胞。“對(duì)照”或“對(duì)照植物”或“對(duì)照植物細(xì)胞”提供用于測(cè)量受試植物或植物細(xì)胞表型改變的參考點(diǎn)ο對(duì)照植物或植物細(xì)胞可以包括，例如(a)野生型植物或細(xì)胞，即與遺傳改造起始材料具有相同基因型的植物或細(xì)胞，所述遺傳改造產(chǎn)生受試植物或細(xì)胞；(b)與所述起始材料具有相同基因型但已用空構(gòu)建體(即用對(duì)目的性狀無已知效果的構(gòu)建體，諸如包含標(biāo)志物基因的構(gòu)建體)轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；(c)是受試植物或植物細(xì)胞的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；(d)與所述受試植物或植物細(xì)胞在遺傳上一致但未暴露于會(huì)誘導(dǎo)目的基因表達(dá)的條件或刺激物的植物或植物細(xì)胞；或(e)受試植物或植物細(xì)胞自身，其處于目的基因不被表達(dá)的條件下。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)容易地認(rèn)同，諸如位點(diǎn)特異性誘變和隨機(jī)誘變、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法和蛋白工程化技術(shù)的分子生物學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步提供了廣泛的適當(dāng)?shù)墓ぞ吆筒僮鞑襟E，以用于改造或者工程化農(nóng)業(yè)上感興趣的蛋白的氨基酸序列和潛在的基因序列。因而，實(shí)施方式的蛋白可以以各種方式被改造，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于所述操作的方法為本領(lǐng)域所公知。例如，可以通過將突變引入合成核酸(例如DNA分子)制備殺蟲蛋白的氨基酸序列變體。用于誘變和核酸改變的方法為本領(lǐng)域所公知。例如，可以使用寡核苷酸介導(dǎo)的位點(diǎn)定向誘變技術(shù)，引入經(jīng)設(shè)計(jì)的改變。參見，例tUKunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492；Kunkeletal.(1987)MethodsinEnzymo1.154:367-382；美國專利第4，873，192號(hào)；WalkerandGaastra,eds.(1983)TechniquesinMolecularBiology(分子生物學(xué)技術(shù))(MacMillanPublishingCompany,NewYork)，以及本文所引用的文獻(xiàn)。可以修飾實(shí)施方式的突變的核苷酸序列，從而改變約1，2，3，4，5，6，8，10，12或更多個(gè)存在于所編碼多肽一級(jí)序列的氨基酸(例如，編碼SEQIDNO:4的SEQIDNO:3)?？蛇x擇地，可以引入更多的對(duì)天然序列的改變，以致所編碼蛋白可以具有至少約或2%，或者約3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，或者約13%,14%,15%,16%,17%，18%，19%，或20%，21%，22%，23%，24%，或25%，30%，35%，或40%或更多的相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型蛋白而改變或者另外修飾的密碼子。以同樣的方式，所編碼蛋白可以具有至少約1%或2%，或者約3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，或者約13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，或20%，21%，22%，23%，24%，或25%，30%，35%，或40%或更多的相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型蛋白而添加的密碼子。應(yīng)理解，實(shí)施方式的突變的核苷酸序列意在包括具有殺蟲活性的生物學(xué)功能的、等同的肽，所述殺蟲活性諸如改良的殺蟲活性，其通過抗歐洲玉米螟幼蟲的拒食素性質(zhì)來確定。所述序列的出現(xiàn)可以是因?yàn)槊艽a子冗余性和功能性等同，已知其天然地存在在核酸序列和如此編碼的蛋白內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到氨基酸添加和/或取代通?；诎被醾?cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如，所述取代基的疏水性、電荷、大小等等。具有各種前述所考慮性質(zhì)的示例性氨基酸取代基團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且包括精氨酸與賴氨酸；谷氨酸和天門冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。關(guān)于不影響目的蛋白生物學(xué)活性的適當(dāng)氨基酸取代的指南可以在Dayhoffetal.(1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(蛋白序列禾口結(jié)構(gòu)圖集)(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C)(通過引用并入本文)的模型中找到?？梢赃M(jìn)行諸如將一個(gè)氨基酸換作具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸的保守性取代。實(shí)施方式的基因和核苷酸序列因而包括天然存在的序列和突變體形式兩者。同樣地，實(shí)施方式的蛋白包括天然存在的蛋白及其變體(例如截短的多肽)和其經(jīng)修飾的(例如突變體)形式。所述變體將繼續(xù)具有所需殺蟲活性。顯然，將在編碼所述變體的核苷酸序列中產(chǎn)生的突變絕不能使所述序列不符合讀框，并且所述突變通常不會(huì)產(chǎn)生能夠產(chǎn)生mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見，歐洲專利申請(qǐng)公開文本第75，444號(hào)。本文所包括的蛋白序列的缺失、插入和取代不應(yīng)對(duì)所述蛋白的性質(zhì)產(chǎn)生劇烈改變。然而，當(dāng)在進(jìn)行取代、缺失或插入前，難以預(yù)測(cè)其確切效果時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解所述效果將通過諸如昆蟲進(jìn)食測(cè)定的常規(guī)篩選測(cè)定來評(píng)價(jià)。參見，例如，通過引用并入本文的Marroneetal.(1985)J.Econ.Entomol.78:290-293禾口CzaplaandLang(1990)J.Econ.Entomo1.83:2480_2485ο變體核苷酸序列和蛋白還包括衍生自諸如DNA重排的誘變和重組方法的序列和蛋白。利用該方法，可以操作一個(gè)或多個(gè)不同的編碼序列，從而產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的新的殺蟲蛋白。如此，可以從相關(guān)序列多核苷酸群產(chǎn)生重組多核苷酸文庫，所述相關(guān)序列多核苷酸包含具有基本的序列一致性的序列區(qū)域，并且可以在體內(nèi)或體外被同源重組。例如，使用該方法，可以在實(shí)施方式的核苷酸序列和其它已知的Cry核苷酸序列的對(duì)應(yīng)部分之間重組全長編碼序列、編碼目的結(jié)構(gòu)域的序列基序或者實(shí)施方式的核苷酸序列的任意片段，從而獲得新基因，所述新基因編碼具有改良的目的性質(zhì)的蛋白。受到關(guān)注的性質(zhì)包括但不限于每單位殺蟲蛋白的殺蟲活性、蛋白穩(wěn)定性、對(duì)非靶物種、特別是對(duì)人類、家畜以及表達(dá)實(shí)施方式的殺蟲多肽的植物和微生物的毒性。實(shí)施方式不受特定重排策略的限制，除開所述重排策略涉及至少一種實(shí)施方式的核苷酸序列或其部分。重排可以僅涉及本文所公開的核苷酸序列，或者可以另外涉及重排本領(lǐng)域已知的其它核苷酸序列。DNA重排策略為本領(lǐng)域所已知。參見，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；Cramerietal.(1997)NatureBiotech.15:436-438；Mooreetal.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhangetal.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Cramerietal.(1998)Nature391288-291；以及美國專利第5，605，793號(hào)和第5，837，458號(hào)。還可以將實(shí)施方式的核苷酸序列用于從其它生物體分離相應(yīng)的序列，所述其它生物體特別是其它細(xì)菌，更為特別地是其它芽孢桿菌菌株。如此，可以使用諸如PCR、雜交等等的方法來鑒定這些序列，所述鑒定基于其與本文所述序列的序列同源性?；谄渑c本文所述完整序列或其片段的序列一致性而選擇的序列也為實(shí)施方式所包括。這些序列包括作為所公開序列同源物的序列。術(shù)語“同源物”指衍生自共同祖先基因并且因物種形成而在不同物種中所發(fā)現(xiàn)的基因。對(duì)于在不同物種中發(fā)現(xiàn)的基因，如果其核苷酸序列和/或其所編碼的蛋白序列如本文他處所定義而享有基本的序列一致性，則被認(rèn)為是同源物。同源物的功能在物種間常常高度保守。在PCR方法中，可以設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)的寡核苷酸引物，以從提取自任何目的生物體的cDNA或基因組DNA擴(kuò)增相應(yīng)的DNA序列。設(shè)計(jì)PCR引物和PCR克隆的方法通常為本領(lǐng)域己知，并且公開于Sambrooketal.(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))(2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,Plainview,NewYork)，下文稱"Sambrook"。另參見hnisetal.，eds.(1990)PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(PCR操作步驟方法及應(yīng)用指南)(AcademicPress,NewYork)；lnnisandGelfand,eds.(1995)PCRStrategies(PCR策)(AcademicPress,NewYork)；VXRInnisandGelfand,eds.(1999)PCRMethodsManual(PCR方法手冊(cè))(AcademicPress,NewYork)。PCR的已知方法包括但不限于如下方法，所述方法使用成對(duì)引物、巢式引物、單特異性引物、簡(jiǎn)并引物、基因特異性引物、載體特異性引物、部分錯(cuò)配引物等等。在雜交技術(shù)中，將已知核苷酸序列的全部或部分用作與其它相應(yīng)核苷酸序列選擇性雜交的探針，所述其它相應(yīng)核苷酸序列存在于來自所選生物體的已克隆基因組DNA片段或cDNA片段群(即基因組文庫或cDNA文庫)。所述雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用諸如32P的可檢測(cè)基團(tuán)或其它可檢測(cè)標(biāo)志物來標(biāo)記。因而，例如，可以通過標(biāo)記基于實(shí)施方式序列的合成寡核苷酸制備雜交探針。制備雜交探針和構(gòu)建cDNA及基因組文庫的方法通常為本領(lǐng)域已知，并且公開于Sambrook。例如，可以將本文公開的完整序列或者其一個(gè)或多個(gè)部分用作能夠與對(duì)應(yīng)序列和信使RNA特異性雜交的探針。為在各種條件下完成特異性雜交，所述探針包含獨(dú)特于實(shí)施方式序列并且通常長至少約10或20個(gè)核苷酸的序列?？梢允褂盟鎏结?，以通過PCR從所選生物體擴(kuò)增相應(yīng)的Cry序列?？梢允褂迷摷夹g(shù)，以從所需生物體分離其它編碼序列，或?qū)⒃摷夹g(shù)用作診斷測(cè)定，以確定生物體是否存在編碼序列。雜交技術(shù)包括雜交篩選所接種的DNA文庫(噬菌斑或菌落；參見，例如，Sambrook)?？梢栽趪?yán)緊條件下進(jìn)行所述序列的雜交。如本文所用，術(shù)語“嚴(yán)緊條件”或“嚴(yán)緊雜交條件”表示如下條件，即在該條件下，相對(duì)于與其它序列雜交，探針將以可檢測(cè)的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)與其靶序列雜交。嚴(yán)緊條件是序列依賴性的并且在不同環(huán)境中有所不同。通過控制雜交嚴(yán)緊性和/或控制清洗條件，可以鑒定與所述探針100%互補(bǔ)的靶序列(同源探針法)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴(yán)緊條件，以允許一些序列錯(cuò)配，以便檢測(cè)較低的相似度(異源探針法)。通常，探針長度少于約1000或500個(gè)核苷酸。通常，嚴(yán)緊條件是如下的條件，即在該條件中，鹽濃度為PH7.0至8.3下，少于約1.5MNa離子，通常約0.OlM至1.0MNa離子濃度(或其它鹽)，并且溫度為用于短探針(例如10到50個(gè)核苷酸)的至少約30°C，和用于長探針(例如大于50個(gè)核苷酸)的至少約60°C。還可以通過添加諸如甲酰胺的去穩(wěn)定劑來實(shí)現(xiàn)嚴(yán)緊條件。示例性的低嚴(yán)緊條件包括37°C下使用30%至35%的甲酰胺緩沖液、IMNaClU%SDS(十二烷基硫酸鈉)雜交，50°C至55°C下在IX至2XSSC(20XSSC=3.OMNaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中清洗。示例性的中度嚴(yán)緊條件包括37°C下在40%至45%甲酰胺、1.0MNaClU%SDS中雜交，55°C至60°C下在0.5X至IXSSC中清洗。示例性的高嚴(yán)緊條件包括37°C下在50%甲酰胺、IMNaClU%SDS中雜交，60°C至65°C下在0.IXSSC中最后清洗至少約20分鐘。任選地，清洗緩沖液可以包含約0.至約SDS0雜交持續(xù)時(shí)間通常少于約M小時(shí)，通常為約4小時(shí)至約12小時(shí)。特異性通常依賴雜交后的清洗，關(guān)鍵因素在于最后清洗溶液的離子強(qiáng)度和溫度。DNA-DNA雜合體的Tm(熱力學(xué)熔點(diǎn))可以近似自MeinkothandWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式Tm=81.5"C+16.6(logΜ)+0.41(%GC)_0·61(%甲酰胺)-500/L；其中M是一價(jià)陽離子的克分子濃度，％GC是DNA中鳥苷和胞嘧啶核苷酸的百分?jǐn)?shù)，“％甲酰胺”是雜交溶液的甲酰胺百分?jǐn)?shù)，而L是雜合體的堿基對(duì)長度。Tm是(確定的離子強(qiáng)度和PH下)50%的互補(bǔ)靶序列與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度。通常將清洗至少進(jìn)行至達(dá)到平衡，并且達(dá)到低的雜交背景水平，諸如進(jìn)行2小時(shí)、1小時(shí)或30分鐘。每的錯(cuò)配對(duì)應(yīng)使Tm降低約1°C;因而，可以調(diào)節(jié)Tm、雜交和/或清洗條件，從而與所需一致性的序列雜交。例如，如果需要>90%—致性的序列，可以將Tm降低10°C。通常，將嚴(yán)緊條件選擇為比確定離子強(qiáng)度和PH下的特異序列及其互補(bǔ)序列的Tm低約5°C。然而，在非常嚴(yán)緊的條件下，可以在比所述TJS1°C、2°C、3°C或4°C下進(jìn)行雜交和/或清洗；在中度嚴(yán)緊條件下，可以在比所述Tm低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C下進(jìn)行雜交和/或清洗；在低嚴(yán)緊條件下，可以在比所述Tm低11°C、12°C、13°C、14°C、15°C或20°C下進(jìn)行雜交和/或清洗。使用所述公式、雜交和清洗組合物，以及所需Tm，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，實(shí)質(zhì)上描述了雜交和/或清洗溶液嚴(yán)緊性的變化。如果所需程度的錯(cuò)配導(dǎo)致低于45°C(水溶液)或32°C(甲酰胺溶液)的Tm，那么可以提高SSC濃度以致能夠使用更高的溫度。對(duì)核酸雜交的一般性指南參見Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes(驗(yàn)技術(shù)一核酸探針的雜交)，PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork)；以及Ausubeletal.，eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物學(xué)最新實(shí)驗(yàn)指南)，Chapter2(GreenePublishingandffiley-lnterscience,NewYork)。另見Sambrook。因而，實(shí)施方式包括分離的序列，所述分離的序列編碼實(shí)施方式的Cry蛋白并且在嚴(yán)緊條件下與本文公開的Cry序列或與其片段雜交。用以下術(shù)語描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系(a)“參考序列”，(b)“比較窗口(comparisonwindow)(c)“序列一致性”，(d)“序列一致性百分比”和(e)“基本一致性”。(a)如本文所用，“參考序列”是用作序列比較基礎(chǔ)的確定的序列。參考序列可以是指定序列的子集或整體；例如，作為全長cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。(b)如本文所用，“比較窗口”涉及多核苷酸序列的連續(xù)且指定的片段，其中比較窗口的多核苷酸序列可以包括相比于參考序列(其不包含添加或缺失)的添加或缺失(即間隔)，以對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最適比對(duì)。通常，比較窗口長至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，并且任選地可以長30，40，50，100或更長。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，為避免由多核苷酸序列包含間隔而造成的與參考序列的高相似性，通常引入間隔罰分，并將其從匹配數(shù)中減去。用于比較序列的比對(duì)方法為本領(lǐng)域已知。因而，可以使用數(shù)學(xué)算法完成對(duì)任意兩序列之間序列一致性百分比的確定。所述數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例為Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smithetal.(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部比對(duì)算法；Needleman和1Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的全局比對(duì)算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的局部搜索比對(duì)方法；如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877所改進(jìn)的Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法?？梢岳眠@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)工具，以比較序列，從而確定序列一致性。所述工具包括但不限于，PC/基因程序的CLUSTAL(可獲得自htelligenetics，MountainView,California)；ALIGN程序(2·O版)以及GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第10版)的GAP，BESTFIT,BLAST,FASTA和TFASTA(可獲得自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad,SanDiego,California,USA)0可以使用默認(rèn)參數(shù)利用這些程序進(jìn)行比對(duì)。CLUSTAL程序詳述于Higginsetal.(1988)Gene73:237-244(1988)；Higginsetal.(1989)CABIOS5151-153；Corpetetal.(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90；Huangetal.(1992)CABIOS8:155-65；以及Pearsonetal.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307_331。ALIGN程序基于上述Myers和Miller(1988)的算法。使用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可以采用PAM120權(quán)重殘基表、12的間隔長度罰分以及4的間隔罰分。Altschuletal.(1990)J.Mol.Biol.215403的BLAST程序基于上述Karlin和Altschul(1990)的算法?？梢允褂肂LASTN程序、分值=100、字長=12來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，從而獲得與編碼實(shí)施方式的蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列?？梢允褂肂LASTX程序、分值=50、字長=3來進(jìn)行BLAST蛋白搜索，從而獲得與實(shí)施方式的蛋白或多肽同源的氨基酸序列?？梢匀鏏ltschuletal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述，使用(BLAST2.0的)間隔BLAST來獲得以比較為目的的間隔比對(duì)?？蛇x擇地，可以使用(BLAST2.0的)PSI-BLAST來進(jìn)行檢測(cè)分子間遠(yuǎn)源關(guān)系的迭代搜索。參見上述Altschuletal.。使用BLAST、間隔BLAST、PSI_BLAST時(shí)，可以使用各自程序(例如，用于核苷酸序列的BLASTN、用于蛋白的BLASTX)的默認(rèn)參數(shù)。參見萬維網(wǎng)ncbi.him.nih.gov下的國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站。還可以通過檢查進(jìn)行手工比對(duì)。除非另有說明，本文提供的序列一致性/相似性值表示使用GAP第10版所獲得的值，其使用下列參數(shù)用于核苷酸序列的％—致性和％相似性，其使用50的GAP權(quán)重和3的長度權(quán)重，以及nwsgapdna.cmp評(píng)分矩陣；用于氨基酸序列的％—致性和％相似性，其使用8的GAP權(quán)重和2的長度權(quán)重，以及BL0SUM62評(píng)分矩陣；或者其任意等價(jià)程序。如本文所用，術(shù)語”等價(jià)程序”指任意序列比較程序，其為所討論的任意兩個(gè)序列而生成比對(duì)，所述比對(duì)具有與GAP第10版所生成的相應(yīng)比對(duì)相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列一致性百分比。GAP使用上述Needleman和^msch(1970)的算法，以尋找最大化匹配數(shù)且最小化間隔數(shù)的對(duì)兩條完整序列的比對(duì)。GAP考慮了所有可能的比對(duì)和間隔位置，并生成具有最大匹配堿基數(shù)和最少間隔的比對(duì)。它允許提供匹配堿基單元的間隔生成罰分和間隔延伸罰分。對(duì)于其插入的每一間隔，GAP必須利用匹配的間隔生成罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于0的間隔延伸罰分，則對(duì)于每一插入的間隔，GAP必須另外利用間隔長度乘間隔延伸罰分。對(duì)于蛋白序列，GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包(第10版)的默認(rèn)間隔生成罰分值和間隔延伸罰分值分別是8和2。對(duì)于核苷酸序列，該默認(rèn)間隔生成罰分是50，而默認(rèn)間隔延伸罰分是3。間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以表示為選自0至200的整數(shù)。因而，例如，間隔生成罰分和間隔延伸罰分可以是0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65或更大。GAP代表最佳比對(duì)家族中的一個(gè)成員。該家族可能有許多成員，但其他成員的質(zhì)量都不如GAP。GAP顯示比對(duì)的4個(gè)價(jià)值數(shù)字品質(zhì)(Quality)、比率(Ratio)、一致性和相似性。品質(zhì)是為了比對(duì)序列而最大化的度量。比率是品質(zhì)除以較短片段中堿基的數(shù)目。一致性百分比是實(shí)際匹配的符號(hào)的百分比。相似性百分比是相似符號(hào)的百分比。忽略跨越間隔的符號(hào)。當(dāng)符號(hào)對(duì)的評(píng)分矩陣值大于或等于0.50(相似性閾值)時(shí)，對(duì)相似性進(jìn)行評(píng)分。GCGWisconsin遺傳學(xué)軟件包第10版所用的得分矩陣是BL0SUM62(參見HenikoffandHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915)。(c)如本文所用，兩條核酸或多肽序列上下文中的“序列一致性”或“一致性”指當(dāng)在指定的比較窗口內(nèi)比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，兩條序列中相同的殘基。對(duì)于蛋白，當(dāng)使用序列一致性百分比時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到不一致的殘基位置經(jīng)常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸殘基被用于取代具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基，并因此不改變?cè)摲肿拥墓δ苄再|(zhì)。當(dāng)序列在保守取代方面不同時(shí)，可上調(diào)序列一致性百分比，以校正取代的保守特性。由這類保守性取代而不同的序列被認(rèn)為具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行這種調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。通常，這涉及將保守性取代評(píng)分為部分而不是完全的錯(cuò)配，從而提高序列一致性百分比。因此，例如，如果將一致的氨基酸的得分給定為1，而將非保守性取代的得分給定為0，則將保守性取代的得分給定為0至1。如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California)中所執(zhí)行的,計(jì)算保守性取代得分。(d)如本文所用，“序列一致性百分比”表示通過相對(duì)于比較窗口而比較兩條最適比對(duì)的序列而確定的值，其中，為了最適比對(duì)兩條序列，比較窗口中多核苷酸序列的部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可以包含添加或缺失(即間隔)。百分比通過以下計(jì)算確定兩條序列中一致的核酸堿基或氨基酸殘基均存在的位置的數(shù)目，從而得出匹配位置的數(shù)目，用比較窗口中位置總數(shù)除匹配位置的數(shù)目，并且將結(jié)果乘以100，從而得出序列一致性百分比。(e)(i)術(shù)語多核苷酸序列的“基本一致性”表示多核苷酸包含利用使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的所述比對(duì)程序之一時(shí)，與參考序列具有至少70^^80^^90%或95%或更高的序列一致性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值，以確定兩個(gè)核苷酸序列所編碼蛋白的相應(yīng)的一致性，所述確定考慮了密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、讀框定位(readingframepositioning)等等。用于這些目的的氨基酸序列基本一致性通常表示具有至少60%、70%、80%、90%或95%的序列一致性或更高的序列一致性。如果兩個(gè)分子在嚴(yán)緊條件下相互雜交，也說明核苷酸序列基本一致。通常，在確定的離子強(qiáng)度和PH下，選擇嚴(yán)緊條件，使其比特定序列的Tm低約5°C。然而，嚴(yán)緊條件包括比Tm低約1°C至20°C范圍的溫度，這取決于如本文另外所定性的所需嚴(yán)緊度。如果嚴(yán)緊條件下不相互雜交的核酸所編碼的多肽是基本一致的，所述核酸則仍是基本一致的。這可以出現(xiàn)在，例如，當(dāng)使用遺傳密碼所允許的最大密碼子簡(jiǎn)并性而產(chǎn)生的核酸拷貝時(shí)。如果第一核酸編碼的多肽與第二核酸編碼的多肽具有免疫交叉反應(yīng)性，那么說明兩個(gè)核酸序列基本一致。(e)(ii)肽上下文的術(shù)語“基本一致性”表示在指定的比較窗口，肽包含與參考序列具有至少70%、80%、85%、90%、95%或更高序列一致性的序列。使用上述Needleman和Wunsch(1970)的全局比對(duì)算法，能進(jìn)行用于這些目的的最適比對(duì)。一個(gè)肽與針對(duì)另一肽制備的抗體具有免疫反應(yīng)性，說明兩個(gè)肽序列基本一致。因而，肽與另一肽基本一致，例如，其中該兩個(gè)肽僅因保守取代而不同?！盎鞠嗨频摹彪墓灿腥缟纤龅男蛄校灰恢碌臍埢恢每梢砸虮Ｊ匕被岣淖兌煌?。術(shù)語“核苷酸構(gòu)建體”在本文的使用并非意在將實(shí)施方式限于包含DNA的核苷酸構(gòu)建體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，核苷酸構(gòu)建體、特別是由核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合所構(gòu)成的多核苷酸和寡核苷酸也可以用于本文所公開的方法。實(shí)施方式的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列另外包括所述構(gòu)建體、分子和序列的所有互補(bǔ)形式。此外，實(shí)施方式的核苷酸構(gòu)建體、核苷酸分子和核苷酸序列包括能用于實(shí)施方式的轉(zhuǎn)化植物方法的所有核苷酸構(gòu)建體、分子和序列，包括但不限于由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及其組合所構(gòu)成的那些。所述脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成類似物兩者。實(shí)施方式的核苷酸構(gòu)建體、核酸和核苷酸序列還包括核苷酸構(gòu)建體的所有形式，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)等等。另一實(shí)施方式涉及轉(zhuǎn)化的生物體，諸如選自植物和昆蟲細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、原生動(dòng)物、線蟲和藻的生物體。轉(zhuǎn)化的生物體包含實(shí)施方式的DNA分子、包含所述DNA分子的表達(dá)盒或包含所述表達(dá)盒的載體，其可以穩(wěn)定地并入所轉(zhuǎn)化生物體的基因組。在DNA構(gòu)建體中提供實(shí)施方式的序列，所述構(gòu)建體用于在目的生物體中表達(dá)。所述構(gòu)建體包括與實(shí)施方式的序列可操作地連接的5’和3’調(diào)節(jié)性序列。本文所用術(shù)語“可操作地連接”表示啟動(dòng)子和另一序列之間的功能性連接，其中所述啟動(dòng)子序列起始并介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于所述另一序列的DNA序列的轉(zhuǎn)錄。通常，可操作地連接表示被連接的核酸序列是鄰接的，并且當(dāng)需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)時(shí)，是鄰接且在相同讀框內(nèi)的。所述構(gòu)建體可以另外包含至少一個(gè)被共轉(zhuǎn)化進(jìn)生物體的另外的基因?？蛇x擇地，可以在多DNA構(gòu)建體上提供另外的一個(gè)或多個(gè)基因。所述DNA構(gòu)建體具有多個(gè)用于插入Cry毒素序列的限制性位點(diǎn)，所述Cry毒素序列將位于調(diào)節(jié)性區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。所述DNA構(gòu)建體可以另外包含可選擇的標(biāo)志物基因。按5’到3’的轉(zhuǎn)錄方向，DNA構(gòu)建體包含轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)(即啟動(dòng)子)、實(shí)施方式的DNA序列以及在用作宿主的生物體內(nèi)具有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)(即終止區(qū))。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(即啟動(dòng)子)相對(duì)于宿主生物體和/或?qū)嵤┓绞降男蛄校梢允峭吹?、類似物的、外源的或異源的。另外，所述啟?dòng)子可以是天然序列或者可選擇地是合成序列。本文所用術(shù)語“外源的”表示在引入啟動(dòng)子的同源生物體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子。當(dāng)所述啟動(dòng)子相對(duì)于實(shí)施方式的序列是“外源的”或“異源的”時(shí)，意在表明該啟動(dòng)子不是實(shí)施方式中可操作地連接的序列的同源的或天然存在的啟動(dòng)子。如本文所用，嵌合基因包含與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可操作地連接的編碼序列，所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于所述編碼序列是異源的。當(dāng)啟動(dòng)子是同源或天然的序列時(shí)，可操作地連接的序列的表達(dá)改造自野生型表達(dá)，這導(dǎo)致表型的改變。終止區(qū)可以與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)是同源的，可以與可操作地連接的目的DNA序列是同源的，可以與植物宿主是同源的，或者可以得自另一來源(即，相對(duì)于啟動(dòng)子、目的序列、植物宿主或其任一組合是外源的或異源的)。可以從根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)Ti質(zhì)粒獲得方便的終止區(qū)，諸如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另見Guerineauetal.(1991)Mol.Gen.Genet.262141-144；Proudfoot(1991)Cell64671-674；Sanfaconetal.(1991)GenesDev.5141-149；Mogenetal.(1990)PlantCell21261-1272；Munroeetal.(1990)Gene91151-158；Ballasetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:7891_7903；和Joshietal.(1987)NucleicAcidRes.15:9627-9639。適當(dāng)時(shí)可以優(yōu)化核酸以提高在宿主生物體中的表達(dá)。因而，如果宿主生物體是植物，可以使用植物偏好密碼子來合成合成的核酸，從而改良表達(dá)。參見，例如，CampbellandGowri(1990)PlantPhysiol.921-11，對(duì)宿主偏好密碼子使用的討論。例如，雖然在單子葉植物和雙子葉植物物種中均可以表達(dá)實(shí)施方式的核酸序列，但是可以修飾序列，以解決單子葉植物或雙子葉植物特異的密碼子偏好和GC含量偏好，這是因?yàn)檫@些偏好已經(jīng)表現(xiàn)出了差異(Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17:477_498)。因而，特定氨基酸的玉米偏好密碼子可以衍生自玉米的已知基因序列。28條玉米植物基因的玉米密碼子使用列于上文Murrayetal.的表4。本領(lǐng)域可以獲得合成植物偏好基因的方法。參見，例如，美國專利第5，380，831號(hào)和第5，436，391號(hào)，和Murrayetal.(1989)NucleicAcidsRes.17477-498，其通過引用并入本文。已知另外的序列修飾來增強(qiáng)細(xì)胞宿主的基因表達(dá)。這些包括清除序列，所述序列編碼假的多聚腺苷化信號(hào)、外顯子_內(nèi)含子剪接位點(diǎn)信號(hào)、轉(zhuǎn)座子樣重復(fù)和可能不利于基因表達(dá)的其它良好表征的序列?？梢詫⑿蛄械腉C含量調(diào)節(jié)至給定細(xì)胞宿主的平均水平，其參考在該宿主細(xì)胞表達(dá)的已知基因而計(jì)算。本文所用術(shù)語“宿主細(xì)胞”指包含載體且支持該表達(dá)載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是諸如大腸桿菌的原核細(xì)胞，或者是諸如酵母、昆蟲、兩棲類或哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或者單子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞的真核細(xì)胞。單子葉植物宿主細(xì)胞的實(shí)例是玉米宿主細(xì)胞。如果可能，則修飾序列以避免預(yù)期的發(fā)夾mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。表達(dá)盒可以另外包含5’前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列能發(fā)揮增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列為本領(lǐng)域已知并且包括小核糖核酸病毒前導(dǎo)序列，例如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎5’非編碼區(qū))(Elroy-Steinetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:6126-6130)；馬鈴薯Y病毒前導(dǎo)序列，例如TEV前導(dǎo)序列(煙草蝕刻病毒)(Gallieetal.(1995)Gene165(2):233_238)，MDMV前導(dǎo)序列(玉米矮小花葉病毒)，人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)(Macejaketal.(1991)Nature353:90-94)；苜蓿花葉病毒外殼蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)序歹Ij(Joblingetal.(1987)Nature325:622-625)；煙草花葉病毒前導(dǎo)序列(TMV)(Gallieetal.(1989)inMolecularBiologyofRNA(RNA的分子生物學(xué))，ed.Cech(Liss,NewYork),pp.237-256)；以及玉米萎黃斑點(diǎn)病毒前導(dǎo)序列(MCMV)(Lommeletal.(1991)Virology81:382-385)。另見Della-Cioppaetal.(1987)PlantPhysiol.84:965_968。在制備表達(dá)盒時(shí)，可以操作各種DNA片段以提供合適方向的和適當(dāng)時(shí)合適讀框的DNA序列。為達(dá)到這一目的，可以采用接頭或連接子來連接DNA片段，或者可以涉及其它操作來提供方便的限制性位點(diǎn)、移除多余DNA、移除限制性位點(diǎn)等等。為了這一目的，可以涉及體外誘變，引物修復(fù)，限制性，退火，再取代，例如轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)0在實(shí)踐實(shí)施方式時(shí)可以使用大量啟動(dòng)子?？梢曰谒杞Y(jié)果選擇啟動(dòng)子?？梢允购怂崤c組成型、組織偏好型、誘導(dǎo)型或用于在宿主生物體中表達(dá)的其它啟動(dòng)子組合。用于植物宿主細(xì)胞的合適的組成型啟動(dòng)子包括，例如，Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子和WO99/43838及美國專利第6，072，050號(hào)所公開的其它組成型啟動(dòng)子；核心CaMV35S啟動(dòng)子(Odelletal.(1985)Nature313:810-812)；水稻肌動(dòng)蛋白(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171)；泛素(Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12619-632andChristensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18:675_689)；pEMU(Lastetal.(1991)TheorAppl.Genet.81:581_588)；MAS(Veltenetal.(1984)EMBOJ.3:2723_2730)；ALS啟動(dòng)子(美國專利第5，659，026號(hào))等等。其它組成型啟動(dòng)子包括，例如，公開于美國專利第5，608，149號(hào)；第5，608，144號(hào)；第5，604，121號(hào)；第5，569，597號(hào)；第5，466，785號(hào)；第5，399，680號(hào)；第5，268，463號(hào)；第5，608，142號(hào)；和第6，177，611號(hào)的那些。從誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)基因可以是有益的，這取決于所需結(jié)果。對(duì)于調(diào)節(jié)實(shí)施方式的核苷酸序列在植物中的表達(dá)，傷口誘導(dǎo)型(wound-inducible)啟動(dòng)子有特別的好處。所述傷口誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以對(duì)昆蟲取食造成的損傷產(chǎn)生反應(yīng)，并且包括馬鈴薯蛋白酶抑制齊[J(pinII)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28425-449；Duanetal.(1996)NatureBiotechnology14:494_498)；wunl和wun2,美國專利第5，428，148號(hào)；winl禾口win2(Stanfordetal.(1989)Mol.Gen.Genet.215200-208)；systemin(McGurletal.(1992)Science225:1570-1573)；WIPl(Rohmeieretal.(1993)PlantMol.Biol.22783-792；Eckelkampetal.(1993)FEBSLetters323:73-76)；MPI基因(Corderoketal.(1994)PlantJ.6(2):141_150)；等等，其通過引用并入本文。此外，可以在實(shí)施方式的方法和核苷酸構(gòu)建體中采用病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括來自致病相關(guān)蛋白(I3R蛋白)的那些，其在受病原體感染后被誘導(dǎo)；例如，I3R蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等等。參見，例如，Redolfietal.(1983)Neth.J.PlantPathol.89245-254；Uknesetal.(1992)PlantCell4645-656;和VanLoon(1985)PlantMol.Virol.4:111_116。另見WO99/43819，其通過引用并入本文。在病原體感染部位或在該部位附近局部表達(dá)的啟動(dòng)子引人注目。參見，例如Marineauetal.(1987)PlantMol.Biol.9335-342；Mattonetal.(1989)MolecularPlant-MicrobeInteractions(植物-微生物的分子水平的相互作用)2:325-331；Somsischetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA832427-2430；Somsischetal.(1988)Mol.Gen.Genet.293-98；禾口Yang(1996)Proc.Natl.AcacLSci.USA93:14972-14977。另見Chenetal.(1996)PlantJ.10955-966；Zhangetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA912507-2511；Warneretal.(1993)PlantJ.3191-201；Siebertzetal.(1989)PlantCell1:961_968；美國專利第5，750，386號(hào)(線蟲誘導(dǎo)型)；并且這些參考文獻(xiàn)為本文所引用。玉米PRms基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子特別引人注目，其表達(dá)受病原體串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)誘導(dǎo)(參見，例如，Corderoetal.(1992)Physiol.Mol.PlantPath.41189-200)?？梢允褂没瘜W(xué)品調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，通過應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)物來調(diào)節(jié)基因在植物中的表達(dá)。依目的而定，啟動(dòng)子可以是化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中化學(xué)品的應(yīng)用誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者化學(xué)品阻遏啟動(dòng)子，其中化學(xué)品的應(yīng)用阻遏基因表達(dá)。化學(xué)品誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為本領(lǐng)域已知，并且包括，但不限于，玉米In2-2啟動(dòng)子，其為苯磺酰胺除草劑安全劑所激活，玉米GST啟動(dòng)子，其為用作萌前型除草劑的疏水親電子化合物所激活，以及煙草PR-Ia啟動(dòng)子，其為水楊酸所激活。其它所關(guān)注的化學(xué)品調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括類固醇反應(yīng)性啟動(dòng)子(參見，例如，Schenaetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8810421-10425和McNellisetal.(1998)PlantJ.14(2):247_257中的糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)以及四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動(dòng)子(參見，例如，Gatzetal.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229_237和美國專利第5，814，618號(hào)和第5，789，156號(hào))，其通過引用并入本文?？梢岳媒M織偏好啟動(dòng)子將增強(qiáng)的殺蟲蛋白表達(dá)靶定在特定植物組織內(nèi)。組織偏好啟動(dòng)子包括以下所討論的那些，Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kawamataetal.(1997)PlantCellPhysiol.38(7):792_803；Hansenetal.(1997)Mol.GenGenet.254(3)337-343；Russelletal.(1997)TransgenicRes.6(2):157-168;Rinehartetal.(1996)PlantPhysiol.112(3):1331_1341；VanCampetal.(1996)PlantPhysiol.112(2)525-535；Canevascinietal.(1996)PlantPhysiol.112(2):513_524;Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)773~778；Lam(1994)ResultsProb1.CellDiffer.20181-196；Orozcoetal.(1993)PlantMolBiol.23(6):1129-1138;Matsuokaetal.(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA90(20):9586_9590；禾口Guevara—Garciaetal.(1993)PlantJ.4(3):495_505。如有必要，可以為弱表達(dá)修飾這些啟動(dòng)子。葉偏好啟動(dòng)子為本領(lǐng)域已知。參見，例如，Yamamotoetal.(1997)PlantJ.12(2)255-265；Kwonetal.(1994)PlantPhysiol.105357-67；Yamamotoetal.(1994)PlantCellPhysiol.35(5)773-778；Gotoretal.(1993)PlantJ.3509-18；Orozcoetal.(1993)PlantMol.Biol.23(6)1129-1138；和Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586_9590。根偏好或根特異性啟動(dòng)子是已知的，并且可以選自可由文獻(xiàn)獲得的許多啟動(dòng)子，或者從各種可相容物種重新分離。參見，例如，Hireetal.(1992)PlantMol.Biol.20(2)207-218(大豆根特異性谷氨酰胺合成酶基因)；KellerandBaumgartner(1991)PlantCell3(10):1051-1061(法國菜豆GRP1.8基因的根特異性控制元件)；Sangeretal.(1990)PlantMol.Biol.14(3):433_443(根癌農(nóng)桿菌甘露堿合酶(MAS)基因的根特異性啟動(dòng)子)；和Miaoetal.(1991)PlantCell3(1):11_22(編碼胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶(GS)的全長cDNA克隆，其在大豆根和根瘤中表達(dá))。另見Boguszetal.(1990)PlantCell2(7):633-641，其中描述了分離自血色素基因的兩種根特異性啟動(dòng)子，所述基因來自固氮的非豆科糙葉山黃麻(Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮的非豆科山黃麻(Trematomentosa)0使這些基因的啟動(dòng)子與β-葡糖苷酸酶報(bào)告基因相連，并被引入非豆科煙草(Nicotianatabacum)和豆科百脈根(Lotuscorniculatus)兩者，并且在兩例中均保留了根特異性啟動(dòng)子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)的高表達(dá)rolC和rolD根誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子的分析(參見PlantScience(Limerick)79(1):69_76)。他們的結(jié)論是增強(qiáng)子和組織偏好DNA決定子在這些啟動(dòng)子中分離。Teerietal.(1989)使用與IacZ的基因融合，來表明編碼章魚堿合酶的農(nóng)桿菌T-DNA基因在根尖表皮尤其活躍，并且TR2’基因在完整植物中是根特異性的，且因葉組織受傷而被刺激，這是與殺昆蟲或殺幼蟲基因聯(lián)用所尤其需要的特征組合(參見EMBOJ.8(2):343-350)。與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1，基因表現(xiàn)類似的特征。另外的根偏好啟動(dòng)子包括VfEN0D-GRP3基因啟動(dòng)子(Kusteretal.(1995)PlantMol.Biol.29(4)759-772)；以及rolB啟動(dòng)子(Capanaetal.(1994)PlantMol.Biol.25(4)681-691。另見美國專利號(hào)5，837，876；5，750，386；5，633，363；5，459，252；5，401，836；5，110，732；和5，023，179。“種子偏好”啟動(dòng)子包括“種子特異性”啟動(dòng)子(在種子發(fā)育中具有活性的那些啟動(dòng)子，諸如種子貯藏蛋白的啟動(dòng)子)和“種子萌發(fā)”啟動(dòng)子(在種子萌發(fā)中具有活性的那些啟動(dòng)子)兩者。參見Thompsonetal.(1989)BioEssays10108，其通過引用并入本文。所述種子偏好啟動(dòng)子包括，但不限于，Ciml(細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的信息)；CZ19B1(玉米19kDa玉米蛋白)；以及milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)(參見美國專利第6，225，529號(hào)，其通過引用并入本文)。Y-玉米蛋白和Glob-I是胚乳特異性啟動(dòng)子。對(duì)于雙子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于，豆β-菜豆蛋白、napin、β-伴球蛋白(β-conglycinin)、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等等。對(duì)于單子葉植物，種子特異性啟動(dòng)子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy、shrunken1、shrunken2、球蛋白1等等。另見W000/12733，其中公開了來自endl和end2基因的種子偏好啟動(dòng)子；其通過引用并入本文。具有特定組織“偏好”表達(dá)的啟動(dòng)子在該組織的表達(dá)的程度比在至少一種其它植物組織中的表達(dá)程度高。一些組織偏好的啟動(dòng)子表現(xiàn)幾乎專門在特定組織中表達(dá)。當(dāng)需要低水平表達(dá)時(shí)，可以使用弱啟動(dòng)子。通常，如本文所用的術(shù)語”弱啟動(dòng)子”指驅(qū)動(dòng)編碼序列低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。低水平表達(dá)意指約1/1000轉(zhuǎn)錄本至約1/100，000轉(zhuǎn)錄本至約1/500，000轉(zhuǎn)錄本的水平?？蛇x擇地，應(yīng)認(rèn)識(shí)到術(shù)語”弱啟動(dòng)子”還包括僅在少數(shù)細(xì)胞而不在其它細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)表達(dá)從而造成總的低水平表達(dá)的啟動(dòng)子。當(dāng)啟動(dòng)子以不可接受的高水平驅(qū)動(dòng)表達(dá)時(shí)，可以缺失或修飾該啟動(dòng)子序列的部分從而降低表達(dá)水平。所述弱組成型啟動(dòng)子包括，例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子(W099/43838和美國專利第6，072，050號(hào))、353CaMV核心啟動(dòng)子等等。其它的組成型啟動(dòng)子包括，例如，公開于美國專利號(hào)5，608，149；5，608，144；5，604，121；5，569，597；5，466，785；5，399，680；5，268，463；5,608，142；和6，177，611的那些；其通過引用并入本文。通常，表達(dá)盒會(huì)包括用于選擇所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可選擇標(biāo)志物基因。利用可選擇標(biāo)志物基因選擇所轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。標(biāo)志物基因包括編碼抗生素抗性的基因，諸如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(NEO)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)的那些，以及賦予除草劑化合物抗性的基因，所述化合物諸如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4_二氯苯氧乙酸(2，4-D)。適當(dāng)?shù)目蛇x擇標(biāo)志物基因的另外實(shí)例包括但不限于，編碼對(duì)以下物質(zhì)的抗性的基因，所述物質(zhì)為氯霉素(HerreraEstrellaetal.(1983)EMBOJ.2987-992)；甲氨蝶呤(HerreraEstrellaetal.(1983)Nature303:209—213;禾口Meijeretal.(1991)PlantMol.Biol.16807-820)；鏈霉素(Jonesetal.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86_91)；壯觀霉素(Bretagne-Sagnardetal.(1996)TransgenicRes.5:131_137)；博來霉素(Hilleetal.(1990)PlantMol.Biol.7171-176)；磺胺藥物(Guerineauetal.(1990)PlantMol.Biol.15127-136)；溴苯腈(Stalkeretal.(1988)Science242:419-423)；草甘膦(Shawetal.(1986)Science233:478_481；和美國申請(qǐng)序列號(hào)10/004，357和10/427,692)；草銨膦(DeBlocketal.(1987)EMBOJ.6:2513_2518)。通常參見，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3506-511；Christophersonetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA896314-6318；Yaoetal.(1992)Cell7163-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.62419-2422；Barkleyetal.(1980)inTheOperon,pp.177-220；Huetal.(1987)Cell48-.555-566；Brownetal.(1987)Cell49603-612；Figgeetal.(1988)Cell52:713-722；Deuschleetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA865400-5404；Fuerstetal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA862549-2553；Deuschleetal.(1990)Science248480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(海德堡大學(xué)博士論文)；Reinesetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA901917-1921；Labowetal.(1990)Mol.Cell.Biol.103343-3356；Zambrettietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA893952-3956；Baimetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:5072-5076;Wyborskietal.(1991)NucleicAcidsRes.194647-4653；Hillenand-ffissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10143-162；Degenkolbetal.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.351591-1595；Kleinschnidtetal.(1988)Biochemistry27:1094—1104;Bonin(1993)Ph.D.Thesis,UniversityofHeidelberg(海德堡大學(xué)博士論文)；Gossenetal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547—5551；Olivaetal.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36913-919；Hlavkaetal.(1985)HandbookofExperimentalPharmacology(實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊(cè))，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)；和Gilletal.(1988)Nature334:721-724。所述公開通過引用并入本文。以上所列可選擇標(biāo)志物基因并非意在限制。實(shí)施方式可以使用任一可選擇標(biāo)志物基因。實(shí)施方式的方法涉及將多肽或多核苷酸引入植物?！币搿币庠诒硎鞠蛑参锍蔬f多核苷酸或多肽，以致該序列進(jìn)入所述植物的細(xì)胞內(nèi)部。實(shí)施方式的方法不依賴將多核苷酸或多肽引入植物的特定的方法，只要所述多核苷酸或多肽進(jìn)入所述植物的至少一個(gè)細(xì)胞的內(nèi)部。將多核苷酸或多肽引入植物的方法為本領(lǐng)域已知，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法和病毒介導(dǎo)的方法?！胺€(wěn)定轉(zhuǎn)化”意在表示引入植物的核苷酸構(gòu)建體整合進(jìn)植物基因組，并且能夠遺傳給其子代。“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”意在表示多核苷酸被引入植物但不整合進(jìn)植物基因組，或者多肽被引入植物。轉(zhuǎn)化操作步驟和將核苷酸序列引入植物的操作步驟可以因作為轉(zhuǎn)化靶標(biāo)的植物或植物細(xì)胞的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)而不同。將核苷酸序列引入植物細(xì)胞繼而插入該植物基因組的適當(dāng)方法包括顯微注射(Crosswayetal.(1986)Biotechniques4:320_334)，電穿孑L(Riggsetal.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(美國專利第5，563，055號(hào)和第5，981，840號(hào))，直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowskietal.(1984)EMBOJ.3:2717_2722)，和彈道顆粒加速(參見，例如，美國專利號(hào)4,945,050；5，879，918；5，886，244；和5，932，782；Tomesetal.(1995)inPlantCell,Tissue,andOrganCulturefundamentalMethods(^^ffl^和器官培養(yǎng)基礎(chǔ)方法)，ed.GamborgandPhillips(Springer-Verlag,Berlin)；和McCabeetal.(1988)Biotechnology6:923-926)；和Lecl轉(zhuǎn)化(W000/28058)。對(duì)于馬鈴薯轉(zhuǎn)化，參見Tuetal.(1998)PlantMolecularBiology37:829_838和Chongetal.(2000)TransgenicResearch9:71-78。另外的轉(zhuǎn)化方法可以在以下文獻(xiàn)中找至lj，Weissingeretal.(1988)Ann.Rev.Genet.22421-477；Sanfordetal.(1987)ParticulateScienceandTechnology5:27_37(洋蔥)；Christouetal.(1988)PlantPhysiol.87:671_674(大豆)；McCabeetal.(1988)Bio/Technology6:923_926(大豆)；FinerandMcMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singhetal.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319_324(大豆)；Dattaetal.(1990)Biotechnology8736-740(7jCM)；Kleinetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305_4309(玉米)；Kleinetal.(1988)Biotechnology6^59-563(玉米)；美國專利號(hào)5，240，855；5,322,783和5，324，646;Kleinetal.(1988)PlantPhysiol.91440-444(玉米)；Frommetal.(1990)Biotechnology8:833_839(玉米)；Hooykaas-VanSlogterenetal.(1984)Nature(London)311:763-764；美國專利第5,736,369號(hào)(谷類)；Bytebieretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345_5349(百合科)；DeWetetal.(1985)inTheExperimentalManipulationofOvuleTissues(胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操作)，ed.Chapmanetal.(Longman,NewYork),pp.197-209(花粉)；Kaeppleretal.(1990)PlantCellReports9:415_418禾口Kaeppleretal.(1992)Theor.Appl.Genet.84560-566(whisker介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化)；D'Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505(電穿孔)；Lietal.(1993)PlantCellReports12:250_255和ChristouandFord(1995)AnnalsofBotany75:407_413(7jC稻)；Osjodaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750(玉米，通過根癌農(nóng)桿菌)；以上所有均通過引用并入本文。在具體實(shí)施方式中，可以使用各種瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法向植物提供實(shí)施方式的序列。所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，將Cry毒素蛋白或其變體和其片段直接引入植物，或者將Cry毒素轉(zhuǎn)錄本引入所述植物。所述方法包括，例如，顯微注射或顆粒轟擊。參見，例如，Crosswayetal.(1986)MolGen.Genet.202179-185；Nomuraetal.(1986)PlantSci.4453-58；Hepleretal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91:2176_2180禾口Hushetal.(1994)TheJournalofCellScience107:775_784，以上所有均通過引用并入本文。可選擇地，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)能將Cry毒素的多核苷酸瞬時(shí)轉(zhuǎn)化進(jìn)植物。所述技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及對(duì)多核苷酸的沉淀以致阻止DNA隨后的釋放。因而，可以發(fā)生從顆粒結(jié)合的DNA的轉(zhuǎn)錄，但是它被釋放而整合進(jìn)基因組的頻率大大降低。所述方法包括使用聚乙亞胺包被的顆粒(PEI；Sigma#P3143)。本領(lǐng)域已知在植物基因組特定位置靶向插入多核苷酸的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)在所需基因組位置插入多核苷酸。參見，例如，W099/25821,W099/25854,W099/25840,W099/25855和W099/25853，以上所有均通過引用并入本文。簡(jiǎn)言之，實(shí)施方式的多核苷酸可以包含在轉(zhuǎn)移盒內(nèi)，所述轉(zhuǎn)移盒側(cè)翼連接兩個(gè)非一致的重組位點(diǎn)。將該轉(zhuǎn)移盒引入植物，所述植物具有穩(wěn)定并入其基因組中的靶位點(diǎn)，所述靶位點(diǎn)側(cè)翼為對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)移盒位點(diǎn)的兩個(gè)非一致的重組位點(diǎn)。提供合適的重組酶，轉(zhuǎn)移盒于靶位點(diǎn)被整合。因而，目的多核苷酸于植物基因組中特定的染色體位置被整合。依照常規(guī)方式，可以使已被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長成植物。參見，例如，McCormicketal.(1986)PlantCellReports5:81_84。隨后可以使這些植物生長，并且用相同的轉(zhuǎn)化品系或不同品系授粉，鑒定具有所需表型特征的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)的所得雜合體。可以生長兩代或更多代，從而保證所需表型特征的表達(dá)保持穩(wěn)定并被遺傳，隨后收獲種子，以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。可以通過使植物與病毒或病毒核酸接觸，向植物提供實(shí)施方式的核苷酸序列。通常，所述方法涉及在病毒DNA或RNA分子內(nèi)并入目的核苷酸構(gòu)建體。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以最初將實(shí)施方式的重組蛋白作為病毒聚合蛋白的部分來合成，隨后可以通過體內(nèi)或體外的蛋白水解來處理所述聚合蛋白，從而產(chǎn)生所需殺蟲蛋白。還應(yīng)認(rèn)識(shí)到包含實(shí)施方式殺蟲蛋白的氨基酸序列的至少一部分的這種病毒聚合蛋白可以具有所需的殺蟲活性。實(shí)施方式包括所述病毒聚合蛋白以及編碼它們的核苷酸序列。向植物提供核苷酸構(gòu)建體并在植物中產(chǎn)生所編碼蛋白的方法為本領(lǐng)域已知，其涉及病毒DNA或RNA分子。參見，例如，美國專利號(hào)5，889，191；5，889，190；5，866，785；5，589，367；和5，316，931；其通過引用并入本文。實(shí)施方式還涉及實(shí)施方式的所轉(zhuǎn)化植物的植物繁殖材料，包括但不限于種子，塊莖，球莖，鱗莖，葉，和根與芽的插條。實(shí)施方式可以用于轉(zhuǎn)化任意植物物種，包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物。所關(guān)注植物的實(shí)例包括但不限于玉米(Zeamays)、蕓苔屬(Brassica)的種(如油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.jimcea))，特別是可用作籽油來源的那些蕓苔屬WfK(Medicagosativa)Λ7ΚΜ(Oryzasativa)ΛMM(Secalecereale)Λι^(Sorghumbicolor、Sorghumvulgare)、粟(如狼尾草(Pennisetumglaucum)、黍(Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、禾參子(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthusannuus)、紅花(Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉(海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉(Gossypiumhirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffeaspp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananascomosus)、柑桔(Citrusspp.)、可可(Theobromacacao)、荼(Camelliasinensis)、香蕉(Musaspp·)、魚萼梨(Perseaamericana)、無花果(Ficuscasica)、番石^(Psidiumguajava)λ^^(Mangiferaindica)λ^(Oleaeuropaea)(Caricapapaya)、腰果(Anacardiumoccidentale)、堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、杏(Prunusamygdalus)、舌甘胃(Betavulgaris)^M(Saccharumspp.)λMM-XM-WM-MMW.^^及針葉樹。蔬菜包括番爺(Lycopersiconesculentum)、萵苣(Lactucasativa)、菜豆(Phaseolusvulgaris)、禾1J馬豆(Phaseoluslimensis)、豆豆(Lathyrusspp.)、以及黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜(C.sativus)、羅馬甜瓜(C.cantalupensis)以及甜瓜(C.melo)。觀賞植物包括杜鵑花(Rhododendronspp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、木槿(Hibiscusrosasanensis)、玫瑰(Rosaspp.)、郁金香(Tulipaspp.)、/K仙花(Narcissusspp.)、矮牽牛(Petuniahybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、猩猩木(Euphorbiapulcherrima)以及菊花?？捎糜趯?shí)踐實(shí)施方式的針葉樹包括例如松，諸如火炬松(Pinustaeda)、濕地松(Pinuselliotii)、西黃松(Pinusponderosa)、黑松(Pinuscontorta)以及福射松(Pinusradiata)；花旗松(Pseudotsugamenziesii)；力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis)；白云杉(Piceaglauca)；紅杉(Sequoiasempervirens)；真冷杉，諸如銀冷杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；以及雪松，諸如西方紅色雪松(Thujaplicata)和阿拉斯加黃柏(Chamaecyparisnootkatensis)。實(shí)施方式的植物包括農(nóng)作物(例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔屬、大豆、棉、紅花、花生、高粱、小麥、粟、煙草等)，諸如玉米和大豆植物。草坪草包括但不限于一年生早熟禾(Poaannua)；—年生黑麥草(Loliummultiflorum)；力口拿大早熟禾(Poacompressa)；邱氏羊茅(Festucarubra)；細(xì)弱曹股穎(Agrostistenuis)；匍匍剪股穎(Agrostispalustris)；麥穗草(Agropyrondesertorum)；扁穗冰草(Agropyroncristatum)；硬羊茅(Festucalongifolia)；草地早熟禾(Poapratensis)；野茅(Dactylisglomerata)；多年生黑麥草(Loliumperenne)；紫羊茅(Festucarubra)；小糠草(Agrostisalba)；粗莖早熟禾(Poatrivialis)；羊茅(Festucaovina)；無芒雀麥(Bromusinermis)；高羊茅(Festucaarundinacea)；梯牧草(Phleumpratense)；絨毛剪股穎(Agrostiscanina)；臉茅(Puccinelliadistans)；藍(lán)蓮冰草(Agropyronsmithii)；狗牙草(Cynodonspp.)；圣奧古斯丁草(Stenotaphrumsecundatum)；結(jié)縷草(Zoysiaspp.)；巴哈雀稗(Paspalumnotatum)；地毪草(Axonopusaffinis)；{段^[金草(Eremochloaophiuroides)；各良H1草(Pennisetumclandesinum)；賓*禾卑(Paspalumvaginatum)；(Boutelouagracilis)；/K^1^(Buchloedactyloids)；偵Ij種格蘭馬草(Boutelouacurtipendula).所關(guān)注的植物包括提供所關(guān)注的種子的谷類植物、含油種子植物以及豆科植物。所關(guān)注的種子包括谷類種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥、黍等。含油種子植物包括棉、大豆、紅花、向日葵、蕓苔屬、玉米、苜蓿、棕櫚、椰子、亞麻、蓖麻、橄欖等。豆科植物包括菜豆和豌豆。菜豆包括瓜爾豆、刺槐豆、胡蘆巴、大豆、青刀豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等。在某些實(shí)施方式中，實(shí)施方式的核酸序列可以與任意組合的目的多核苷酸序列堆疊，從而產(chǎn)生具有所需表型的植物。例如，實(shí)施方式的多核苷酸可以與編碼具有殺蟲和/或殺昆蟲活性的多肽的其它任何多核苷酸堆疊，所述多肽諸如其它Bt毒素蛋白(描述于美國專利號(hào)5，366，892；5，747，450；5，736，514；5,723，756；5，593，881；禾口Geiseretal.(1986)Gene48109)、pentin(描述于美國專利第5，981，722號(hào))等等。生成的組合還可以包含多拷貝的任一目的多核苷酸。也可以將實(shí)施方式的多核苷酸與其它任一基因或基因的組合相堆疊，從而產(chǎn)生具有各種所需性狀組合的植物，其包括但不限于動(dòng)物取食所需的性狀，諸如高油基因(例如，美國專利第6，232，529號(hào))；平衡型氨基酸(例如，hordothionins(美國專利號(hào)5，990，389；5，885，801；5，885，802；和5，703，049)；大麥高賴氨酸(Williamsonetal.(1987)Eur.J.Biochem.165:99_106；和WO98/20122)和高甲硫氨酸蛋白(Pedersenetal.(1986)J.Biol.Chem.2616279；Kiriharaetal.(1988)Gene71359；和Musumuraetal.(1989)PlantMol.Biol.12123))；增強(qiáng)的消化性(例如，修飾的貯藏蛋白(2001年11月7日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)10/053,410)；和硫氧還蛋白(2001年12月3日提交的美國申請(qǐng)序列號(hào)10/005，429)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。還可以將實(shí)施方式的多核苷酸與疾病或除草劑抗性所需的性狀相堆疊(例如，煙曲霉毒素去毒基因(美國專利第5，792，931號(hào))；無毒性和疾病抗性基因(Jonesetal.(1994)Science266789；Martinetal.(1993)Science2621432；禾口Mindrinosetal.(1994)Cell78:1089)；導(dǎo)致除草劑抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突變體，諸如S4和/或Hra突變；谷氨酰胺合酶抑制劑，諸如草銨膦或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因和GAT基因，如美國申請(qǐng)序列號(hào)10/004，357；和10/427，692所公開)；以及與加工或加工產(chǎn)物所需的性狀相堆疊，諸如高油(例如，美國專利第6，232，529號(hào))；修飾的油(例如，脂肪酸去飽和酶基因(美國專利第5，952，544號(hào)；WO94/11516))；修飾的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)，淀粉合酶(SS)，淀粉支化酶(SBE)和淀粉去支化酶(SDBE))；以及多聚物或生物塑料(例如，美國專利第5.602，321號(hào)；β-酮硫解酶，聚羥基丁酯合酶，和乙酰乙?；?CoA還原酶(Schubertetal.(1988)J.Bacteriol.1705837-5847)促進(jìn)聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的表達(dá))，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。也可以將實(shí)施方式的多核苷酸與提供農(nóng)藝學(xué)性狀或轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀的多核苷酸組合，所述農(nóng)藝學(xué)性狀諸如雄性不育(例如，參見美國專利第5.583，210號(hào))、莖強(qiáng)度、開花時(shí)間，所述轉(zhuǎn)化技術(shù)性狀諸如細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或基因打靶(例如，WO99/61619；WO00/17364；WO99/25821),Jt公開內(nèi)容通過引用并入本文。可以通過包括但不限于雜交育種植物或遺傳轉(zhuǎn)化的任何方法來產(chǎn)生這些堆疊的組合，所述雜交育種植物通過任何常規(guī)方法或T0PCR0SS方法。如果通過遺傳轉(zhuǎn)化植物來堆疊性狀，那么可以在任意時(shí)間以任意順序組合目的多核苷酸序列。例如，可以將包含一種或多種所需性狀的轉(zhuǎn)基因植物用作靶標(biāo)，從而通過隨后的轉(zhuǎn)化引入其它性狀。可以使用轉(zhuǎn)化盒的任意組合所提供的目的多核苷酸，以共轉(zhuǎn)化操作步驟同時(shí)引入所述性狀。例如，如果要引入兩條序列，那么所述兩條序列可以包含在分開的轉(zhuǎn)化盒(反式)或包含在相同的轉(zhuǎn)化盒(順式)中?？梢越柚嗤膯?dòng)子或借助不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)序列的表達(dá)。在某些情況下，需要引入抑制目的多核苷酸表達(dá)的轉(zhuǎn)化盒?？梢詫⑵渑c其它抑制盒或過表達(dá)盒的任意組合相組合，從而在植物中生成所需的性狀組合。還認(rèn)識(shí)到可以使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，將多核苷酸序列在所需基因組位置堆疊。參見，例如，W099/25821,W099/25854,W099/25840,W099/25855和W099/25853，所有這些都通過引用并入本文?？梢詫?shí)施方式的組合物用于保護(hù)植物、種子和各種方式的植物產(chǎn)物。例如，組合物能用于下述方法，該方法涉及將有效量的殺蟲組合物通過操作置于害蟲環(huán)境，所述操作選自噴灑(spraying)、撒粉(dusting)、撒播(broadcasting)或種子包被。在將植物繁殖材料(果實(shí)、塊莖、鱗莖、球莖、谷物、種子)、尤其是種子作為商品銷售時(shí)，通常用保護(hù)劑包被將其處理，所述保護(hù)劑包被包括除草劑、殺昆蟲劑、殺真菌劑、殺細(xì)菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動(dòng)物劑，或這些制備物中的幾種的混合物，如有需要，以及用另外的載體、表面活性劑或者通常用于制劑領(lǐng)域的促應(yīng)用佐劑處理，從而提供對(duì)細(xì)菌、真菌或動(dòng)物害蟲造成的損害的保護(hù)。為了處理種子，可以通過用液體制劑浸漬塊根或谷物，或者通過用組合的濕性或干性制劑將其包被，來將保護(hù)劑包被用于種子。另外，在特殊情況下，應(yīng)用于植物的其它方法是可行的，例如針對(duì)芽或果實(shí)的處理?？梢杂梅N子保護(hù)劑包被處理實(shí)施方式的植物種子，所述植物種子包含編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的核苷酸序列，并且所述種子保護(hù)劑包被包含種子處理化合物，諸如，例如，克菌丹、萎銹靈、福美雙、methalaxyl、安定磷和通常用于種子處理的其它化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，包含實(shí)施方式的殺蟲組合物的種子保護(hù)劑包被單獨(dú)使用，或與通常用于種子處理的種子保護(hù)劑包被中的一種組合使用。認(rèn)識(shí)到可以使用編碼殺蟲蛋白的基因來轉(zhuǎn)化昆蟲致病生物體。所述生物體包括桿狀病毒、真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌和線蟲?？梢酝ㄟ^合適的載體將編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的基因引入微生物宿主，將所述宿主應(yīng)用于環(huán)境、或者植物或動(dòng)物。在將核酸插入細(xì)胞的上下文中的術(shù)語“引入的”指“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，并且包括涉及將核酸并入真核或原核細(xì)胞，其中可以將核酸并入細(xì)胞基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制子，或瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。可以選擇已知占據(jù)一種或多種目的作物“植物圈”(葉面、葉圍、根際和/或根面)的微生物宿主。選擇這些微生物，使其能夠在特定環(huán)境中與野生型微生物成功競(jìng)爭(zhēng)，使表達(dá)殺蟲蛋白的基因穩(wěn)定地維持和表達(dá)，以及令人滿意地，提高對(duì)環(huán)境降解和失活殺蟲劑的防護(hù)。所述微生物包括細(xì)菌、藻類和真菌。特別引人注目關(guān)注的微生物諸如是細(xì)菌，例如，假單孢菌屬(Pseudomonas)，歐文氏菌屬(Erwinia)，沙雷氏菌屬(Serratia)，克雷伯菌屬(Klebsiella)，黃單胞菌屬(Xanthomonas)，鏈霉菌屬(Str印tomyces)，根瘤菌屬(Rhizobium)，紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas),Methylius,農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium),醋桿菌屬(Acetobacter),乳酸桿菌屬(Lactobacillus),節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter),固氮菌屬(Azotobacter),明串珠菌屬(Leuconostoc)禾口產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)；是真菌，特別地是酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)，隱球菌屬(Cryptococcus)，克魯維斯酵母屬(Kluyveromyces)，擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，紅酵母屬(Rhodotorula)和黑酵母屬(Aureobasidium)。特別關(guān)注的是植物圈細(xì)菌物種，諸如丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)，焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，木醋酸菌(Acetobacterxylinum),農(nóng)桿菌屬(Agrobacteria),球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonasspheroids)，野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)，苜猜根瘤菌(Rhizobiummelioti),真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesentrophus),木質(zhì)棍狀桿菌(Clavibacterxyli)和維涅蘭德固氮菌(Azotobactervinlandii)和植物圈酵母物種，諸如深紅酵母(Rhodotorularubra)，粘紅酵母(R.glutinis)，海濱紅酵母(R.marina)，橙紅酵母(R.aurantiaca)，淺白隱球菌(Cryptococcusalbidus)，流散隱球酵母(C.diffluens)，羅倫隱球菌(C.Iaurentii)，玫瑰酵母(Saccharomycesrosei)，S.pretoriensis,酉良酒酵母(S.cerevisiae),玫瑰色擲孢酵母(Sporobolomycesroseus),香氣擲抱酵母(S.odorus)，Kluyveromycesveronae禾口出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特別關(guān)注的是色素性微生物?？梢允褂矛F(xiàn)有的許多方式，在允許穩(wěn)定地維持和表達(dá)基因的條件下，將表達(dá)殺蟲蛋白的基因引入微生物宿主。例如，能構(gòu)建表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括目的核苷酸構(gòu)建體和與宿主生物體中的序列同源的核苷酸序列，從而發(fā)生整合和/或在該宿主中具有功能的復(fù)制系統(tǒng)，從而發(fā)生整合或穩(wěn)定的維持；其中所述核苷酸構(gòu)建體與用于表達(dá)該核苷酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號(hào)可操作地連接。轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)性信號(hào)包括但不限于，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、操作基因、活化子(activator)、增強(qiáng)子、其它調(diào)節(jié)性元件、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止信號(hào)等等。參見，例如，美國專利第5，039，523號(hào)和第4，853，331號(hào)；EPO0480762A2；Sambrooketal.(1992)MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，ed.Maniatisetal.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork),下稱“SambrookII“；Davisetal.,eds.(1980)AdvancedBacterialGenetics(高級(jí)細(xì)菌遺傳學(xué))(ColdSpringHarborLaboratoryPress),ColdSpringHarbor,NewYork；并且所述參考文獻(xiàn)為本文所引用。合適的宿主細(xì)胞可以包括原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，其通常限于不產(chǎn)生對(duì)諸如哺乳動(dòng)物的高等生物體有毒性的物質(zhì)的那些細(xì)胞，其中處理含殺蟲蛋白的細(xì)胞，從而在將受處理細(xì)胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲的環(huán)境時(shí)，延長殺蟲蛋白在所述細(xì)胞中的活性。然而，能使用產(chǎn)生對(duì)高等生物體具有毒性的物質(zhì)的生物體，其中所述毒素不穩(wěn)定或者應(yīng)用水平足夠低，以致避免對(duì)哺乳動(dòng)物宿主存在毒性的任何可能。作為宿主，特別關(guān)注的是原核細(xì)胞和低等真核細(xì)胞，諸如真菌。示例性的原核細(xì)胞(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)包括腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)，歐文氏菌屬，志賀氏菌屬(Shigella)，沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus)；芽胞桿菌科(Bacillaceae)；根瘤菌科(Rhizobiaceae)，諸如根瘤菌屬(Rhizobium)；螺菌科(Spirillaceae)，諸如發(fā)光菌，酵單胞菌屬(Zymomonas)，沙雷氏菌屬，氣單胞菌屬(Aeromonas)，弧菌屬(Vibrio)，脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)，螺旋菌屬(Spirillum)；乳桿菌科(Lactobacillaceae)；假單胞菌科(Pseudomonadaceae)諸如假單胞菌屬和醋桿菌；固氣菌科(Azotobacteraceae)禾口銷化桿菌科(Nitrobacteraceae)。真核細(xì)胞有真菌，諸如藻狀菌綱(Phycomycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)，其包括酵母，諸如酵母屬和裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)；以及擔(dān)子菌(Basidiomycetes)酵母，諸如紅酵母屬，短梗霉屬(Aureobasidium)，擲孢酵母屬等。在為產(chǎn)生殺蟲蛋白而選擇宿主細(xì)胞方面特別關(guān)注的特征包括將殺蟲蛋白基因引入宿主的便捷、表達(dá)系統(tǒng)的可獲得性、表達(dá)的效率、蛋白在宿主中的穩(wěn)定性以及輔助遺傳能力的存在。用作殺蟲劑微膠囊的所關(guān)注的特征包括對(duì)于殺蟲劑的保護(hù)性特性，諸如厚的細(xì)胞壁、色素沉著和胞內(nèi)包裝或包涵體形成；葉親和性；哺乳動(dòng)物毒性的缺乏；對(duì)昆蟲食入的吸引；殺死和固定且不損害毒素的便捷；等等。其它考慮包括制劑和處理的便捷，經(jīng)濟(jì)，儲(chǔ)藏穩(wěn)定性等等。特別關(guān)注的宿主生物體包括酵母，諸如紅酵母(Rhodotorulaspp.)，短梗霉(Aureobasidiumspp.)，酵母(Saccharomycesspp.)(諸如，釀酒酵母)，擲孢酵母(Sporobolomycesspp.)；葉面生物體，諸如假單胞菌(Pseudomonasspp.)(諸如綠膿假單胞菌(P.aeruginosa)，熒光假單胞菌)，歐文氏菌(Erwiniaspp.)以及黃質(zhì)菌(Flavobacteriumspp.)；以及其它此類生物體，包括Bt、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)等等。編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的基因能引入依靠植物倍增的微生物(附生植物)，從而將殺蟲蛋白遞送至潛在的靶害蟲。附生植物，例如，可以是革蘭氏陽性菌或革蘭氏陽性菌。根定殖(root-colonizing)的細(xì)菌，例如，可以通過本領(lǐng)域已知方法分離自所關(guān)注的植物。具體地，定殖根的蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)菌株可以分離自植物根(參見，例如，Handelsmanetal.(1991)Appl.Environ.Microbiol.56:713_718)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，將編碼實(shí)施方式的殺蟲蛋白的基因引入根定殖的蠟狀芽胞桿菌。借助電轉(zhuǎn)化能將編碼殺蟲蛋白的基因引入，例如，根定殖的芽孢桿菌。具體地，編碼殺蟲蛋白的基因能克隆至穿梭載體，例如，pHT3101(Lereciusetal.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60=211-218)。包含特定殺蟲蛋白基因的編碼序列的穿梭載體pHT3101，例如，借助電穿孔能轉(zhuǎn)化至根定殖的芽孢桿菌(Lereciusetal.(1989)FEMSMicrobiol.Letts.60211-218)?？梢栽O(shè)計(jì)表達(dá)系統(tǒng)，以致，例如將殺蟲蛋白分泌至諸如大腸桿菌的革蘭氏陰性菌的胞質(zhì)外。使殺蟲蛋白分泌的優(yōu)點(diǎn)在于(1)避免所表達(dá)殺蟲蛋白的潛在細(xì)胞毒性作用；以及(2)改善殺蟲蛋白的純化效率，包括但不限于，提高每體積細(xì)胞肉湯的蛋白復(fù)性和純化效率，縮短每單位蛋白復(fù)性和純化的時(shí)間和/或減少其成本?？梢灾苽浯竽c桿菌分泌的殺蟲蛋白，例如，通過將合適的大腸桿菌信號(hào)肽融合至殺蟲蛋白的氨基端末端?？梢栽诖竽c桿菌已知分泌的蛋白中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌識(shí)別的信號(hào)肽，例如OmpA蛋白(Ghrayebetal.(1984)EMBOJ，3:2437_2442)。OmpA是大腸桿菌外膜的主要蛋白，它的信號(hào)肽因而被認(rèn)為在轉(zhuǎn)位過程中有效。另外，加工前，OmpA信號(hào)肽不需要被修飾，例如脂蛋白信號(hào)肽的其它信號(hào)肽可能如此(Duffaudetal.(1987)Meth.Enzymol.153492)。實(shí)施方式的殺蟲蛋白在細(xì)菌宿主中能發(fā)酵，加工所得細(xì)菌并將其以與將Bt菌株用作殺昆蟲噴霧劑的相同方式用作微生物噴霧劑。在芽孢桿菌分泌一種或多種殺蟲蛋白的情況下，使用本領(lǐng)域已知方法去除或突變分泌信號(hào)。所述突變和/或缺失阻止在發(fā)酵過程中將一種或多種殺蟲蛋白分泌至生長培養(yǎng)基。在細(xì)胞內(nèi)保留殺蟲蛋白，隨后加工所述細(xì)胞以產(chǎn)生封裝的殺蟲蛋白。為該目的可以使用任意合適的微生物。假單胞菌已被用于將Bt毒素表達(dá)為封裝的蛋白，加工所得細(xì)胞，并將其作為殺昆蟲劑噴灑(Gaertneretal.(1993)，in:AdvancedEngineeredPesticides(高級(jí)工禾呈化殺蟲劑),ed.Kim)?？蛇x擇地，通過將異源基因引入細(xì)胞宿主來產(chǎn)生殺蟲蛋白。異源基因的表達(dá)直接或間接地導(dǎo)致殺蟲劑的胞內(nèi)產(chǎn)生和維持。隨后將細(xì)胞應(yīng)用于具有一種或多種靶害蟲的環(huán)境時(shí)，在延長細(xì)胞所產(chǎn)生毒素活性的條件下處理這些細(xì)胞。所得產(chǎn)物保留毒素的毒性。隨后可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)配制這些天然封裝的殺蟲蛋白，以將其應(yīng)用于具有靶害蟲的環(huán)境，例如土壤、水和植物的葉子。參見，例如EPA0192319，所述參考文獻(xiàn)為本文所引用。在實(shí)施方式中，可接受的載體能將轉(zhuǎn)化的微生物(其包括整個(gè)生物體、細(xì)胞、一種或多種孢子、一種或多種殺蟲蛋白、一種或多種殺蟲組分、一種或多種影響害蟲的組分、一種或多種突變體、活細(xì)胞或死細(xì)胞和細(xì)胞組分，包括活細(xì)胞和死細(xì)胞和細(xì)胞組分的混合物，并且包括破損的細(xì)胞和細(xì)胞組分)或分離的殺蟲蛋白配制成一種或多種殺蟲組合物，所述殺蟲組合物，例如是懸浮液、溶液、乳劑、粉劑、可分散顆?；蛐∏颉⒖蓾裥苑蹌┖涂扇榛瘽饪s物、煙霧劑或噴霧劑、浸漬顆粒、佐劑、可包被糊劑、膠體，以及另外用例如多聚物物質(zhì)封裝?？梢酝ㄟ^常規(guī)手段制備所述配制的組合物，所述手段諸如干燥、凍干、均質(zhì)化、提取、過濾、離心、沉降或濃縮包含所述多肽的細(xì)胞培養(yǎng)物。可以通過添加表面活性劑、惰性載體、防腐劑、濕潤劑、取食刺激劑、引誘劑、封裝齊、黏合劑、乳化劑、染料、uv保護(hù)劑、緩沖液、流平劑或肥料、微營養(yǎng)供體或者影響植物生長的其它制備物，來獲得以上公開的所述組合物?？梢詫⒁环N或多種農(nóng)用化學(xué)品與通常用于制劑領(lǐng)域的載體、表面活性劑或佐劑或者其它組分組合，以促進(jìn)為特定靶害蟲的產(chǎn)物處理和應(yīng)用。適當(dāng)?shù)妮d體和佐劑可以是固體的或液體的，并且對(duì)應(yīng)于通常用于制劑技術(shù)的物質(zhì)，例如，天然的或再生的礦物質(zhì)、溶劑、分散劑、潤濕劑、增粘劑、黏合劑或肥料。實(shí)施方式的活性成分通常以組合物形式應(yīng)用，并且可以應(yīng)用于待處理的作物區(qū)域、植物或種子。例如，可以在制備糧倉或筒倉等時(shí)，或者在糧倉或筒倉等儲(chǔ)藏時(shí)，將實(shí)施方式的組合物應(yīng)用于谷物?？梢耘c其它化合物同時(shí)或連續(xù)應(yīng)用實(shí)施方式的組合物。應(yīng)用實(shí)施方式的活性成分或?qū)嵤┓绞降霓r(nóng)用化學(xué)品組合物的方法包括但不限于葉敷、種子包被和土壤施用，所述活性成分或農(nóng)用化學(xué)品組合物包含實(shí)施方式的細(xì)菌菌株產(chǎn)生的至少一種殺蟲蛋白。應(yīng)用的數(shù)量和速率取決于對(duì)應(yīng)害蟲群襲的強(qiáng)度。合適的表面活性劑包括但不限于陰離子化合物，諸如，例如金屬羧酸鹽；長鏈脂肪酸羧酸鹽；N-?；“彼猁}；磷酸和脂肪醇乙氧基化物的一元或二元酯或者所述酯的鹽；脂肪醇硫酸鹽，諸如十二烷基硫酸鈉、十八烷基硫酸鈉或十六烷基硫酸鈉；乙氧基脂肪醇硫酸鹽；乙氧基烷基苯酚硫酸鹽；木質(zhì)素磺酸鹽；石油磺酸鹽；烷基芳基磺酸鹽，諸如烷基-苯磺酸鹽或低級(jí)烷基萘磺酸鹽，例如，丁基-萘磺酸鹽；磺化萘-甲醛縮合物的鹽；磺化苯酚-甲醛縮合物的鹽；更為復(fù)雜的磺酸鹽，諸如，酰胺磺酸鹽，例如油酸和N-甲基牛膽堿的磺化縮合產(chǎn)物；或二烷基磺基琥珀酸鹽，例如二辛基琥珀酸酯的磺酸鈉。非離子試劑包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或脂肪_烷基或烯基取代的苯酚與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、多元醇醚的脂肪酯，例如，山梨聚糖脂肪酸酯，所述酯與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物，例如，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷、炔二醇諸如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或乙氧基炔二醇的嵌段共聚物。陽離子表面活性劑的實(shí)例包括，例如，脂肪族一元胺、二元胺或多聚胺的諸如醋酸鹽、環(huán)烷酸鹽或油酸鹽；或者含氧胺，諸如聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通過縮合羧酸和二元或多聚胺制備的酰胺鍵合的胺；或者季銨鹽。惰性材料的實(shí)例包括但不限于無機(jī)礦物質(zhì)諸如高嶺土、頁硅酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽或者植物材料諸如軟木、粉狀玉米穗軸、花生殼、稻殼和胡桃殼。實(shí)施方式的組合物能是用于直接應(yīng)用或作為初始組合物濃縮物的適當(dāng)形式，所述濃縮物在應(yīng)用前需要用適量的水或其它稀釋劑稀釋。殺蟲劑濃度依特定制劑的性質(zhì)而變化，具體地，依它是濃縮物還是要直接使用而變化。所述組合物包含至98%的固體或液體惰性載體，以及0%至50%或0.至50%的表面活性劑。以商品標(biāo)簽上的比率施用所述組合物，例如干燥形式時(shí)每英畝約0.011b-5.01b，液體形式時(shí)每英畝約0.Olpts.-IOpts.。在另一實(shí)施方式中，配制前能處理實(shí)施方式的組合物和轉(zhuǎn)化的微生物及殺蟲蛋白，從而在將其應(yīng)用至靶害蟲的環(huán)境時(shí)，延長殺蟲活性，只要預(yù)處理對(duì)殺蟲活性沒有害處?？梢酝ㄟ^化學(xué)和/或物理手段進(jìn)行所述處理，只要所述處理不有害地影響一種或多種組合物的性質(zhì)?；瘜W(xué)試劑的實(shí)例包括但不限于鹵化劑；諸如甲醛和戊二醛的醛；抗感染劑，諸如氯化芐烷氨；醇，諸如異丙醇和乙醇；以及組織學(xué)固定劑，諸如布安固定劑(Bouin’sfixative)和海利氏固定劑(Helly，sfixative)(參見，例如Humason(1967)AnimalTissueTechniques(動(dòng)物組織技術(shù))(W.H.FreemanandCo.)。在其它實(shí)施方式中，可以有利地用例如胰蛋白酶的蛋白酶處理Cry毒素多肽，從而在將實(shí)施方式的殺蟲蛋白組合物應(yīng)用至靶害蟲環(huán)境之前活化所述蛋白。本領(lǐng)域公知通過絲氨酸蛋白酶活化毒素原的方法。參見，例如，Cooksey(1968)Biochem.J.6:445-454和CarrollandEllar(1989)Biochem.J.261:99_105，通過引用將其教導(dǎo)并入本文。例如，適當(dāng)?shù)幕罨僮鞑襟E包括但不限于將待活化多肽，例如純化的新的Cry多肽(例如，具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:4所示的氨基酸序列)，與胰蛋白酶在20nMNaHCO3,pH8中，以蛋白/胰蛋白酶重量比1/100相組合，并且將所述樣品在36C消化3小時(shí)?？梢栽诤οx開始出現(xiàn)或在害蟲出現(xiàn)前，將組合物(包含實(shí)施方式的所轉(zhuǎn)化微生物和殺蟲蛋白)作為保護(hù)措施應(yīng)用于昆蟲害蟲環(huán)境，所述應(yīng)用通過例如，噴灑、霧化、粉化、散布、包被或傾倒、引入土壤或引至土壤表面、引入灌溉水，其通過種子處理或通常的應(yīng)用或粉化。例如，可以將實(shí)施方式的殺蟲蛋白和/或轉(zhuǎn)化的微生物與谷物混合，從而保護(hù)儲(chǔ)藏期的谷物。通常重要的是在植物生長早期獲得對(duì)害蟲的良好控制，因?yàn)榇藭r(shí)植物可以受到最為嚴(yán)重的損害。如認(rèn)為有必要，實(shí)施方式的組合物可以方便地包含另一殺昆蟲劑。在一個(gè)實(shí)施方式中，在種植時(shí)，將組合物直接應(yīng)用至土壤，所述應(yīng)用是以載體和芽孢桿菌菌株或?qū)嵤┓绞剿D(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞的組合的顆粒形式。另一實(shí)施方式是組合物的顆粒形式，所述組合物包含農(nóng)用化學(xué)品，諸如，例如，除草劑、殺昆蟲劑、肥料、惰性載體和芽孢桿菌菌株或?qū)嵤┓绞降乃D(zhuǎn)化微生物的死細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，不是所有化合物對(duì)全部害蟲都具有同樣效果。實(shí)施方式的化合物顯示抗昆蟲害蟲的活性，所述害蟲可以包括經(jīng)濟(jì)上重要的農(nóng)藝學(xué)害蟲、林業(yè)害蟲、溫室害蟲、苗圃害蟲、觀賞品害蟲、食物和纖維害蟲、公眾和動(dòng)物健康害蟲、家用和商用建筑害蟲、家用品害蟲和儲(chǔ)物害蟲。昆蟲害蟲包括選自鞘翅目、雙翅目、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等、特別是鞘翅目和鱗翅目的昆蟲。鱗翅目的幼蟲包括但不限于夜蛾科(Noctuidae)的粘蟲、切根蟲、尺蠖和heliothine夜娥(SpodopterafrugiperdaJESmith,fallarmyworm)；舌甘菜夜娥(S.exiguaHiibner,beetarmyworm)；斜紋夜蛾(S.IituraFabhcius，tobaccocutworm,clustercaterpillar)；稽帶夜蛾(MamestraconfigurataWalker,berthaarmyworm)；甘藍(lán)夜蛾(Μ.brassicaeLinnaeus，cabbagemoth)；漂切根蟲(AgrotisipsilonHufnage1,blackcutworm)；西部切根蟲(A.orthogoniaMorrison,westerncutworm)；顆粒夜蛾(A.subterraneaFabricius，granulatecutworm)，木棉蟲(AlabamaargillaceaHiibner,cottonleafworm)；粉紋夜蛾(TrichoplusianiHiibner,cabbagelooper)；大豆夜蛾(PseudoplusiaincludensWalker,soybeanlooper)；黎豆夜蛾(AnticarsiagemmatalisHiibner,velvetbeancaterpillar)；苜猜綠夜蛾(HypenascabraFabricius，greencloverworm)；煙芽夜蛾(HeliothisvirescensFabricius，tobaccobudworm)；一星粘蟲(PseudaletiaunipunctaHaworth,armyworm)；粗皮夜蛾(AthetismindaraBarnesandMcdunnough,roughskinnedcutworm)；暗緣地老虎(EuxoamessoriaHarris，darksidedcutworm)；埃及金鋼鉆(EariasinsulanaBoisduval,spinybo11worm)；Ψ-^C^^(Ε.vittellaFabricius,spottedbo11worm)；^MiS#^(HelicoverpaarmigeraHiibner,Americanbo11worm)；谷實(shí)夜娥(H.zeaBoddie，cornearworm或cottonbo11worm)；紋蝶毛蟲(MelanchrapictaHarris，zebracaterpillar)；柑橘夜蛾(Egira(Xylomyges)curialisGrote,citruscutworm)；螟蛾禾斗(Pyralidae)的鉆孔蟲、鞘蛾、結(jié)網(wǎng)毛蟲、球果蛾以及斑蛾歐洲玉米螟(OstrinianubilalisHubner,Europeancornborer)；贓禮蟲冥(AmyeIoistransitellaWalker,navalorangeworm)；地中海粉斑螟(AnagastakuehniellaZeller,Mediterraneanflourmoth)；干果斑螟(CadracautellaWalker,almondmoth)；二化螟(ChiIosuppressalisWalker,ricestemborer)；斑禾草蟲冥(C.partellus,sorghumborer)；米娥(CorcyracephalonicaStainton，ricemoth)；玉米根結(jié)網(wǎng)毛蟲(CrambuscaliginosellusClemens，cornrootwebworm)；藍(lán)草結(jié)網(wǎng)毛蟲(C.teterrellusZincken，bluegrasswebworm)；稻縱卷葉里予螟(CnaphalocrocismedinalisGuenee，riceleafroller)；葡萄卷葉蟲(DesmiafuneralisHiibner,grapeleaffolder)；舌甘瓜野螟(DiaphaniahyalinataLinnaeus，melonworm)；^包胃&(D.nitidalisStoll,pickleworm)；胃(DiatraeagrandiosellaDyar,southwesterncornborer)；小庶蟲冥(D.saccharalisFabricius，surgarcaneborer)；墨西哥水稻螟(EoreumaloftiniDyar，Mexicanriceborer)；煙草粉螟(EphestiaelutellaHiibner,tobacco(cacao)moth)；錯(cuò)蟲冥(GalleriamellonellaLinnaeus，greaterwaxmoth)；野螟(HerpetogrammalicarsisalisWalker,sodwebworm)；向曰葵斑螟(HomoeosomaelectellumHulst，sunflowermoth)；南美玉米苗斑螟(ElasmopalpuslignosellusZeller，lessercornstalkborer)；小錯(cuò)螟(AchroiagrisellaFabricius，lesserwaxmoth)；草地蟲冥(LoxostegesticticalisLinnaeus，beetwebworm)；茶樹螟(OrthagathyrisalisWalker,teatreewebmoth)；豆野螟(MarucatestulalisGeyer,beanpodborer)；印度谷螟(PlodiainterpunctellaHiibner,Indianmealmoth)；三化螟(ScirpophagaincertulasWalker,yellowstemborer)；溫室螟(UdearubigalisGuenee,celeryleaftier)；以及卷蛾科(Tortricidae)的卷葉蟲、蟲牙蟲、種(AclerisgloveranaWalsingham,Westernblackheadedbudworm)；漂頭長翅卷蛾(A.varianaFernald，Easternblackheadedbudworm)；果樹黃卷蛾(ArchipsargyrospilaWalker,fruittreeleafroller)；歐洲卷葉蛾(A.rosanaLinnaeus,Europeanleafroller)；以及其他的黃卷蛾屬(Archips)物種棉褐帶卷蛾(AdoxophyesoranaFischervonRosslerstamill？summerfruittortrixmoth)；條紋向日葵螟(CochylishospesWalsingham，bandedsunflowermoth)；榛小卷蛾(CydialatiferreanaWalsingham,filbertworm)；蘋果蠹蛾(C.pomonellaLinnaeus，codingmoth)；雜色卷葉蛾(PlatynotaflavedanaClemens，variegatedleafroller)；荷蘭石竹小卷蛾(P.stultanaWalsingham,omnivorousleafroller)；歐洲葡萄小卷葉蛾(LobesiabotranaDenis&Schiffermiiller,Europeangrapevinemoth)；蘋白小卷蛾(SpilonotaocellanaDenis&Schiffermiiller，eyespottedbudmoth)；萄果實(shí)蟲主蟲(EndopizaviteanaClemens，grapeberrymoth)；女貞細(xì)卷蛾(EupoeciliaambiguellaHiibner,vinemoth)；巴西蘋果卷葉蛾(BonagotasalubricolaMeyrick,Brazi1ianappleleafroller)；梨小食心蟲(GrapholitamolestaBusck，orientalfruitmoth)；向日葵芽蛾(SuleimahelianthanaRiley,sunflowerbudmoth)；條卷蛾(Argyrotaeniaspp.)；尾蛺蝶(Choristoneuraspp.)0鱗翅目的所選其它農(nóng)藝害蟲包括但不限于秋星尺蠖(AlsophilapometariaHarris,fallcankerworm)；桃枝麥娥(AnarsialineatellaZeller,peachtwigborer)；犀客頁蛾(AnisotasenatoriaJ.Ε.Smith,orangestripedoakworm)；昨香(AntheraeapernyiGuerin-Menevi1Ie,ChineseOakTussahMoth)；家香(BombyxmoriLinnaeus，Silkworm)；豐帛潛娥(BucculatrixthurberiellaBusck,cottonleafperforator)；胃■胃蟲I(ColiaseurythemeBoisduval,alfalfacaterpillar)；古月相區(qū)胃蟲|(DatanaintegerrimaGrote&Robinson,walnutcaterpillar)；落葉松毛蟲(DendrolimussibiricusTschetwerikov,Siberiansilkmoth)；白尺蟲蒦(EnnomossubsignariaHiibner,elmspanworm)；菩提尺蠖(ErannistiliariaHarris，lindenlooper)；黃毒蛾(EuproctischrysorrhoeaLinnaeus，browntailmoth)；漂擬齡蛾(HarrisinaamericanaGuerin-Menevi1Ie,grapeleafskeletonizer)；范圍毛蟲飛蛾(HemileucaoliviaeCockrel1,rangecaterpillar);_15白_(HyphantriacuneaDrury,fallwebworm)；番前蠹蛾(KeiferialycopersicellaWalsingham,tomatopinworm)；二尾蛺蝶(LambdinafiscellariafiscellariaHulst，Easternhemlocklooper)；西部鐵杉尺蠖(LfiscellarialugubrosaHulst,Westernhemlocklooper)；柳毒蛾(LeucomasalicisLinnaeus，satinmoth)；舞毒娥(LymantriadisparLinnaeus，gypsymoth)；番前天娥(MandueaquinquemaculataHaworth,fivespottedhawkmoth，tomatohornworm)；煙草天(Μ.sextaHaworth,tomatohornworm,tobaccohornworm)；冬尺蟲蒦(OperophterabrumataLinnaeus，wintermoth)；春尺蠖(PaleacritavernataPeck，springcankerworm)；大鳳蝶(PapiliocresphontesCramer,giantswallowtail，orangedog)；力口州株蟲(PhryganidiacalifornicaPackard,Californiaoakworm)；ffl"橘潛口十娥(PhyllocnistiscitrellaStainton,citrusleafminer)；斑幕潛卩十娥(PhyllonorycterblancardellaFabricius,spottedtentiformleafminer)；大菜粉蝶(PierisbrassicaeLinnaeus，largewhitebutterfly)；小菜粉蝶(P.rapaeLinnaeus，smallwhitebutterfly)；日音脈菜粉蝶(P.napiLinnaeus,greenveinedwhitebutterfly)；洋J習(xí)習(xí)蛾(PlatyptiliacarduidactylaRiley,artichokeplumemoth)；菱斑餓(PlutellaxylostellaLinnaeus，diamondbackmoth)；棉紅鈴蟲(PectinophoragossypiellaSaunders，pinkbo11worm)；南方菜蛾(PontiaprotodiceBoisduval&Leconte,Southerncabbageworm)；雜食尺蟲蒦(SabulodesaegrotataGuenee，omnivorouslooper)；康辛tt(SchizuraconcinnaJ.E.Smith,redhumpedcaterpillar)；麥娥(SitotrogacerealellaOlivier,Angoumoisgrainmoth)；松異帶蛾(ThaumetopoeapityocampaSchiffermuller,pineprocessionarycaterpillar)；結(jié)網(wǎng)衣娥(TineolabisselliellaHummel,webbingclothesmoth)；番前斑潛蟲黽(TutaabsolutaMeyrick，tomatoleafminer)；蘋果巢蛾(YponomeutapadellaLinnaeus，erminemoth)；HeliothissubfIexaGuenee；天幕毛蟲(Malacosomaspp)；以及毒蛾(Orgyiaspp)。鞘翅目的幼蟲和成蟲是感興趣的，包括長角象鼻蟲科(Anthribidae)、豆象科(Bruchidae)以及象甲科(Curculionidae)的象鼻蟲(包括但不限于棉鈴象甲(AnthonomusgrandisBoheman,bollweevil)；禾§水象甲(LissorhoptrusoryzophilusKuschel,ricewaterweevil)；谷象(SitophilusgranariusLinnaeus，granaryweevil)；米象(S.oryzaeLinnaeus，riceweevil)；三葉草葉象(HyperapunctataFabricius，cloverleafweevil)；向日葵蓮象甲(CylindrocopturusadspersusLeConte,sunflowerstemweevil)；紅色禾中子象甲(SmicronyxfulvusLeConte,redsunflowerseedweevil)；灰色禾中子象甲(S.sordidusLeConte,graysunflowerseedweevil)；玉米象甲(SphenophorusmaidisChittenden，maizebillbug)；葉甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黃瓜葉甲、根蟲、葉甲、馬鈴薯葉甲以及潛葉蟲(包括但不限于科羅拉多州馬鈴暮甲蟲(L印tinotarsadecemlineataSay,Coloradopotatobeetle)；玉米根螢葉甲(DiabroticavirgiferavirgiferaLeConte,westerncornrootworm)；巴氏根葉甲(D.barberiSmith&Lawrence,northerncornrootworm)；黃瓜十一星葉甲(D.undecimpunctatahowardiBarber，southerncornrootworm)；玉米跳甲(ChaetocnemapulicariaMelsheimer,cornfleabeetle)；十字花禾斗跳甲(PhyllotretacruciferaeGoeze,cornfleabeetle)；葡萄肖葉甲(ColaspisbrunneaFabricius，grapecolaspis)；漂角負(fù)泥蟲(OuIemamelanopusLinnaeus，cerealleafbeetle)；向日葵葉甲(ZygogrammaexclamationisFabricius，sunflowerbeetle))；票瓜蟲科(Coccinellidae)的甲蟲(包括但不限于墨西哥豆瓢蟲(EpilachnavarivestisMulsant，Mexicanbeanbeetle)；螺螂科(Scarabaeidae)的金龜子和其他的甲蟲(包括但不限于日本金龜子(PopilliajaponicaNewman,Japanesebeetle)；北方圓頭犀金龜(CyclocephalaborealisArrow,northernmaskedchafer，whitegrub)；南方圓頭犀金龜(C.immaculataOlivier,southernmaskedchafer，whitegrub)；歐洲金龜(RhizotrogusmajalisRazoumowsky，Europeanchafer)；擠贈(zèng)(PhyllophagacrinitaBurmeister,whitegrub)；古月蘿卜甲蟲(LigyrusgibbosusDeGeer,carrotbeetle))；皮蠹科(Dermestidae)的地毯圓皮蠹；叩甲科(Elateridae)的線蟲偽金針蟲(Eleodesspp.)、金針蟲(Melanotusspp.)、單葉口口甲(Conoderusspp.)、Limoniusspp.、錐尾口口甲(Agriotesspp.)、Cteniceraspp.、Aeolusspp.；小蠹禾斗(Scolytidae)的小蠹蟲以及擬步甲科(Tenebrionidae)的甲蟲。雙翅目的成蟲和幼蟲是感興趣的，包括潛葉蠅，玉米斑潛葉蠅(AgromyzaparvicornisLoew,cornblotchleafminer)；蚊(包括但不限于高粱癭蚊(ContariniasorghicolaCoquillett,sorghummidge)；漂森瘦岐(MayetioladestructorSay,Hessianfly)；麥紅吸楽蟲(SitodiplosismosellanaGehin，wheatmidge)；葵花桿岐(NeolasiopteramurtfeldtianaFelt，sunflowerseedmidge))；果實(shí)蟲黽(實(shí)蟲黽禾斗(Τ印hritidae))，瑞典桿蠅(OscinellafritLinnaeus,fritflies)；蛆(包括但不限于灰地禾中蟲黽(DeliaplaturaMeigen，seedcornmaggot)；麥禾中蟲黽(D.coarctataFallen，wheatbulbfly)；以及其它地種蠅(Deliaspp.)，美洲桿蠅(MeromyzaamericanaFitch,wheatstemmaggot)；舍蟲黽(MuscadomesticaLinnaeus，houseflies)；夏廁蟲黽(FanniacanicularisLinnaeus)，小舍蟲黽(F.femoralisStein,lesserhouseflies)；廄螫蟲黽(StomoxyscalcitransLinnaeus，stableflies))；秋家蟲黽、角蟲黽、HI3蟲黽、金蟲黽(Chrysomyaspp.)；伏蠅(Phormiaspp.)；以及其他的苔蘚蠅害蟲，馬蠅，虻(Tabanusspp.)；胃蠅，胃蠅(Gastrophilusspp.)；狂蠅(Oestrusspp.)；牛皮蠅，皮蠅(Hypodermaspp.)；斑it，斑it(Chrysopsspp.)；綿羊風(fēng)蠅(MelophagusovinusLinnaeus，keds)；以及其他的短角亞目(Brachycera)，蚊子，伊蚊(Aedesspp.)；按蚊(Anophelesspp.)；庫蚊(Culexspp.)；黑蠅，原蚋(Prosimuliumspp.)；蚋(Simuliumspp.)；咬蠓、白蛉、尖眼蕈蚊和其他長角亞目(Nematocera)0感興趣的昆蟲包括半翅目和同翅目的成蟲和若蟲，例如但不限于球蚜科(Adelgidae)的球蚜、盲蝽科(Miridae)的盲蝽、蟬科(Cicadidae)的蟬、葉蟬科(Cicadellidae)的葉蟬、小綠葉蟬(Empoascaspp.)；菱飛虱科(Cixiidae)、蛾蠟蟬科(Flatidae)、賭蟬總科(Fulgoroidea)、圓飛虱科(Issidae)以及稻虱科(Delphacidae)的飛虱；角蟬科(Membracidae)的角蟬；木虱科(Psyllidae)的木虱；粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱；蚜科(Aphididae)的蚜蟲；根瘤蚜科(Phylloxeridae)的根瘤蚜；粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧；鏈介殼蟲科(Asterolecanidae)、軟介殼蟲科(Coccidae)、洋紅蚧科(Dactylopiidae)、盾介殼蟲科(Diaspididae)、絨蚧科(Eriococcidae)、旌介殼蟲科(Ortheziidae)、剌葵介殼蟲科(Phoenicococcidae)以及碩介殼蟲科(Margarodidae)的介殼蟲；網(wǎng)蝽科(Tingidae)的網(wǎng)蝽；蝽科(Pentatomidae)的九香蟲；長蝽科(Lygaeidae)的麥長蝽，長椿(Blissusspp.)；以及其他的蝽類(seedbugs)，沫蟬科(Cercopidae)的沫蟬、緣蝽科(Coreidae)的南瓜緣蝽、以及紅蝽科(Pyrrhocoridae)的秋恙螨和棉蝽。同翅目中農(nóng)藝上重要的成員還包括但不限于豌豆蚜(AcyrthisiphonpisumHarris，peaaphid)；豆工豆蟲牙(AphiscraccivoraKoch,cowpeaaphid)；漂豆蟲牙(A.fabaeScopoli，blackbeanaphid)；棉蟲牙(A.gossypiiGlover,cottonaphid，melonaphid)；玉米根蟲牙(A.maidiradicisForbes，cornrootaphid)；蘋果黃蟲牙(A.pomiDeGeer,appleaphid)；繡線菊蟲牙(A.spiraecolaPatch，spireaaphid)；前溝無網(wǎng)蟲牙(AulacorthumsolaniKaltenbach，foxgloveaphid)；草莓釘蟲牙(ChaetosiphonfragaefoliiCockerel1,strawberryaphid)；麥雙尾蟲牙(DiuraphisnoxiaKurdjumov/MordviIko,Russianwheataphid)；攻瑰蘋果蟲牙(DysaphisplantagineaPaaserini,rosyappleaphid)；蘋果綿蟲牙(EriοsomalanigerumHausmann，woollyappleaphid)；甘藍(lán)蟲牙(BrevicorynebrassicaeLinnaeus,cabbageaphid)；相區(qū)粉大尾蟲牙(HyalopteruspruniGeoffroy,mealyplumaphid)；蘿卜蟲牙(LipaphiserysimiKaltenbach，turnipaphid)；麥無網(wǎng)長管蟲牙(Metopolophiumdirrhodumwalker,cerealaphid)；大卓戈長管蟲牙(MacrosiphumeuphorbiaeThomas，potatoaphid)；煙桃蟲牙(MyzuspersicaeSulzer,peach-potatoaphid，greenpeachaphid)；萬苣蟲牙(NasonoviaribisnigriMosley,lettuceaphid)；癭綿蟲牙(Pemphigusspp.，rootaphids禾口gallaphids)；玉米蟲牙(RhopalosiphummaidisFitch,cornleafaphid)；禾谷溢管蟲牙(R.padiLinnaeus，birdcherry-oataphid)；麥二叉蟲牙(SchizaphisgraminumRondani,greenbug)；黃色甘蔴蟲牙(SiphaflavaForbes，yellowsugarcaneaphid)；麥長管蟲牙(SitobionavenaeFabricius，Englishgrainaphid)；苜猜斑蟲牙(TherioaphismaculataBuckton，spottedalfalfaaphid)；漂色柑橘蟲牙(ToxopteraaurantiiBoyerdeFonscolombe,blackcitrusaphid)以及褐色桔蟲牙(Τ.citricidaKirkaldy,browncitrusaphid)；球蟲牙(Adelgesspp.，adelgids)；長山豐亥相區(qū)豐艮瘤蟲牙(PhylloxeradevastatrixPergande,pecanphylloxera)；甘暮粉風(fēng)(BemisiatabaciGennadius，tobaccowhitefly,sweetpotatowhitefly)；銀葉粉風(fēng)(B.argentifoliiBellows&Perring,silverleafwhitefly)；柑桔粉風(fēng)(DialeurodescitriAshmead，citruswhitefly)；煙粉風(fēng)(Trialeurodesabutiloneus,bandedwingedwhitefly)以及溫室白粉風(fēng)(Τ.vaporariorumWestwood,greenhousewhitefly)；馬鈴薯小綠葉蝶(EmpoascafabaeHarris,potatoleafhopper)；灰飛風(fēng)(LaodelphaxstriatellusFallen，smallerbrownplanthopper)；紫■葉蝶(MacrolestesquadrilineatusForbes，asterleafhopper)；漂尾葉蝶(NephotettixcinticepsUhler,greenleafhopper)；二條漂尾葉蝶(N.nigropictusStal,riceleafhopper)；褐飛風(fēng)(NilaparvatalugensStal，brownplanthopper)；玉米飛風(fēng)(PeregrinusmaidisAshmead,cornplanthopper)；白背飛風(fēng)(SogatellafurciferaHorvath,white-backedplanthopper)；禾苗飛風(fēng)(SogatodesorizicolaMuir，ricedelphacid)；蘋果白葉蝶(TyphlocybapomariaMcAtee,whiteappleleafhopper)；葡萄葉蝶(Erythroneouraspp.，grapeleafhoppers)；十七年蝶(MagicicadaseptendecimLinnaeus,periodicalcicada)；吹帛_(IceryapurchasiMaskel1,cottonycushionscale)；梨園盾階(QuadraspidiotusperniciosusComstock,SanJosescale)；柑桔醫(yī)紋粉階(PlanococcuscitriRisso，citrusmealybug)；粉階的禾中(Pseudococcusspp.)(其他的粉階系群)；梨木風(fēng)(CacopsyllapyricolaFoerster,pearpsylla)；棉木風(fēng)(TriozadiospyriAshmead，persimmonpsylla)0感興趣的半翅目中農(nóng)藝上重要的物種包括但不限于稻綠蝽(AcrosternumhilareSay,greenstinkbug)；南瓜緣蟲舂(AnasatristisDeGeer,squashbug)；麥長蟲春(BlissusleucopterusleucopterusSay,chinchbug)；方翅網(wǎng)蟲春(CorythucagossypiiFabricius，cottonlacebug)；番前蟲舂(CyrtopeltismodestaDistant，tomatobug)；棉蟲舂(DysdercussuturellusHerrich-Schaffer，cottonstainer)；褐MtW(EuschistusservusSay,brownstinkbug)；一斑臭蟲春(Ε.variolariusPalisotdeBeauvois,one-spottedstinkbug)；長蟲舂(Graptostethusspp.)(果實(shí)蟲舂系群(complexofseedbugs))；豐公O十豐艮蟲春(LeptoglossuscorculusSay,leaf-footedpineseedbug)；美國牧草盲_(LyguslineolarisPalisotdeBeauvois,tarnishedplantbug)；豆莢草盲蟲舂(L.HesperusKnight，Westerntarnishedplantbug)；牧草盲蟲舂(LpratensisLinnaeus，commonmeadowbug)；長毛草盲蟲舂(LrugulipennisPoppius，Europeantarnishedplantbug)；長參錄盲蟲春(LygocorispabulinusLinnaeus,commongreencapsid)；水稻稻參錄_(NezaraviridulaLinnaeus,southerngreenstinkbug)；禾S蟲舂(OebaluspugnaxFabricius，ricestinkbug)；突角長蟲舂(OncopeltusfasciatusDallas，largemilkweedbug)；棉盲蟲舂(PseudatomoscelisseriatusReuter,cottonfleahopper)。另外，本發(fā)明的實(shí)施方式可以對(duì)半翅目有效，例如草莓蝽(CalocorisnorvegicusGmelin，strawberrybug)；OrthopscampestrisLinnaeus；蘋盲蟲舂(PlesiocorisrugicollisFallen，applecapsid)；番前蟲舂(CyrtopeltismodestusDistant，tomatobug)；煙草小盲蟲舂(CyrtopeltisnotatusDistant，suckfly)；白斑盲蟲舂(SpanagonicusalbofasciatusReuter,whitemarkedfleahopper)；阜莢蟲舂(DiaphnocorischlorionisSay,honeylocustplantbug)；洋蔥蟲春(LabopidicolaalliiKnight，onionplantbug)；棉盲蟲舂(PseudatomoscelisseriatusReuter,cottonfleahopper)；猜|§盲_(AdelphocorisrapidusSay,rapidplantbug)；四線盲_(PoecilocapsuslineatusFabricius，four-linedplantbug)；擬麥長蟲舂(NysiusericaeSchilling，falsechinchbug)；荼黃薊馬(NysiusraphanusHoward,falsechinchbug)；禾g青蟲春(NezaraviridulaLinnaeus,Southerngreenstinkbug)；扁盾蟲春(Eurygasterspp.)；緣蝽(Coreidaespp.)；紅蝽(Pyrrhocoridaespp.)；谷蛾(Tinidaespp.)；負(fù)子蝽(Blostomatidaespp.)；獵蟲舂(Reduviidaespp.)；以及臭蟲舂(Cimicidaespp·)。還包括螨(Acari)(螨(mites))目的成蟲和幼蟲，例如小麥卷葉螨(AceriatosichellaKeifer,wheatcurlmite)；褐色小麥螨(PetrobialatensMiiller,brownwheatmite)；葉鋼科(Tetranychidae)的蟲朱鋼禾口恙鋼，歐洲葉鋼(PanonychusulmiKoch,Europeanredmite)；二斑葉螨(TetranychusurticaeKoch,twospottedspidermite)；邁葉螨(Τ·mcdanieliMcGregor，McDanielmite)；朱砂葉螨(Τ·cinnabarinusBoisduval,carminespidermite)；土耳其斯坦葉螨(Τ.turkestaniUgarov&Nikolski,strawberryspidermite)；細(xì)須螨科(Tenuipalpidae)的扁平螨，葡萄短須螨(BrevipalpusIewisiMcGregor，citrusflatmite)；癭螨科(Eriophyidae)的銹螨和芽癭螨以及其他的食葉螨和對(duì)人類和動(dòng)物健康重要的螨，即蜻科(Epidermoptidae)中的銹螨，蠕形螨科(Demodicidae)中的毛囊蟲，食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的扁風(fēng)，漂腳硬蝶(IxodesscapularisSay,deertick)；全環(huán)硬蝶(I.holocyclusNeumann，Australianparalysistick)；美國狗壁風(fēng)(DermacentorvariabilisSay,Americandogtick)；美州壁Ml(AmblyommaamericanumLinnaeus,lonestartick)；以及__禾斗(Psoroptidae)、蒲螨科(Pyemotidae)和疥螨科(Sarcoptidae)的癢螨和疥螨。感興趣的纓尾目(Thysmura)中的害蟲包括西洋衣魚(I^pismasaccharinaLinnaeus,silverfish)；小灶衣魚(ThermobiadomesticaPackard，firebrat)。包括的其他的節(jié)肢害蟲包括蜘蛛目(Armeae)中的蜘蛛，如棕色隱遁蜘蟲朱(LoxoscelesreclusaGertsch&Mulaik，brownreclusespider)；禾口漂寡婦_蟲朱(LatrodectusmactansFabricius，blackwidowspider)；禾口蟲由艇目(Scutigeromorpha)中的蜈蚣，如蚰蜒(ScutigeracoleoptrataLinnaeus，housecentipede)0可以在發(fā)育早期，例如，如幼蟲或其它未成熟形式，測(cè)試實(shí)施方式的組合物對(duì)害蟲的殺蟲活性。可以在完全黑暗條件下，于約20°C至約30°C，在約30%至約70%的相對(duì)濕度中培養(yǎng)昆蟲。可以如CzaplaandLang(1990)J.Econ.Entomol.83(6):2480_2485所述進(jìn)行生物分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知培養(yǎng)昆蟲幼蟲和進(jìn)行生物分析的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種生物分析技術(shù)。通常的程序包括向封口容器中的飲食來源添加實(shí)驗(yàn)化合物或生物體?？梢酝ㄟ^但不限于取食和暴露適當(dāng)長時(shí)間后的死亡率變化、體重減少、吸引、驅(qū)性和其它行為和物理變化，來測(cè)量殺蟲活性?？梢詫?duì)幼蟲期或成蟲期的任何取食蟲害使用本文所述的生物分析。通過說明而非限制的方式陳述下列實(shí)施例。實(shí)施例實(shí)施例1測(cè)試蘇云金芽孢桿菌毒素對(duì)所選昆蟲的殺蟲活性的生物測(cè)定進(jìn)行生物分析以評(píng)價(jià)如SEQIDNO2所示的Bt殺昆蟲毒素肽對(duì)表1中所示的多種鱗翅目種的作用。對(duì)包含殺昆蟲蛋白的人工飲食進(jìn)行取食測(cè)定。使用鱗翅目特異性人工飲食來局部應(yīng)用殺昆蟲蛋白。以每孔每25μ1樣品0.3μg的比例應(yīng)用毒素，并將其干燥。該蛋白包含在PH10的IOmM碳酸鹽緩沖液中。每一孔放置一個(gè)新生幼蟲，隨意取食5天。如果有諸如萎縮和或死亡的幼蟲反應(yīng)，則結(jié)果為陽性。如果幼蟲與食用僅應(yīng)用上述緩沖液的飲食的陰性對(duì)照相似，則結(jié)果為陰性。表1:SEQIDNO2的取食生物檢測(cè)結(jié)果_所測(cè)試?yán)ハx__結(jié)果歐洲玉米螟(Europeancornborer)(歐洲玉米螟+{Ostrinianubilalis))棉鈴蟲(谷實(shí)夜蛾)+--_大豆尺蠖(大豆夜蛾)__+__黎豆毛蟲(黎豆夜蛾)__+_黑切根蟲(球菜夜蛾ipsilon))__+__秋粘蟲(草地貪夜蛾)__-_實(shí)施例2確定LC5tl進(jìn)行生物檢測(cè)以確定如SEQIDNO:2所示的殺昆蟲毒素肽對(duì)歐洲玉米螟(Europeancornborer)(歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis))；棉鈴蟲(谷實(shí)夜蛾)；黑切根蟲(球菜夜蛾)；秋粘蟲(草地貪夜蛾)；大豆尺蠖(大豆夜蛾)和黎豆毛蟲(黎豆夜蛾)的LC5Q。在包含殺昆蟲蛋白的人工飲食上進(jìn)行取食分析。殺昆蟲蛋白用pH10的IOmM碳酸鹽緩沖液和昆蟲飲食稀釋，以達(dá)到1000，100，50，10，1和0.Ippm的毒素終濃度。每一孔放置一個(gè)新生幼蟲，隨意取食5天。在每一劑量下，一式八份進(jìn)行每一生物分析，將所述生物分析重復(fù)三次。將結(jié)果表示為對(duì)于死亡率的LC5tlt5表2中列舉了殺昆蟲毒素肽的LC5tl研究結(jié)果。表2:LC50結(jié)果GS018LC50ppm歐洲玉米螟21.30(13.12-32.09)棉鈴蟲96.33(73.49-135.1)黑切根蟲>200秋粘蟲>200大豆尺蠖10.11黎豆毛蟲423實(shí)施例3通過粒子轟擊和再生轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化玉米用含有毒素核苷酸序列(例如，SEQIDN0:1或3)的DNA分子轟擊來自溫室供體植物的未成熟玉米胚，所述毒素核苷酸序列與泛素啟動(dòng)子和可選擇的標(biāo)志物基因PAT(ffohllebenetal.(1988)Gene70:25_37)可操作地連接，其賦予對(duì)雙丙氨磷除草劑的抗性。可選擇地，在單獨(dú)的DNA分子上提供可選擇標(biāo)志物基因。如下進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)基配方如下。靶組織的制備給穗去皮，用30%CL0R0X漂白劑加0.5%微去垢劑將其表面殺菌20分鐘，用蒸餾水漂洗兩次。切下并放置未成熟胚，胚軸一側(cè)向下(子葉盤一側(cè)向上)，每板25個(gè)胚，于560Y培養(yǎng)基放置4小時(shí)，隨后將其在2.5cm的靶區(qū)域內(nèi)排列，以備轟擊。DNA的制備制備包含與泛素啟動(dòng)子可操作地連接的毒素核苷酸序列(例如SEQIDN0:1或3)的質(zhì)粒載體。例如，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化載體包含與PinII終止子組合的玉米UBIl啟動(dòng)子、UBIl的5’UTR和UBIl內(nèi)含子。該載體另外包含CAMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的PAT可選擇標(biāo)志物基因，并包含CAMV35S終止子。任選地，可選擇標(biāo)志物可以位于單獨(dú)的質(zhì)粒上。使用如下的CaCl2沉淀程序，將包含毒素核苷酸序列和PAT可選擇標(biāo)志物的DNA分子沉淀至1.1μm(平均直徑)鎢球100μL含所制備鎢粒的水IOyL(Iyg)溶于TrisEDTA緩沖液的DNA(1μg總DNA)100UL2.5MCaCl2IOyLO.IM亞精胺將每一試劑順次加入鎢粒懸浮液，同時(shí)置于多管渦旋器上。將最終混合物短暫超聲破碎，并使其在持續(xù)渦旋下孵育10分鐘。在沉淀期后，短暫離心所述管，移除液體，用500mL100%乙醇清洗，離心30秒。再移除液體，將105μL100%乙醇添加至最終鎢粒小球。為粒子槍轟擊，將該鎢/DNA粒短暫超聲處理，并將10μL點(diǎn)至每一大載體(macrocarrier)中心，并使其干燥約2分鐘，隨后進(jìn)行轟擊。粒子槍處理用粒子槍#HE34_1或#HE34_2在水平#4下轟擊樣品板。所有樣品接受650PSI下的單次射擊，總共一式十份，其取自具有所制備粒/DNA的每一管。隨后的處理轟擊后，將胚置于560Y培養(yǎng)基2天，隨后將其轉(zhuǎn)至含有3mg/升雙丙氨磷的560R選擇培養(yǎng)基，每2周傳代培養(yǎng)。選擇約10周后，將抗選擇的愈傷克隆轉(zhuǎn)至288J培養(yǎng)基，以起始植物再生。在體細(xì)胞胚成熟(2-4周)后，將發(fā)育良好的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)至出芽培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)至光照培養(yǎng)室。約7-10天后，將發(fā)育中的苗轉(zhuǎn)至管中的272V無激素培養(yǎng)基，培養(yǎng)7-10天，直至苗得到良好建成。隨后將植物轉(zhuǎn)至含有盆栽土的淺箱(等同于2.5"盆)的墊子上，使其在生長室內(nèi)生長1周，隨后再在溫室中生長1-2周，接著將其轉(zhuǎn)移至典型的600盆(1.6加侖)，并使其生長至成熟。通過本領(lǐng)域已知的或如上所述的測(cè)定，監(jiān)測(cè)并評(píng)分植物的毒素表達(dá)。轟擊禾Πi吝養(yǎng)的培養(yǎng)基轟擊培養(yǎng)基(560Y)包含4.Og/LN6基本鹽(SIGMAC-1416)，1.OmL/LEriksson維生素混合物(IOOOxSIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HC1，120.Og/L蔗糖，1.0mg/L2，4_D和2.88g/LL-脯氨酸(用KOH調(diào)至ρΗ5·8后，用dlH2O定容)；2.0g/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和8.5mg/L硝酸銀(將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。選擇培養(yǎng)基(560R)包含4.Og/LN6基本鹽(SIGMAC-1416)，1.OmL/LEriksson維生素混合物(ΙΟΟΟχSIGMA-1511)，0.5mg/L硫胺HCl，30.Og/L蔗糖，和2.Omg/L2，4_D(用KOH調(diào)至pH5.8后，用dlH2O定容)；3-Og/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和0.85mg/L硝酸銀和3.Omg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至室溫后添加)。植物再生培養(yǎng)基(288J)包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074)，5.0mL/LMS維生素母液(O.IOOg煙酸，0.02g/L硫胺HCl,0.10g/L吡哆醇HCl和0.40g/L甘氨酸，用精制D-IH2O定容)(MurashigeandSkoog(1962)Physiol.Plant.15:473)，100mg/L肌-肌醇，0.5mg/L玉米素，60g/L蔗糖，和1.0mL/L的0.ImM脫落酸(調(diào)至pH5.6后，用精制dlH2O定容)；3.0g/LGelrite(用dlH2O定容后添加)；和1.0mg/L吲哚乙酸和3.Omg/L雙丙氨磷(均在將培養(yǎng)基滅菌并冷卻至60°C后添加)。無激素培養(yǎng)基(272V)包含4.3g/LMS鹽(GIBC011117-074)，5.0mL/LMS維生素母液(0.IOOg煙酸，0.02g/L硫胺HCl,0.10g/L吡哆醇HCl，和0.40g/L甘氨酸，用精制dlH2O定容)，0·lg/L肌-肌醇，和40.0g/L蔗糖(調(diào)pH至5.6后，用精制(11H2O定容)；和6g/L細(xì)菌瓊脂粉(用精制dlH2O定容后添加)，將其滅菌并冷卻至60°C。實(shí)施例4農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植物再生對(duì)于用毒素核苷酸序列(例如，SEQIDNO:1或3)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，可以使用Zhao的方法(美國專利第5，981，840號(hào)和PCT專利公開W098/32326；其內(nèi)容通過引用并入本文)。簡(jiǎn)言之，從玉米分離未成熟胚，使該胚與農(nóng)桿菌懸浮液接觸，所述接觸在所述細(xì)菌能夠?qū)⒍舅睾塑账嵝蛄?SEQIDN0:1或3)轉(zhuǎn)移至至少一個(gè)未成熟胚的至少一個(gè)細(xì)胞的條件下進(jìn)行(步驟1感染步驟)。在該步驟中，可以將未成熟胚浸入農(nóng)桿菌懸浮液以起始接種。將胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一定時(shí)間(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。在感染步驟之后，將未成熟胚在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在該共培養(yǎng)期后，涉及任選的“靜息”步驟。在該靜息步驟中，在存在至少一種已知抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素但不添加用于植物轉(zhuǎn)化體的選擇試劑下，孵育所述胚(步驟3靜息步驟)。為清除農(nóng)桿菌和為所感染細(xì)胞的靜息期，將未成熟胚在具有抗生素但無選擇試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。接下來，將所接種胚在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并將生長中的轉(zhuǎn)化愈傷組織恢復(fù)(步驟4:選擇步驟)。將未成熟胚在具有選擇性試劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，導(dǎo)致所轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇性生長。隨后使愈傷組織再生成植物(步驟5再生步驟)，將在選擇性培養(yǎng)基上生長的愈傷組織在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以再生植物。實(shí)施例5轉(zhuǎn)化大豆胚如下用含有與pinll啟動(dòng)子可操作地連接的SEQIDNO:1或SEQIDN0:3毒素核苷酸序列的質(zhì)粒轟擊大豆胚。為誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，將從適當(dāng)大豆栽培種的表面殺菌的未成熟種子所切割的長3-5mm的子葉在光照或黑暗中于26°C在適當(dāng)?shù)沫傊囵B(yǎng)基培養(yǎng)6-10周。隨后切下產(chǎn)生次級(jí)胚的體細(xì)胞胚，并將其置入合適的液體培養(yǎng)基中。在重復(fù)選擇如早期、球形期胚倍增的體細(xì)胞胚細(xì)胞團(tuán)后，如下維持所述懸浮液。將大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物在150rpm旋轉(zhuǎn)振搖器上的35mL液體培養(yǎng)基中于26°C維持，所述維持在168小時(shí)的晝/夜時(shí)間表的熒光下進(jìn)行。通過將約35mg的組織接種至35mL液體培養(yǎng)基，每?jī)芍軅鞔囵B(yǎng)培養(yǎng)物。隨后通過粒子槍轟擊方法(Kleinetal.(1987)Nature(London)327:70_73，美國專利第4，945，050號(hào))，轉(zhuǎn)化大豆胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物?？梢詫⒍虐罨驑孭DS1000/HE設(shè)備(氦加裝)用于這些轉(zhuǎn)化?？梢杂糜诖龠M(jìn)大豆轉(zhuǎn)化的可選擇標(biāo)志物基因是由如下所構(gòu)成的轉(zhuǎn)基因花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Odelletal.(1985)Nature313:810_812)、質(zhì)粒pJR225(來自大腸桿M；Gritzetal.(1983)Gene25179-188)的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因和根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA的胭脂堿合酶基因3’區(qū)。可以將包含與pinll啟動(dòng)子可操作地連接的毒素核苷酸序列(例如，SEQIDN0:1或3)的表達(dá)盒作為限制性片段分離。隨后可以將該片段插入攜帶標(biāo)志物基因的載體的獨(dú)特限制性位點(diǎn)。向50μL的60mg/mL1μm金粒懸浮液(依次)加入5μLDNA(1μg/μL)，20μL亞精胺(0.1Μ)和50μLCaCl2(2.5Μ)。隨后將該粒制備物振搖3分鐘，在微型離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)10秒，將上清液移除。隨后用400yL70%乙醇將DNA包被的粒子清洗一次，并將其在40μL的無水乙醇中重懸?？梢詫NA/粒懸浮液超聲破碎3次，每次1秒。隨后將5微升DNA包被的金粒上樣至每一大載體盤。將約300_400mg的兩周齡懸浮液培養(yǎng)物置于空的60X15mm陪替氏培養(yǎng)皿，并用移液器將殘留液體從組織中移除。對(duì)每一轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，通常轟擊約5-10個(gè)板的組織。將膜破壞壓力設(shè)在llOOpsi，將該室抽真空至28英寸水銀真空。在離阻滯篩約3.5英寸遠(yuǎn)處放置組織，將其轟擊三次。在轟擊后，將組織切成兩半，并將其放回液體，并如上所述進(jìn)行培養(yǎng)。在轟擊后5-7天，可以用新鮮培養(yǎng)基更換液體培養(yǎng)基，在轟擊后11-12天，可以用含有50mg/mL潮霉素的新鮮培養(yǎng)基來更換?？梢悦恐芨略撨x擇性培養(yǎng)基。轟擊后7_8周，可以觀察自未轉(zhuǎn)化的壞死胚性細(xì)胞團(tuán)生長的綠色轉(zhuǎn)化組織?？梢砸瞥蛛x的綠色組織，并將其接種至單個(gè)燒瓶，以生成新的、克隆增殖的、轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生懸浮液培養(yǎng)物。可以將每一新系作為獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件來處理。隨后可以傳代培養(yǎng)這些懸浮液，并將其作為未成熟胚的細(xì)胞團(tuán)來維持，或者通過個(gè)體體細(xì)胞胚的成熟和萌發(fā)，將其再生成整體植物。實(shí)施例6測(cè)試突變的蘇云金芽孢桿菌毒素對(duì)所選昆蟲的殺蟲活性的生物測(cè)定進(jìn)行生物分析以評(píng)價(jià)如SEQIDNO:2所示的Bt殺昆蟲毒素肽和如SEQIDNO4所示的突變的Bt殺昆蟲毒性肽對(duì)表3中所示的多種鱗翅目種的作用。對(duì)包含殺昆蟲蛋白的人工飲食進(jìn)行取食分析。將殺昆蟲蛋白稀釋在PH8的50mM的重碳酸鈉緩沖液中，并且將10μ1稀釋的樣品與40μ1由低溫熔化瓊脂糖制成的熔化的人工昆蟲飲食混合。然后，將飲食混合物放置在96孔微量滴定板的每個(gè)孔中。每一孔放置新生幼蟲，隨意取食4天。在27°C下的4天之后，使用0-3數(shù)字評(píng)分系統(tǒng)基于幼蟲的尺寸和死亡率將昆蟲對(duì)蛋白的反應(yīng)評(píng)分。如果觀察到?jīng)]有反應(yīng)或生長正常，給0分。如果生長稍有減慢，而無任何死亡，給1分。2分表示某些幼蟲部分死亡以及對(duì)存活幼蟲的強(qiáng)生長抑制。3分指示幼蟲完全死亡。每種處理重復(fù)6次達(dá)到18分的可能累積總分。在該評(píng)分系統(tǒng)中，一種處理的6次重復(fù)達(dá)到9分的累積分指示對(duì)處理的50%反應(yīng)(18分中的9分)并被稱為ILC50(50%反應(yīng)的生長抑制和致死濃度)。表3以ppm表示的ILC50(SEQIDNOs:2和4的占飲食濕重的百萬分率)測(cè)試的昆蟲SEQIDNO2SEQIDNO權(quán)利要求1.分離的核酸分子，選自(a)包含SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸分子或其全長互補(bǔ)體；(b)編碼包含SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少98%序列一致性；和(d)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述核苷酸序列是設(shè)計(jì)為在植物中表達(dá)的合成序列。3.DNA構(gòu)建體，包含權(quán)利要求1所述的核酸分子。4.如權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體，還包含編碼異源多肽的核酸分子。5.宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求3所述的DNA構(gòu)建體。6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。7.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞。8.轉(zhuǎn)基因植物，包含權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞。9.如權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物選自玉米、高粱、小麥、卷心菜、向日葵、番茄、十字花科植物、椒、馬鈴薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、煙草、大麥和油菜。10.如權(quán)利要求9所述的植物的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述種子包含所述DNA構(gòu)建體。11.具有殺蟲活性的分離的多肽，選自(a)包含SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽；和(b)由SEQIDNO:1或3的核苷酸序列編碼的多肽。12.如權(quán)利要求11所述的多肽，還包含異源氨基酸序列。13.組合物，包含權(quán)利要求11所述的多肽。14.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述組合物選自粉末、粉劑、小球、顆粒、噴霧劑、乳劑、膠體和溶液。15.如權(quán)利要求13所述的組合物，其中通過干燥、凍干、勻漿、提取、過濾、離心、沉降或濃縮蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細(xì)胞培養(yǎng)物來制備所述組合物。16.如權(quán)利要求13所述的組合物，包括以重量計(jì)約至約99%的所述多肽。17.控制鱗翅目害蟲群體的方法，包括使所述群體與殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸。18.殺死鱗翅目害蟲的方法，包括使所述害蟲與殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽接觸，或向所述害蟲喂食殺蟲有效量的如權(quán)利要求11所述的多肽。19.產(chǎn)生具有殺蟲活性的多肽的方法，包括將如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞在表達(dá)編碼所述多肽的核酸分子的條件下培養(yǎng)，所述多肽選自(a)包含SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽；(b)由SEQIDNO:1或3的核苷酸序列編碼的多肽；(c)與(a)或(b)的多肽序列具有至少98%序列一致性的多肽序列；和(d)與(a)或(b)的多肽序列具有至少99%序列一致性的多肽序列。20.植物，所述植物具有穩(wěn)定并入其基因組的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含編碼具有殺蟲活性的蛋白的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列選自(a)包含SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸分子或其全長互補(bǔ)體；(b)編碼包含SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少98%序列一致性；和(d)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少99%序列一致性；其中所述核苷酸序列與驅(qū)動(dòng)編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子可操作地連接。21.如權(quán)利要求20所述的植物，其中所述植物是植物細(xì)胞。22.保護(hù)植物免于害蟲的方法，包括將至少一種包含編碼殺蟲多肽的核苷酸序列的表達(dá)載體引入所述植物或其細(xì)胞，其中所述核苷酸序列選自(a)包含SEQIDNO:1或3的核苷酸序列的核酸分子或其全長互補(bǔ)體；(b)編碼包含SEQIDNO:2或4的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(e)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少98%序列一致性；和(f)編碼包含氨基酸序列的蛋白的核苷酸序列，所述氨基酸序列特征在于與(b)的氨基酸序列具有至少99%序列一致性。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述植物產(chǎn)生具有針對(duì)鱗翅目害蟲的殺蟲活性的殺蟲多肽。24.SEQIDNO1的分離的變體，其中所述變體編碼具有增強(qiáng)的殺蟲活性的多肽。25.如權(quán)利要求M所述的分離的變體，其中所述變體編碼包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽。全文摘要本發(fā)明提供獲自蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)菌株的核酸，及其變體和其片段，其編碼具有針對(duì)包括鱗翅目的害蟲的殺蟲活性多肽。本發(fā)明的特定實(shí)施方式提供編碼殺蟲蛋白的分離的核酸、殺蟲組合物、DNA構(gòu)建體，和包含實(shí)施方式的核酸的轉(zhuǎn)化的微生物和植物。所述組合物用于控制害蟲尤其是植物害蟲的方法。文檔編號(hào)C12N15/82GK102076711SQ200980125162公開日2011年5月25日申請(qǐng)日期2009年5月7日優(yōu)先權(quán)日2008年5月15日發(fā)明者休·B·羅,克萊曼特·W·K·韋恩,安德烈·R·阿貝德,山本敬司,施曉梅,董華,馬克·納爾桑申請(qǐng)人:先鋒國際良種公司,納幕爾杜邦公司