專(zhuān)利名稱(chēng)：生產(chǎn)花瓣中含有經(jīng)過(guò)修飾的花色素苷的菊花植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用來(lái)自紫蘇的花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶(3AT)基因而在菊花植物中控制類(lèi)黃酮生物合成系統(tǒng)的方法、修飾花色素苷的方法、及導(dǎo)入該基因的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。本發(fā)明還涉及來(lái)自三色堇的類(lèi)黃酮3'，5'-羥化酶(以下也稱(chēng)為F3' 5' H)基因#40(以下也稱(chēng)為BP40。)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域及其使用。
背景技術(shù)：
通過(guò)利用基因重組技術(shù)，使有用的基因在目的植物中表達(dá)，可將新的性狀賦予該植物。如此制作的基因重組植物已被大范圍栽培。基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄階段進(jìn)行控制，所以轉(zhuǎn)錄調(diào)控在調(diào)控基因表達(dá)上最為重要。即為制作產(chǎn)業(yè)上有用的基因重組植物，在適當(dāng)時(shí)期、用適當(dāng)組織、以適當(dāng)強(qiáng)度轉(zhuǎn)錄非常重要。轉(zhuǎn)錄在很多情況下通過(guò)位于轉(zhuǎn)錄區(qū)域的5’ 側(cè)的DNA序列來(lái)控制。將確定基因轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)、直接調(diào)控其頻率的DNA上的區(qū)域稱(chēng)為啟動(dòng)子。啟動(dòng)子有時(shí)存在于起始密碼子的5’側(cè)數(shù)十bp處，多含有TATA盒等的序列。其還在 5’側(cè)具有結(jié)合各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的順式作用元件，這些順式作用元件的存在控制著轉(zhuǎn)錄的時(shí)期、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的組織、轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)度。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子根據(jù)氨基酸序列的不同分為很多家族。 例如，Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、bHLH(堿性/螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix loop helix))型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子等是有名的家族。實(shí)際上，很多情況下，轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域與啟動(dòng)子在同樣意義上使用。作為花的顏色的主要成分的花色素苷為總稱(chēng)為類(lèi)黃酮的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一?；ㄉ剀盏念伾蕾囉谄浣Y(jié)構(gòu)。即作為花色素苷的發(fā)色團(tuán)的花色素B環(huán)的羥基數(shù)增加時(shí)顏色變藍(lán)。且還已知修飾花色素苷的芳香族酰基(香豆?；?、咖啡?；?的數(shù)量增加時(shí)，花色素苷的顏色變藍(lán)(即最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng))，花色素苷的穩(wěn)定性增加(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。與花色素苷的生物合成有關(guān)的酶及編碼該酶的基因被廣泛研究(參照相同非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。例如，催化向花色素苷轉(zhuǎn)移芳香族酰基的反應(yīng)的酶基因可從龍膽、薰衣草、矮牽牛等中獲得(以下參照專(zhuān)利文獻(xiàn)1、專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。與紅紫蘇葉中積累的花色素苷(丙二?；咸K寧、3-0- (6-0- (E) -ρ-香豆?；?β -D-吡喃葡萄糖基)-5-0- (6-0-丙二?；?β -D-glucopyranosyl)-花青素(3-0- (6-0- (E) -p-coumaroyl- β -D-glucopyranosyl) -5-0- (6-0-malonyl- β -D-glucopyranosyl) -cyanidin))(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2)的合成有關(guān)的酶基因以羥基肉桂酰輔酶A 花色素苷3葡萄糖苷-芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶(3AT)的基因 {以下簡(jiǎn)稱(chēng)“紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶(3AT)基因”。}為代表已有報(bào)道(參照相同專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。而且也獲得了關(guān)于花色素苷的生物合成酶基因轉(zhuǎn)錄控制(調(diào)控)的知識(shí)和見(jiàn)解。 這些基因的位于起始密碼子5’側(cè)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中，具有Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、bHLH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合的順式作用元件序列。還已知Myb型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和bHLH型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制矮牽牛、玉米、紫蘇等的花色素苷的合成(參照相同非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。
在植物中負(fù)責(zé)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(以下稱(chēng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域)中，有無(wú)論在何種組織或發(fā)育階段的何種時(shí)期均發(fā)揮功能的所謂組成型啟動(dòng)子、和僅在特定器官·組織中發(fā)揮功能的器官·組織特異性啟動(dòng)子、及僅在發(fā)育階段的特定時(shí)期表達(dá)的時(shí)期特異性啟動(dòng)子。作為用于使有用基因在基因重組植物中表達(dá)的啟動(dòng)子，常用的是組成型啟動(dòng)子。作為代表性的組成型啟動(dòng)子，有花椰菜花葉病毒35S (以下也稱(chēng)為CaMV35Q啟動(dòng)子、以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的啟動(dòng)子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)、Macl啟動(dòng)子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)等。但是，在植物中，很多基因均為組織·器官特異性或時(shí)期特異性表達(dá)。這說(shuō)明使基因進(jìn)行組織·器官特異性或時(shí)期特異性表達(dá)對(duì)植物來(lái)說(shuō)是必需的。有利用此種組織 器官特異性或時(shí)期特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行植物的基因重組的例子。例如，有使用種子特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域使蛋白質(zhì)在種中積累的例子。但是，植物雖可開(kāi)出多種顏色的花，但由于種所具有的遺傳性限制，所以能開(kāi)出所有顏色的花的種很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能開(kāi)藍(lán)色、紫色花的品種。原因是月季、康乃馨不具有用于合成許多開(kāi)藍(lán)色、紫色花的種所合成的稱(chēng)為花翠素的花色素時(shí)所必需的F3’ 5’ H基因。通過(guò)在這些種中導(dǎo)入作為開(kāi)藍(lán)色、紫色花的種的矮牽牛、三色堇等的F3’ 5’ H基因，可使這些種的花色變藍(lán)。為康乃馨的情況下，為使來(lái)自不同種的 F3’ 5’ H基因轉(zhuǎn)錄，使用來(lái)自金魚(yú)草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。例如， 作為包含來(lái)自金魚(yú)草或矮牽牛的查耳酮合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的質(zhì)粒，可例舉以下專(zhuān)利文獻(xiàn)3中記載的質(zhì)粒pCGP485、pCGP653，作為包含組成型轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的質(zhì)粒，可例舉質(zhì)粒pCGP6^ (包含Macl啟動(dòng)子)、以下專(zhuān)利文獻(xiàn)4中記載的質(zhì)粒pSPB130 (包含附加有增強(qiáng)子的CaMV35S啟動(dòng)子)。但是，很難預(yù)測(cè)這樣的啟動(dòng)子在重組植物中可在何種程度上發(fā)揮作用，是否可帶來(lái)目的表達(dá)型。且為使復(fù)數(shù)的外源基因表達(dá)而反復(fù)使用相同啟動(dòng)子有時(shí)會(huì)引起基因的沉默，所以應(yīng)考慮避免(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。因此，雖然一些啟動(dòng)子被用于改變花的顏色，但還進(jìn)一步需要與目的宿主植物的目的相符合的有用的啟動(dòng)子。特別是菊花植物(也簡(jiǎn)稱(chēng)“菊花”。)約占日本全國(guó)批發(fā)價(jià)格(農(nóng)林水產(chǎn)省統(tǒng)計(jì)的平成19年花卉批發(fā)市場(chǎng)調(diào)查結(jié)果概要)中的30%，與月季約占9%、康乃馨約占7%相比， 可見(jiàn)其重要性。菊花中雖有白色 黃色 橙色 紅色 粉色 紫紅色等的花色，但還沒(méi)有紫色、藍(lán)色等藍(lán)色系的花色。因此，藍(lán)色系的育種成為用于喚起新需求的目標(biāo)之一。菊花的花色通過(guò)花色素苷和類(lèi)胡蘿卜素的組合來(lái)體現(xiàn)?；ㄉ剀沼捎谧鳛榛竟羌艿幕ㄉ氐慕Y(jié)構(gòu)不同、通過(guò)糖、有機(jī)酸而進(jìn)行的修飾的不同等，可出現(xiàn)多種顏色。但是，已知負(fù)責(zé)菊花花色的花色素苷僅有花青素的3位被葡萄糖和丙二酸修飾的兩種即cyanidin 3-0-(6" -0-monom alonyl-β -glucopyranoside 禾口 cyanidin 3-0-(3 “ ,6 “ -Ο-dimalonyl-β -glucop yran0Side(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。且其結(jié)構(gòu)比較單純(參照?qǐng)D1)。由于上述原因，菊花的花色素苷成為使顯色范圍極小的主要原因。如上所述，菊花在日本是最重要的花卉，但因具有六倍體這樣的多倍性，且基因組尺寸大，所以不僅轉(zhuǎn)化效率低，還會(huì)引起導(dǎo)入基因的沉默(鈍化)，因而不易得到穩(wěn)定表達(dá)導(dǎo)入基因的基因重組菊花。有如下報(bào)道，導(dǎo)入連接在CaMV35S啟動(dòng)子上的β-葡萄糖醛酸酶 (⑶S)基因的菊花與導(dǎo)入相同基因的煙草相比，⑶S基因的活性為10分之1左右，且在轉(zhuǎn)化
5后經(jīng)過(guò)12個(gè)月以后，在幾乎所有的個(gè)體中其活性均降低(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。有報(bào)道指出，已經(jīng)得到了用于使外源基因在菊花中穩(wěn)定表達(dá)的編碼在菊花中發(fā)揮良好功能的葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子，但該啟動(dòng)子不適合使基因在基本不存在葉綠素的花瓣中表達(dá)(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)8)。還有如下報(bào)道，將連接在煙草的延伸因子(elongation factor) 1 (EFl α )啟動(dòng)子上的⑶S基因?qū)刖栈〞r(shí)，即使經(jīng)過(guò)20個(gè)月以上⑶S基因還會(huì)在葉、花瓣中表達(dá)(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)。而且，有使突變型乙烯受體基因在菊花中表達(dá)從而延長(zhǎng)花的壽命的例子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)10)，有抑制菊花的AGAM0US基因表達(dá)而使花形改變的例子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)11)，有使用煙草的乙醇脫氫酶基因的5'-非翻譯區(qū)域(以下也稱(chēng)為煙草ADH-5' UTR)而提高外源基因在菊花中表達(dá)的例子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)12)。

另一方面，作為通過(guò)基因重組改變菊花花色的成功例，有通過(guò)共抑制法抑制查耳酮合成酶(CHS)的基因而使粉色變?yōu)榘咨膱?bào)道(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)13)，和通過(guò)RNAi 法抑制類(lèi)胡蘿卜素分解酶(CCD4a)的基因而使白色變?yōu)辄S色的報(bào)道(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn) 14)，但其均為通過(guò)內(nèi)源性基因的表達(dá)抑制來(lái)改變花色，還沒(méi)有通過(guò)外源基因的過(guò)表達(dá)而改變花色的成功例，也沒(méi)有實(shí)現(xiàn)花色素苷的結(jié)構(gòu)及由其結(jié)構(gòu)而形成的花色變化。通過(guò)外源基因過(guò)表達(dá)而改變花色的嘗試，有導(dǎo)入編碼用于合成花翠素所需要的酶即F3’5’H的基因的報(bào)道(以下參照專(zhuān)利文獻(xiàn)5、非專(zhuān)利文獻(xiàn)15)，但還沒(méi)有因?qū)氲腇3’5’H 基因的作用而產(chǎn)生的花翠素在舌狀花瓣中積累，從而培育出藍(lán)色系菊花的報(bào)道。在菊花中， 即使用CaMV35S啟動(dòng)子使F3’5’H表達(dá)，也未發(fā)現(xiàn)花翠素的產(chǎn)生(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)15)。且利用CaMV35S啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)的基因的表達(dá)會(huì)隨菊花轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)發(fā)育而消失等，因而不適合穩(wěn)定的表達(dá)(參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。作為可使外源基因在菊花的舌狀花瓣中高效且穩(wěn)定地表達(dá)的啟動(dòng)子，已開(kāi)發(fā)出馬鈴薯Lhca3. St. 1啟動(dòng)子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)16)、菊花 UEPl啟動(dòng)子(以下參照非專(zhuān)利文獻(xiàn)17)、煙草EFl α啟動(dòng)子(以下參照專(zhuān)利文獻(xiàn)6、非專(zhuān)利文獻(xiàn)9)等。但是，還沒(méi)有因使用了這些啟動(dòng)子的外源基因的過(guò)表達(dá)而改變菊花花色的報(bào)道。由上所述，為了通過(guò)基因重組而培育出改變了花色的菊花，需要確立包括開(kāi)發(fā)適用于菊花的啟動(dòng)子在內(nèi)的類(lèi)黃酮生物合成系統(tǒng)基因的表達(dá)控制技術(shù)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 WO 96/25500公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 WO 01/72984公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 WO 94/28140公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)4 WO 05/17147公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)5美國(guó)專(zhuān)利第5948955號(hào)專(zhuān)利文獻(xiàn)6日本特開(kāi)2004-65096號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 Plant J. 54，737-749，2008非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800,1989非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 Plant Cell Physiology 1996，37，49-59非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 Plant Molecular Biology 1990，15，373-381
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明欲解決的課題如下，提供使用作為用于改變菊花植物花色的有用的啟動(dòng)子的來(lái)自紫蘇的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶(3AT)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，從而在菊花植物中控制類(lèi)黃酮生物合成系統(tǒng)的方法、修飾花色素苷的方法、生產(chǎn)在花瓣中含有經(jīng)過(guò)修飾的花色素苷的菊花植物的方法及導(dǎo)入了該調(diào)控區(qū)域的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。本發(fā)明還涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作為切花加工品，包括使用該切花的押花、保鮮花、干花、樹(shù)脂密封品等，但不限于這些。本發(fā)明欲解決的課題為提供用于改變菊花植物及除菊花以外的植物花色的有用的啟動(dòng)子。本申請(qǐng)發(fā)明人為解決上述課題銳意研究，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來(lái)自紫蘇的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶(3AT)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可改變菊花花瓣中花色素苷的結(jié)構(gòu)，其結(jié)果， 發(fā)現(xiàn)用于改變菊花植物花色的有用的啟動(dòng)子，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其有用性，完成了本申請(qǐng)發(fā)明。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在用于改變菊花植物或菊花植物以外的植物花色上有用，從而完成了本申請(qǐng)發(fā)明。即本發(fā)明如下[1] 一種方法，其特征在于，其為使用包含選自以下⑴ ⑷中的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，通過(guò)基因重組技術(shù)在菊花植物中轉(zhuǎn)錄核酸的方法(1)核酸，其含有序列號(hào)1所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1所示的堿基序列進(jìn)行修飾后的堿基序列，(3)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)1中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。[2]根據(jù)所述[1]中所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄核酸的方法為通過(guò)轉(zhuǎn)錄與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法。[3]根據(jù)所述[1]中所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄核酸的方法為通過(guò)轉(zhuǎn)錄與花色素苷修飾有關(guān)的核酸從而修飾花色素苷的方法。[4] 一種方法，其特征在于， 使用包含所述[1]中定義的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，使紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶在菊花植物中表達(dá)，從而生產(chǎn)在花瓣中含有芳香族酰基化花色素苷的菊花植物。[5]根據(jù)所述[1] [4]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體或表達(dá)盒包含序列號(hào)2所示的堿基序列。[6] 一種菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了所述[1]中定義的核酸或通過(guò)所述[1] [5]中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)。[7]根據(jù)所述[6]中所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織， 其特征在于，含有芳香族?；ㄉ剀?。[8]根據(jù)所述[6]或[7]中所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或或其部分或組織，其特征在于，含有花翠素。[9]根據(jù)所述[6] [8]中任一項(xiàng)所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。[10] 一種切花加工品，其特征在于，使用所述[9]中所述的切花。[11] 一種核酸，其特征在于，選自以下(1) ⑷(1)核酸，其含有序列號(hào)15所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為三色堇F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò) 1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)15所示的堿基序列進(jìn)行修飾后的堿基序列，(3)核酸，其可作為三色堇F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)15中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸， 及(4)核酸，其可作為三色堇F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)15中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。[12] 一種方法，其特征在于，使用包含所述[11]中所述的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，在菊花植物或除菊花以外的植物中使核酸表達(dá)。[13]根據(jù)所述[12]中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表達(dá)的方法為通過(guò)使與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸表達(dá)從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法。[14]根據(jù)所述[12]中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表達(dá)的方法為通過(guò)使與花色素苷修飾有關(guān)的核酸表達(dá)從而修飾花色素苷的方法。[15] 一種菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了所述[11]中定義的核酸或通過(guò)所述[12] [14]中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)。[16]根據(jù)所述[15]中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，含有芳香族?；ㄉ剀铡17]根據(jù)所述[ 15]或[16]中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或或其部分或組織，其特征在于，含有花翠素。[18]根據(jù)所述[15] [17]中任一項(xiàng)所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。[19] 一種切花加工品，其特征在于，使用了所述[18]中所述的切花。已知認(rèn)為在紅紫蘇葉中控制酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域、即紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可在作為不同種的菊花花瓣中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能。因此，利用紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，可在花等花色素苷積累的組織內(nèi)特異性地啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。作為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的外源基因，有與花色、香味有關(guān)的基因， 但不限于這些。


圖1表示菊花的類(lèi)黃酮生物合成途徑的示意圖、以及花青素3-0-(6〃 -0-monomal onyl- β -glucopyranoside 禾口花青素 3-0- (3 “ ,6 “ -Ο-dimalonyl- β -glucopyranoside 的結(jié)構(gòu)。圖2表示經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的菊花的類(lèi)黃酮生物合成產(chǎn)物的例子。圖3表示紫蘇3AT基因?qū)胗秒p元載體pSPB3311及pSPB3323的示意圖。圖4表示花色素苷的組成發(fā)生變化的轉(zhuǎn)化菊花的HPLC色譜。含有34%芳香族酰基化花色素苷的轉(zhuǎn)化體1275-17。使用質(zhì)粒pSPB3311(參照?qǐng)D3)。1:花青素 3-malonylglucoside、2 花青素 3-dimalonylglucoside、3 花青素 3-芳香族酰基葡萄糖苷。圖5表示從菊花轉(zhuǎn)化體的花瓣中檢測(cè)出的吸收光譜。3個(gè)吸收光譜中，可觀察到用芳香族有機(jī)酸修飾的花色素苷中存在的326nm附近的最大吸收，進(jìn)而對(duì)于經(jīng)過(guò)丙二?；奈展庾V(1、2)來(lái)說(shuō)，花色素苷的最大吸收波長(zhǎng)(從518nm到522nm的約5nm左右)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)。圖6表示花色素苷的組成發(fā)生變化的轉(zhuǎn)化菊花的HPLC色譜。含有50%芳香族酰基化花色素苷、0.8%花翠素糖苷的轉(zhuǎn)化體1300-4。使用質(zhì)粒pSPB3323(參照?qǐng)D3)。1 花青素 3-malonylglucoside、2 花青素 3_dimalonylglucoside、3 花青素 3-芳香族酉先基葡萄糖苷、4 花翠素 3-malonylglucoside。圖7表示質(zhì)粒pSFL635的示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及如下內(nèi)容，包括使用以下載體轉(zhuǎn)化菊花植物的在菊花植物中轉(zhuǎn)錄核酸的方法、通過(guò)轉(zhuǎn)錄與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)方法、通過(guò)轉(zhuǎn)錄與花色素苷修飾有關(guān)的核酸從而修飾花色素苷的方法、通過(guò)所涉及的方法培育出的改變了花瓣花色素苷組成的菊花植物及/或改變了花色的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。其中，上述載體為含有通過(guò)編碼紫蘇的羥基肉桂酰輔酶 A 花色素苷3-葡萄糖苷酰基轉(zhuǎn)移酶(Pf3AT)的基因的5'區(qū)域(Pf3ATpro)(本說(shuō)明書(shū)中， 也稱(chēng)為“紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域”。)，而使3AT、F3' 5' H等的類(lèi)黃酮生物合成系統(tǒng)基因表達(dá)的基因盒的載體(參照?qǐng)D3)。本發(fā)明涉 及如下內(nèi)容，包括使用以下載體轉(zhuǎn)化菊花植物及除菊花以外的植物的在菊花植物及除菊花以外的植物中轉(zhuǎn)錄核酸的方法、通過(guò)轉(zhuǎn)錄與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)方法、通過(guò)轉(zhuǎn)錄與花色素苷修飾有關(guān)的核酸從而修飾花色素苷的方法、通過(guò)所涉及的方法培育出的改變了花瓣花色素苷組成的植物及/或改變了花色的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。 其中，上述載體為含有通過(guò)三色堇的F3’ 5’ H基因的5’區(qū)域(本說(shuō)明書(shū)中，也稱(chēng)為“三色堇 F3’5’H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域”。)，而使F3' 5' H等的類(lèi)黃酮生物合成系統(tǒng)基因表達(dá)的基因盒的載體(參照?qǐng)D3)。本發(fā)明還涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作為切花加工品，包括使用該切花的押花、保鮮花、干花、樹(shù)脂密封品等，但不限于這些。本說(shuō)明書(shū)中，“控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法”是指通過(guò)控制編碼與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的蛋白質(zhì)的基因、例如3AT基因、F3’ 5’ H基因的表達(dá)，從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法。作為上述花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因，例如有來(lái)自紫蘇的花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因。且作為F3，5，H基因，例如有來(lái)自三色堇的F3，5，H基因。根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)使3AT等酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能并使芳香族?；蚧ㄉ剀辙D(zhuǎn)移，可使花色素苷的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，并可使已有的花色帶有藍(lán)色(參照?qǐng)D4、圖5、圖6)。此外，通過(guò)使用Pf3AT啟動(dòng)子及Pf3AT終止子而使紫蘇的3AT基因表達(dá)，可使菊花花色素苷的34% 50%發(fā)生芳香族酰基化(參照?qǐng)D4、圖6)，通過(guò)將該啟動(dòng)子用于各種基因的表達(dá)，可使外源基因在菊花的舌狀花瓣中高效且穩(wěn)定地發(fā)揮功能。此外，通過(guò)使 F3' 5' H基因和3AT基因同時(shí)表達(dá)，可將作為藍(lán)色花色素苷基本骨架的花翠素的糖苷用芳香族?；M(jìn)行修飾(參照?qǐng)D6)，并可培育出藍(lán)色的菊花。作為本發(fā)明中所涉及的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域，例如可例舉由序列號(hào)1或序列號(hào)15中所示的堿基序列組成的核酸。但是，認(rèn)為在由序列號(hào)1或序列號(hào)15中所示的堿基序列組成的核酸中，由數(shù)個(gè)(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè))堿基發(fā)生附加、缺失及/或取代而進(jìn)行修飾的堿基序列所組成的啟動(dòng)子也維持與原有啟動(dòng)子同樣的活性。因此，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域只要在菊花花瓣或其他植物中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域發(fā)揮功能，也可為由通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1或序列號(hào)15中所示的堿基序列進(jìn)行修飾的堿基序列組成的核酸。本發(fā)明中所涉及的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域還進(jìn)一步可作為紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與序列號(hào)1所示的堿基序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，或可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且也可為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。本發(fā)明中所涉及的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域可作為三色堇F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與序列號(hào)15所示的堿基序列在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，或可作為三色堇 F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且也可為與序列號(hào)15中所示的堿基序列有至少 90%序列同一性的核酸。 作為這些核酸，可例舉為可與含有序列號(hào)1或序列號(hào)15中所示的堿基序列的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，由與序列號(hào)1或序列號(hào)15中所示的堿基序列優(yōu)選有約70%以上、 更優(yōu)選有約 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%,94%,95%,96%,97%,98%、最優(yōu)選有約99%的堿基序列同一性的堿基序列所組成的核酸。在此，嚴(yán)謹(jǐn)條件是指由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易確定的雜交條件，通常依賴探針長(zhǎng)度、洗滌溫度及鹽濃度并可憑經(jīng)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。通常，探針越長(zhǎng)，用于適合退火的溫度越高，探針越短退火溫度越低。雜交通常依賴于互補(bǔ)鏈存在于接近但低于其熔點(diǎn)的環(huán)境中時(shí)變性DNA的再退火能力。具體地說(shuō)，例如作為低嚴(yán)謹(jǐn)條件，可例舉在雜交后的篩選的洗滌階段中，在37°C 42°C的溫度條件下，在5XSSC及0. 1% SDS溶液中洗滌等。此外，作為高嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如可例舉在洗滌階段，在65°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS中洗滌等。通過(guò)將嚴(yán)謹(jǐn)條件提高到更高，可得到同源性或同一性高的多核苷酸。本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域包含在表達(dá)載體或表達(dá)盒中，這些表達(dá)載體或表達(dá)盒例如包含序列號(hào)2或WO 04/020637中記載的三色堇F3，5，H基因所示的堿基序列。本發(fā)明涉及導(dǎo)入了上述轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域(核酸)的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其部分或組織，及作為使用本發(fā)明所涉及的方法的結(jié)果而培育出的芳香族酰基化花色素苷、及/或含有花翠素的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織、特別是花瓣、切花。本說(shuō)明書(shū)中，用語(yǔ)“菊花植物(也簡(jiǎn)稱(chēng)為“菊花”)”指菊科(Asteraceae)菊屬 (Chrysanthemum)的植物，例如可例舉栽培菊花(Dendranthema grandif lorum Kitam)、西洋菊、大菊、中菊、小菊等，作為代表種可例舉菊花(Chrys anthemum morifolium)。除菊花以外的植物雖無(wú)特別限制，但優(yōu)選為月季。實(shí)施例以下，通過(guò)實(shí)施例，具體說(shuō)明本發(fā)明。在無(wú)特殊要求的情況下，分子生物學(xué)的方法按照Molecular Cloning (Sam brook and Russell, 2001)進(jìn)行。^mm ι -M^nrn^ 3- tmwumykM^m^M.已知紫蘇中有葉中積累花色素苷的紅色變種和不積累花色素苷的綠色變種。從前者的葉中，將其染色體DNA用所報(bào)道的方法(參照Plant Mol Biol. December 1997 ；35 (6) 915-27)進(jìn)行制備。將該染色體DNA用Sau3AI (Τ0Υ0Β0公司制)進(jìn)行部分酶切，通過(guò)蔗糖密度梯度法回收含有10 15kb的DNA片段的組分。通過(guò)將該片段使用公知的方法插入作為 λ噬菌體載體的一種的EMBL3 (Promega公司制)的BamHI位點(diǎn)，制作染色體DNA文庫(kù)。將所得到的文庫(kù)以來(lái)自紫蘇的作為花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶的cDNA的pSAT208(參照Plant Cell P hysiol. April 2000 ；41 (4) 495-502)為探針使用來(lái)進(jìn)行篩選。文庫(kù)的篩選根據(jù)已報(bào)道的方法(參照Plant Cell Physiol. July 1996 ；37 (5) :711_6)進(jìn)行。將探針和雜交了的噬菌斑純化后進(jìn)行培養(yǎng)，從所得到的噬菌體中制備DNA。實(shí)施例2 紫蘇花餼素苷3-?；D(zhuǎn)移酶染餼體基因的堿基序列確定用XbaI酶切上述得到的DNAlO μ g，用0.7%瓊脂糖凝膠分離后，在High Bond MAmersham公司制)上轉(zhuǎn)膜。將該膜用如上所述相同的方法雜交時(shí)，可知有約6. 8kb 的DNA片段與探針雜交。用XbaI酶切該DNA 20 μ g，用0. 7 %瓊脂糖凝膠分離后，將約6. 8kb的DNA片段用Gene Clean(funakoshi株式會(huì)社)進(jìn)行精制，與用XbaI酶切的 pBluescriptSKII-連接。將所得到的質(zhì)粒作為pSPB513。將該質(zhì)粒中所含有的來(lái)自紫蘇的 DNA序列通過(guò)引物步查法確定。其堿基序列如序列號(hào)4中所示。該序列中有與作為花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶cDNA的pSAT208顯示高同源性的區(qū)域，該區(qū)域編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列(序列號(hào)6)與PSAT208的編碼氨基酸序列相比，發(fā)現(xiàn)有19個(gè)氨基酸殘基的取代和2個(gè)氨基酸的缺失，未觀察到內(nèi)含子。另外，包含與上述PSAT208顯示高同源性的區(qū)域的序列， 包含在認(rèn)為是其起始密碼子ATG上游的3438bp的序列和在認(rèn)為是其終止密碼子TAA下游的2052bp的序列。在上述3438bp的序列中，存在不是花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶的其他開(kāi)放閱讀框(0RF，序列號(hào)5)。除了該部分以外，為擴(kuò)增紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)。棚列3瀠絲盧避3-酉先雜纏細(xì)周抓刪?！霸?Ing 的 pSPB513 為模板，使用 2 種引物(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’ ( 序列號(hào)7，下線部為HindIII的識(shí)別序列)、5，-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’ (序列號(hào)8， 下線部為BamHI的識(shí)別序列)進(jìn)行PCR(95°C保 持1分鐘后，25個(gè)循環(huán)的52°C 1分鐘、72°C 2 分鐘、95°C 1分鐘的反應(yīng))。用HindIII和BamHI酶切所擴(kuò)增的約1. Ikb的DNA片段。用PacI酶切專(zhuān)利文獻(xiàn)4中所記載的質(zhì)粒pSPB567 (在附加有增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子的3’側(cè)連接來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因，進(jìn)而在其3’側(cè)連接胭脂堿合成酶的終止子)，將包含來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因的DNA片段克隆到pBin+(參照Transgenic Research 4，288-290，1995)的PacI位點(diǎn)。將在所得到的質(zhì)粒中附加有增強(qiáng)子的花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子在pBin+的AscI位點(diǎn)附近存在時(shí)的質(zhì)粒作為pSPB575。用HindIII和 BamHI酶切該質(zhì)粒，向其中插入用HindIII和BamHI酶切包含所述紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的約1. Ikb DNA片段后的DNA片段。將所得到的質(zhì)粒作為pSFL205。用HindIII和SacI酶切pSFL205，回收約IOObp的DNA片段。將該DNA片段、與用 SacI和XbaI酶切pSPB513而得到的約4kb的DNA片段、和用HindIII和XbaI酶切的質(zhì)粒 PBin+連接，得到質(zhì)粒pSPB3311。該質(zhì)粒pSPB3311成為包含序列號(hào)2中所示的堿基序列的雙元載體，包含紫蘇花色素苷3-酰基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域和該基因的翻譯區(qū)域及其3’側(cè)的非翻譯區(qū)域。實(shí)施例4 :pSPB3323的構(gòu)建將三色堇的F3，5，H基因BP#40(參照WO 04/020637)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域使用TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit，如下進(jìn)行擴(kuò)增。從三色堇的葉中使用DNA easy plant kit (QIAGEN公司)制備染色體DNA。用限制酶Hindi 11酶切3 μ g的染色體DNA。將酶切的DNA使用Hindi 11末端DNA (在TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit 中含有)和 Ligation High (TOYOBO)，16°C下反應(yīng) 40 分鐘，進(jìn)行連接。將反應(yīng)液4 μ 1用10 μ 1的水稀釋?zhuān)瑢⑦B接后的DNA在94°C下處理10分鐘變性后，在冰中冷卻。加入 5pmol 的引物 Cl (5，-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3，，序列號(hào)9，為HindIII盒序列的一部分序列，包含在Kit中)和5pmol的引物BP40_i5 (5’-AGGTG CATGATCGGACCATACTTC-3，，序列號(hào)10，相當(dāng)于BP#40翻譯區(qū)域的互補(bǔ)鏈)，根據(jù)試劑盒中的實(shí)驗(yàn)方法，在25 μ 1的反應(yīng)液中重復(fù)進(jìn)行30次98°C 20秒、68°C 15分鐘的反應(yīng)。將反應(yīng)液用水稀釋到10倍。其中，以0. 5μ 1為模板，在包含5pmol的引物C2(5，-CGTTAGAACGCGTA ATACGACTCACTATAGGGAGA-3，，序列號(hào)11，為HindIII盒序列的一部的序列，包含在Kit中) 和 5pmol 的引物 BP40-i7(5，-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3，，序列號(hào) 12)的 25 μ 1 的反應(yīng)液中進(jìn)行98 °C 5分鐘的反應(yīng)后，重復(fù)進(jìn)行30次98 °C 20秒、68°C 15分鐘的反應(yīng)。將所得到的DNA片段導(dǎo)入質(zhì)粒pCR2. 1 (Invitrogen公司)中。在確定所插入的 DNA的堿基序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)有其序列與BP#40的cDNA堿基序列不一致之處。認(rèn)為這是因?yàn)樵谶M(jìn)行PCR時(shí)會(huì)引起錯(cuò)誤。為擴(kuò)增沒(méi)有錯(cuò)誤的序列，進(jìn)行以下操作為擴(kuò)增約2kb的BP#40的5，-非翻譯區(qū)域和200bp的翻譯區(qū)域，以200ng的三色堇的染色體DNA為模板，使用50pmol的引物BP40_i7 (序列號(hào)12)和50pmol的引物BP40 ρ ro-F(5' -ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3，，序列號(hào) 13，BP#40 基因的 5，-非翻譯區(qū)域中的序列)，在25 μ 1的反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。在98°C處理5分鐘后，重復(fù)進(jìn)行30次包括98°C 20 秒和68°C 15分鐘的反應(yīng)。將所擴(kuò)增的DNA片段插入到pCR2. 1中。在該DNA片段中含有約 2. Ikb的5，-非翻譯區(qū)域和200bp的翻譯區(qū)域。將該質(zhì)粒作為PSFL614。質(zhì)粒pSFL614序列的堿基序列如序列號(hào)14中所示。為了轉(zhuǎn)錄BP#40基因，使用pSFL614中所含有的約2. Ikb的5，-非翻譯區(qū)域 (BP40pro，序列號(hào)15)。此時(shí)，將BamHI位點(diǎn)變更為NheI。以Ing的pSFL614質(zhì)粒為模板，力口 Λ 50pmol 的引物 BP40pro-HindIII-F(5，-AAG CTT GTG ATC GAC ATC TCT CTC C-3，，序列號(hào) 16)禾口 50pmol 的引物 BP40pro-NheI_R(5，-CGA GGC TAG CTA AAC ACT TAT-3，，序列號(hào) 17)、Ex-TaqDNA聚合酶，在25 μ 1的反應(yīng)液中98°C下保持5分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25次98 °C 20 秒、68°C 15分鐘的反應(yīng)。將擴(kuò)增的DNA片段克隆到pCR2. 1上。通過(guò)確認(rèn)堿基序列，確定該序列中沒(méi)有因PCR引起的錯(cuò)誤。將該質(zhì)粒用HindIII和NheI酶切，得到470bp的DNA片段。 將該DNA片段作為片段A。以 Ing 的 pSFL614 質(zhì)粒為模板，加入 50pmol 的引物 BP40pro-NheI_F(5，-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3，，序列號(hào) 18)禾口 50pmol 的引物 BP40pro_BamHI-R(5，-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3，，序列號(hào) 19)、Ex-TaqDNA 聚合酶，在 25 μ 1 的反應(yīng)液中 98°C 保持5分鐘后，重復(fù)進(jìn)行25次98°C 20秒、68°C 15分鐘的反應(yīng)。將擴(kuò)增DNA片段克隆到 PCR2. 1上。通過(guò)確認(rèn)堿基序列，確定該序列上沒(méi)有因PCR引起的錯(cuò)誤。用HindIII和NheI 酶切該質(zhì)粒，得到630bp的DNA片段。將該DNA片段作為片段B?；厥沼肂amHI和HindIII酶切專(zhuān)利文獻(xiàn)4中所記載的質(zhì)粒pSPB567后產(chǎn)生的DNA 片段中大的片段，連接上述的片段A和片段B，作為pSFL620。用PacI酶切pSFL620后，回收約3. 2kb的DNA片段。將該DNA片段插入pBin+的 PacI位點(diǎn)。將所得到的質(zhì)粒作為PSPB3317。將用AscI和XbaI酶切上述pSPB3311而得到的片段導(dǎo)入PSPB3317的AscI和XbaI位點(diǎn)，將所得到的質(zhì)粒作為pSPB3323。實(shí)施例5 紫蘇花餼素苷3-?；D(zhuǎn)移酶染餼體基因在菊花中的表達(dá)將實(shí)施例3中制備的pSPB3311導(dǎo)入土壤桿菌中，使用該土壤桿菌將菊花品種94-765 (精興園，未發(fā)售)通過(guò)公知的方法轉(zhuǎn)化。菊花的轉(zhuǎn)化例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)8中所記載， 但轉(zhuǎn)化方法不限于此。獲得6個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。將該舌狀花瓣冷凍后粉碎，將粉碎后的花瓣50 IOOmg用500 μ 1的50%乙酸水溶液提取，用0. 45 μ m的過(guò)濾器過(guò)濾。將該提取液中所含有的花色素苷用蒸餾水稀釋到5倍后作為分析樣品，使用高效液相色譜法用以下條件分析。色譜柱使用 Inertsil ODS-2 (粒徑 5 μ m，4. 6 X 250mm，GL Sciences)，流速為 0. 8ml/ min,流動(dòng)相用從含有1. 5%磷酸的4%乙酸、5%乙腈到20 %乙酸、25 %乙腈的直線濃度梯度洗脫40分鐘后，用含有1. 5%磷酸及20%乙酸的25%乙腈進(jìn)行10分鐘的等度洗脫。檢測(cè)使用Agilent 1100系列二極管陣列檢測(cè)器(GL Sciences)，檢測(cè)出從250nm到600nm的波長(zhǎng)區(qū)域，由530nm吸光度的面積求出各花色素苷的存在比。

在作為轉(zhuǎn)化體的分析系統(tǒng)1275-13、1275-14、1275-15、及1275-17中的花色素苷中，分別有23%、1%、17%及34%的花色素苷的保留時(shí)間為20分鐘以上，表明這些花色素苷已被芳香族?；揎?。保留時(shí)間為20分鐘以上時(shí)被洗脫出的花色素苷的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，通過(guò)上述轉(zhuǎn)化，可使已有的花色中帶有藍(lán)色。另一方面，原有菊花品種 94-765的花瓣中的花色素苷中，不存在保留時(shí)間為20分鐘以上的花色素苷。通過(guò)LC-FT-ICR-MS 的方法(J. Japan. Soc. Hort. Sci. 77 :94_102(2008)，Plant J. 54 949-962)分析重組菊花1275-17的花色素苷。使用該方法時(shí)，可測(cè)定花色素苷的精密質(zhì)譜，可通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜分析得到MS/MS譜。在菊花1275-17中，檢測(cè)出了在宿主中檢測(cè)不到的相當(dāng)于花青素(香豆酰)葡萄糖苷的化合物(檢測(cè)m/z 595. 146259)，檢測(cè)出了 MSMS 碎片相當(dāng)于花青素的(僅為m/z 287. 1)的峰。以上結(jié)果說(shuō)明了作為不同種的紫蘇的3AT轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在菊花植物中發(fā)揮了功能，紫蘇的3AT也在菊花中發(fā)揮了功能，并使花色素苷的結(jié)構(gòu)和花的顏色發(fā)生了變化。且通過(guò)本發(fā)明，可知通過(guò)使3AT等的酰基轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮功能并使芳香族?；D(zhuǎn)移到花色素苷中， 可使花色素苷的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)移動(dòng)(參照?qǐng)D4、圖5、圖6)。實(shí)施例6 紫蘇花餼素苷3-?；D(zhuǎn)移酶染餼體基因和三餼堇F3’ 5’ H基因在菊花中的表汰將實(shí)施例4中制備的pSPB3323導(dǎo)入土壤桿菌中，使用該土壤桿菌將菊花品種 94-765 (精興園，未發(fā)售)通過(guò)公知的方法轉(zhuǎn)化。獲得6個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。將該花瓣中所含有的花色素苷用實(shí)施例5中所述的方法并使用高效液相色譜儀進(jìn)行分析。在各個(gè)作為轉(zhuǎn)化體的分析系統(tǒng)1300-2、1300-3、及1300-4中，有20%、2%及50% 的花色素苷的保留時(shí)間為20分鐘以上，表明這些花色素苷已被芳香族?；揎?。宿主的花色素苷中不存在保留時(shí)間為20分鐘以上的花色素苷。以上結(jié)果說(shuō)明了作為不同種的紫蘇的3AT轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在菊花植物中發(fā)揮了功能，紫蘇的3AT也在菊花中發(fā)揮了功能，并使花色素苷的結(jié)構(gòu)和花的顏色發(fā)生了變化。因此，通過(guò)將紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域用于各種基因的表達(dá)，可使外源基因在菊花的舌狀花瓣中高效且穩(wěn)定地發(fā)揮功能。此外，將用以下方法提取的花色素進(jìn)行分析。將舌狀花瓣冷凍后粉碎，將粉碎后的花瓣50 IOOmg用500μ 1的鹽酸甲醇提取，在該提取液中加入500μ 1的4N鹽酸(HCl) 并混合，100°C下進(jìn)行1小時(shí)水解。將水解后的溶液冷卻后，添加Iml的0. 05M三氟乙酸 (TFA)并混合。而后，將該溶液添加到S印-Pak C18 (MILLIP0RE)中吸附水解產(chǎn)物。S印-PakC18預(yù)先用80%乙腈(MeCN)洗滌后，用0. 05M TFA平衡。將吸附在S印-Pak C18上的水解產(chǎn)物用0. 05M TFA洗滌后，進(jìn)一步用20% MeCN、0. 05M TFA洗滌，而后用80% MeCN、0. 05M TFA洗脫水解產(chǎn)物，作為分析樣品。分析樣品使用高效液相色譜儀用以下條件分析。色譜柱使用Inertsil 0DS-2 (粒徑 5μ ，4. 6X250mm，GL Sciences)，流速為 0. 8ml/min，流動(dòng)相用從含有 1. 5%磷酸的 5% 乙酸、6. 25%乙腈到20%乙酸、25%乙腈的直線濃度梯度洗脫20分鐘后，用含有1.5%磷酸及20%乙酸的25%乙腈進(jìn)行5分鐘的等度洗脫。檢測(cè)使用Agilent 1100系列二極管陣列檢測(cè)器(GL Sciences)，檢測(cè)出從250nm到600nm的波長(zhǎng)區(qū)域，由530nm吸光度的面積求出各花色素的存在比。

分析的結(jié)果，在作為轉(zhuǎn)化體的分析系統(tǒng)1300-3、1300-4、1300-5、及1300-6中，檢測(cè)出花翠素分別占總花色素的0.9%、0.8%、1.4%及0.6%。這表明三色堇的BP40轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域控制BP40的轉(zhuǎn)錄。表明在檢測(cè)出花翠素及證明已被芳香族?；揎椀幕ㄉ剀盏?300-3及1300-4中，也包含被芳香族?；揎椀幕ù渌匦突ㄉ剀?。這樣，通過(guò)使 F3' 5' H和3AT同時(shí)表達(dá)即可控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)，可通過(guò)用芳香族?；揎椬鳛樗{(lán)色花色素苷基本骨架的花翠素糖苷，從而培育出藍(lán)色菊花。實(shí)施例7 :dBI121-紫蘇 3ATpro: ADHNF-三盧,繭 F3‘ 5' H#40:紫蘇 3ATter 的制作以實(shí)施例3中所得到的質(zhì)粒pSPB3311為模板，將HAP_gPf3ATpro_long_Fd(5' -AA GCTTGGCGCGCCGTTTAAACAACTATTATGATCCCACAG-3 ‘，序列號(hào) 20)和 X-gPf3ATpro_Rv (5 ‘ -TC TAGAGGCGGTGTTGAACGTAGCTGTGG-3‘，序列號(hào) 21)作為引物使用，通過(guò)使用 Prime Star DNA 聚合酶(Takara)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增約1. Ikbp的紫蘇花色素苷3_?；D(zhuǎn)移酶基因(Pf3AT)的啟動(dòng)子區(qū)域(Pf3ATpro)。將所得到的PCR產(chǎn)物克隆到pCR-Bluntll-TOPO (Invitrogen)上， 將所得到的質(zhì)粒作為pCR-Pf3ATpro。而后，以PSPB3311 為模板，將 SSS-gPf3ATter_Fd (5 ‘ -GAGCTCACTAGTGTCGACTAAA TGTATGTAATTAAACTAAT-3 ‘，序列號(hào) 22)、及 ESS_gPf3ATter_Rv (5 ‘ -GAATTCAGGCCTGCCCGGG CTATCTTTATCATATTTCGTCTAC-3‘，序列號(hào) 23)作為引物使用，使用 Prime Star DNA 聚合酶 (Takara)，通過(guò)PCR，擴(kuò)增約1. 5kbp的紫蘇花色素苷3_?；D(zhuǎn)移酶基因的3'側(cè)非翻譯區(qū)域(Pf3ATter)。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR-Bluntll-TOPO(Invitrogen)上，將所得到的質(zhì)粒作為 pCR-Pf3ATter。將用SacI和EcoRI酶切pCR_Pf3ATter而得到的Pf3ATter DNA片段插入 pBI 121-ADHNF的SacI和EcoRI位點(diǎn)。而后，將用HindIII和XbaI酶切所得到的質(zhì)粒后與用HindIII和XbaI酶切pCR_Pf3ATpro而得到的Pf3ATpro DNA片段連接得到雙元載體，將所得到的雙元載體作為pBI121-Pf3ATp-GUS-Pf3ATt。將Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的染色體 DNA 文庫(kù)使用 λ BlueSTAR Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen,http://www. merckbiosciences. com/product/69242)如下制作。由 Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的嫩葉中使用 Nuc Ieon Phytopure [Registered] (TEPNEL Life Sciences)制備染色體DNA。將約100 μ g的染色體DNA用限制酶Sau3AI進(jìn)行部分酶切。將該DNA 片段在 dGTP 和 dATP 的存在下用 DNA聚合酶 I Klenow fragment (Τ0Υ0Β0)進(jìn)行部分Fill-In，通過(guò)蔗糖密度梯度離心進(jìn)行分離。回收約13kb大小的DNA，通過(guò)乙醇沉淀進(jìn)行濃縮。將約 180ng 的 DNA 與 1 μ 1 的 λ BlueSTAR Xho I Half-Site Arms Kit 在 4°C下進(jìn)行15小時(shí)連接后，進(jìn)行體外包裝(in vitro packaging)反應(yīng)，得到染色體文庫(kù)。將該Rosa ru gosa Thunb. ex Murray染色體DNA文庫(kù)通過(guò)藍(lán)豬耳的黃烷酮3_羥化酶(F3H)cDNA(NCBI No.AB211958)進(jìn)行篩選，得到表示信號(hào)的噬菌斑。從其中的1噬菌斑中，使用制造者(Novagen)推薦的方法進(jìn)行體內(nèi)切割，轉(zhuǎn)換為質(zhì)粒。通過(guò)用限制酶SpeI酶切該質(zhì)粒，回收2. 6kb的DNA片段，亞克隆到pBluescript SKII-(STRATAGENE)的SpeI位點(diǎn)，得到質(zhì)粒PSPB804。該質(zhì)粒具有與F3H顯示同源性的堿基序列。為擴(kuò)增F3H的5'-非翻譯區(qū)域，以Ing的pSPB804為模板，使用引物RrF3H_F(5， -AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3，，序列號(hào) 26)、引物 RrF3H (5，-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTT C-3，，序列號(hào)27)及Ex-Taq DNA聚合酶(Takara)，在50 μ 1的反應(yīng)液中進(jìn)行PCR。PCR的反應(yīng)條件為94°C下反應(yīng)5分鐘后，重復(fù)進(jìn)行30次94°C 30秒、50°C 30秒、72°C 30秒為1循環(huán)的反應(yīng)，進(jìn)而在72°C下保持7分鐘。將所得到的DNA片段插入pCR-TOPO (INVITR0GEN)中， 得到質(zhì)粒PSPB811。從該質(zhì)粒中，用HindIII和BamHI可回收約1. 2kb的F3H的5'-非翻譯區(qū)域。將專(zhuān)利文獻(xiàn)4中所記載的pSPB567(包含附加有E12增強(qiáng)子的CaMV35S啟動(dòng)子、 三色堇的F3' 5' HBP40、胭脂堿合成酶終止子的質(zhì)粒pUC)的啟動(dòng)子部分使用HindIII和 BamHI置換成約1. 2kb的F3H的5 ‘-非翻譯區(qū)域，得到質(zhì)粒pSF L814 (包含R. rugosa F3H 5' :BPF3‘ 5' H#40 :nos 3')。將以pSFL814 為模板、將 ADH-BP40_Fd (5 ‘ -CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTAGTCACCGA C-3'，序列號(hào) 28)和 NcoI-BP40-Rv(5' -CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3 ‘,序列號(hào) 29)作為引物使用并用PCR擴(kuò)增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221為模板、將BamHI-ADH-Fd (5 ‘ -CG CGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3 ‘，序列號(hào) 30)和 BP40_ADH-Rv (5 ‘ -TAGAATTGCCATTTATT TTTCTTGATTTCCTTCAC-3'，序列號(hào)31)作為引物使用并用PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行混合，將混合后的片段用作模板，將BamHI-ADH-Fd和NcoI-BP40-RV作為引物使用，通過(guò)PCR，得到煙草ADH-5' UTR 94bp與三色堇F3，5，H#40的起始密碼子直接連接的DNA片段。將該DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后，通過(guò)將用BamHI及NcoI酶切而得到的約600bp的DNA片段與用BamHI及NcoI酶切pSFL814而得到的雙元載體片段連接，得到 pBinPLUS Rosa rugosa Thunb. ex MurrayF3Hpro ADHNF-三色堇F3‘ 5' H#40 :N0Stero以 pBINPLUS Rosa rugosa Thunb. ex MurrayF3Hpro ADHNF-三色堇 F3‘ 5' H#40 NOSter 為模板，將 SpelSmaI-ADH-Fd(5‘ -ACTAGTCCCGGGGTCTATTTAACTCAG TATTCAG-3 ‘，序列號(hào) 24)和 SacI_BP40-Rv(5 ‘ -GAGCTCTCAGGTTGCGTACGGGTTTGAGG-3 ‘， 序列號(hào)25)作為引物使用，使用Prime Star DNA聚合酶，通過(guò)PCR，擴(kuò)增ADHNF-三色堇 F3' 5' H#40 DNA片段。將該DNA片段克隆到pCR-Bluntll-TOPO上，將所得到的質(zhì)粒作為 pCR-ADHBP40-SpeSac。將用SpeI 及 EcoICRI 酶切 pCR-ADHBP40_SpeSac 而得到的 ADHNF-三色堇 F3 ‘ 5 ‘ H#40 DNA 片段與用 SalI 酶切 pBI121_Pf3ATp-GUS_Pf3ATt 后用 Blunting High(TOYOBO)進(jìn)行末端平滑化進(jìn)而用XbaI酶切而得到的雙元載體的片段進(jìn)行連接，通過(guò)這樣，得到PBI121-紫蘇3ATpro: :ADHNF-三色堇F3' 5' H#40:紫蘇3ATter，將其轉(zhuǎn)化到Agrobacterium tumefaciens EH A105 株中。使用該轉(zhuǎn)化土壤桿菌，得到來(lái)自菊花品種大平的重組菊花7個(gè)系統(tǒng)。其中的5個(gè)系統(tǒng)中檢測(cè)出花翠素，花翠素含有率達(dá)17. 7%。此外，通過(guò)將由pBI121-紫蘇3ATpro: :ADHNF-三色堇F3 ‘ 5 ‘ H#40::紫蘇 3ATter得到的紫蘇3ATpro: ADHNF-三色堇F3' 5' H#40紫蘇3ATter的表達(dá)盒導(dǎo)入 pffTT2132(W096/36716)中而構(gòu)建 PSPB37I8,轉(zhuǎn)化到 Agrobacterium tumefaciens AglO 株中。使用該轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化菊花品種Improved Regard精興園)。得到25個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化菊花， 其中7個(gè)系統(tǒng)中可發(fā)現(xiàn)有花色變化?；ù渌睾新首罡邽?0%。實(shí)施例8將pSFL535 (如W02008/156206中所記載)用PacI部分酶切，回收除去包含三色堇F3' 5’ H基因的表達(dá)盒的DNA片段。將該DNA片段與用PacI酶切實(shí)施例4中所述的 PSFL620而得到的約3. 2kb的DNA片段連接，得到具有圖7所示結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒pSFL635。該質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入植物中時(shí)，可期待來(lái)自藍(lán)豬耳的黃酮合成酶基因和來(lái)自藍(lán)豬耳的花色素苷甲基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行組成型表達(dá)，三色堇F3' 5’ H基因在花瓣中特異性表達(dá)。將該質(zhì)粒用 W02008/156206中記載的方法導(dǎo)入土壤桿菌中，再導(dǎo)入月季品種WKS124中，得到83個(gè)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。在這些花瓣中，含有WKS124中不存在的二甲花翠素、矮牽牛苷配基及花翠素。這些物質(zhì)在總花色素中的合計(jì)量平均為73 %，最高為85 %。該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)中得到的來(lái)自三色堇BP40的啟動(dòng)子區(qū)域(pSFL514中所含有的約2. Ikb的5'非翻譯區(qū)域(BP40pro， 序列號(hào)15，參照實(shí)施例4)適用于使外源基因在植物、特別是在月季中表達(dá)。已知認(rèn)為在紅紫蘇的葉中控制酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子區(qū)域、即紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域可在作為不同種的菊花的花瓣中作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能。因此，利用紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，可在花等花色素苷積累的組織內(nèi)特異性地啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。作為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的外源基因，有與花色、香味有關(guān)的基因，但不限于這些。此外，還可知來(lái)自三色堇的F3’ 5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域在用于改變菊花植物或除菊花以外的植物花色時(shí)有用。
權(quán)利要求
1.一種方法，其特征在于，其為使用包含選自以下(1) (4)中的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，通過(guò)基因重組技術(shù)在菊花植物中轉(zhuǎn)錄核酸的方法(1)核酸，其含有序列號(hào)1所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)1所示的堿基序列進(jìn)行修飾后的堿基序列，(3)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)1中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)1中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄核酸的方法為通過(guò)轉(zhuǎn)錄與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄核酸的方法為通過(guò)轉(zhuǎn)錄與花色素苷修飾有關(guān)的核酸從而修飾花色素苷的方法。
4.一種方法，其特征在于，使用包含權(quán)利要求1中定義的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，使紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶在菊花植物中表達(dá)，從而生產(chǎn)在花瓣中含有芳香族酰基化花色素苷的菊花植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4中所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體或表達(dá)盒包含序列號(hào)2所示的堿基序列。
6.一種菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求1中定義的核酸或通過(guò)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，含有芳香族?；ㄉ剀?。
8.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，含有花翠素。
9.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的菊花植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。
10.一種切花加工品，其特征在于，使用權(quán)利要求9中所述的切花。
11.一種核酸，其特征在于，選自以下⑴ ⑷(1)核酸，其含有序列號(hào)15所示的堿基序列，(2)核酸，其可作為三色堇F3’5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且含有通過(guò)1個(gè)或數(shù)個(gè)堿基序列發(fā)生附加、缺失及/或取代而對(duì)序列號(hào)15所示的堿基序列進(jìn)行修飾后的堿基序列，(3)核酸，其可作為三色堇F3’5’ H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為可與由序列號(hào)15中所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的核酸在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸，及(4)核酸，其可作為三色堇F3’5’H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域而發(fā)揮功能，且為與序列號(hào)15 中所示的堿基序列有至少90%序列同一性的核酸。
12.一種方法，其特征在于，使用包含權(quán)利要求11中所述的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒，在菊花植物或除菊花以外的植物中使核酸表達(dá)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表達(dá)的方法為通過(guò)使與類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)有關(guān)的核酸表達(dá)從而控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法。
14.根據(jù)權(quán)利要求12中所述的方法，其特征在于，使所述核酸表達(dá)的方法為通過(guò)使與花色素苷修飾有關(guān)的核酸表達(dá)從而修飾花色素苷的方法。
15.一種菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求11中定義的核酸或通過(guò)權(quán)利要求12 14中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，含有芳香族酰基化花色素苷。
17.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或或其部分或組織，其特征在于，含有花翠素。
18.根據(jù)權(quán)利要求15中所述的菊花植物或除菊花以外的植物或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織，其特征在于，其為切花。
19.一種切花加工品，其特征在于，使用權(quán)利要求18中所述的切花。
全文摘要
本發(fā)明提供使用用于改變花色的有用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域并通過(guò)基因重組技術(shù)在菊花植物或除菊花以外的植物中控制類(lèi)黃酮合成系統(tǒng)的方法、修飾花色素苷的方法、生產(chǎn)在花瓣中含有經(jīng)過(guò)修飾的花色素苷的菊花植物或除菊花以外的植物的方法、及導(dǎo)入了該調(diào)控區(qū)域的菊花植物或除菊花以外的植物、或其后代或其營(yíng)養(yǎng)繁殖體或其部分或組織。本發(fā)明所涉及的方法中，使用紫蘇花色素苷3-?；D(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，例如含有序列號(hào)1所示的堿基序列的核酸，或使用三色堇F3’5’H基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域，例如包含含有序列號(hào)15所示堿基序列的核酸的表達(dá)載體或表達(dá)盒。
文檔編號(hào)A01H1/00GK102421904SQ20108001828
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月24日
發(fā)明者佐藤早苗, 大宮明美, 田中良和, 野田尚信, 間竜太郎 申請(qǐng)人:三得利控股株式會(huì)社