專利名稱：啟動子BGIosP514及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動子，特別是涉及一種來源于水稻的啟動子BGIOSP514，及其用 于調(diào)控植物目的基因表達的用途。
背景技術(shù)：
啟動子是基因的一個組成部分，通常位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游，是RNA聚合酶識別、 結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子能夠指導全酶(holoenzyme)同模板正確結(jié)合，活 化RNA聚合酶，啟動基因轉(zhuǎn)錄，從而控制基因表達(轉(zhuǎn)錄)的起始時間和表達的程度。在轉(zhuǎn) 基因植物中，啟動子是影響轉(zhuǎn)基因表達效率的重要因素之一，選擇高效率的啟動子是高效 率表達外源基因的關(guān)鍵。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類組成型啟動子、組織或器官特異性啟動 子和誘導型啟動子。所謂組成型啟動子是指在組成型啟動子調(diào)控下，不同組織器官和發(fā)育 階段的基因表達沒有明顯差異，因而稱之組成型啟動子。雙子葉植物中最常使用的組成型 啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子。另一種高效的組成型啟動子CsVMV是從木薯 葉脈花葉病毒(cassava vein mosaic virus)中分離的。人們高度重視從植物本身克隆組成型啟動子。例如肌動蛋白(actin)和泛素 (ubiquitin)等基因的啟動子已被克隆。用這些啟動子代替CaMV 35S啟動子，可以更有效 地在單子葉植物中驅(qū)動外源基因的轉(zhuǎn)錄。Naomi等分別從擬南芥的色氨酸合酶β亞基基因 和植物光敏色素基因中克隆了相應啟動子，用其代替CaMV 35S啟動子，在轉(zhuǎn)基因煙草中也 取得了很好的表達效果(Plant biotechnology, 2002,19(1) :19-26)。單子葉植物基因中常見的啟動子有山bi啟動子(Plant ubiquitinpromoter)、 Act in 啟動子(Plant Actin promoter)禾口 Adh-I 啟動子(Maize alcohol dehydrogenase lpromoter)。Ub i啟動子以其啟動效率高、甲基化程度低、遺傳性狀穩(wěn)定等因素而倍受青睞。目 前，已經(jīng)從很多泛素基因中分離得到啟動子序列，包括玉米基因組中的證i-1啟動子、水稻 泛素RUBQ2啟動子、擬南芥泛素啟動子、向日葵泛素WdBI啟動子、煙草泛素Ub i. U4啟動 子、馬鈴薯泛素證i 7啟動子、番茄泛素證il-Ι啟動子，大麥泛素Mubl啟動子。玉米泛 素證i-Ι啟動子已經(jīng)廣泛地應用于玉米、小麥、水稻等單子葉植物中，水稻泛素RUBQ2啟動 子在水稻和甘蔗中也有較多的應用。Actin啟動子1990年由康奈爾大學的McElroy等首次在水稻中發(fā)現(xiàn)，屬于強組成 型啟動子。Actin啟動子在單子葉禾本科中作用顯著，但是鄰近科屬的植物中的基因調(diào)控功 能卻十分不理想。因此，許多相關(guān)研究通過其他單子葉植物尋找Actin啟動子，并成功在香 蕉、甜瓜、玉米和擬南芥中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。Actin啟動子由于對基因表達的強調(diào)控作用，在單子葉 植物優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因中已經(jīng)得到越來越廣泛的應用。Adh-I啟動子調(diào)控ADH(alcohol dehydrogenase)基因，對植物在缺氧環(huán)境下乙醇 脫氫酶的表達至關(guān)重要。Adh-I啟動子對單子葉植物特別是谷類植物如水稻、燕麥和大麥，和少部分雙子葉植物如煙草，基因的調(diào)控功能比CaMV (花椰菜花葉病毒CaMV) 35S啟動子提 高10-50倍。Adh-I啟動子主要應用于單子葉植物，對絕大部分雙子葉植物基因表達的調(diào)控 效果都很有限。單子葉植物是被子植物的主要類群，單子葉植物中的禾本科、百合科、棕櫚科和天 南星等，是非常重要的農(nóng)業(yè)作物。單子葉植物基因的強效啟動子，能夠調(diào)控植物高效率表達 具有特殊性狀的外源基因，對優(yōu)良作物的分子育種研究意義重大。在強效啟動子相關(guān)研究領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)并驗證了許多單子葉植物的啟動子。此外，雙子 葉植物中的一些強效啟動子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)啟動子、番茄E8啟動 子、白藜蘆醇合酶基因Vstl啟動子等高效啟動子，在單子葉植物中也有很強的基因調(diào)控作 用。盡管已經(jīng)有上述已知的單子葉植物的啟動子，本發(fā)明人通過對水稻基因組的深入 研究，提供了一種新的單子葉植物啟動子，所述啟動子能夠用于調(diào)控單子葉植物中目的基 因的表達，同時為研究單子葉植物中目的基因表達提供了一種新的工具和選擇。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個方面涉及一種啟動子，所述啟動子含有選自以下任意一組并具有啟 動子功能的核苷酸序列a、Seq ID NO 1所示的核苷酸序列；以與kq ID NO 1互補的核苷酸序列；C、在高等嚴緊條件下能夠與上述a或b的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；d、對上述a或b所示核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、缺失、添加修飾的核 苷酸序列；e、與上述a或b所示核苷酸序列具有至少90%同一性的核苷酸序列。所述SEQ ID NO 1的序列如下TTAACACTAGTTTGTATATATGGTCTAGCCGGTGTGCTGACATCCGATACCGTGCGCGGCGACGGGGTA GACGAAGTGGTCGGGGCCGTGCTGCGCGTGGACGACGACGACCGAAACGGCGCCGGCGCGGCGCCCGATGACGTTGT CCAGCGCCCACGACAGCGCGTTCAGGCTCTCCTCGCTCGCGTCCACGGCCACCACCACCTTCATCGTCCCCGCCGCC GCTCCCGGCTCCCCGCTCGTCGCCGCCGCCGCCGCGGGAGACGCGCCCTTCTCCTCCATCTCGCAGTCGCTCTCTCA CTAGTTTACCTGTCGCGCCGTGTGTTCACGGTTCACTACCACCAGATGATCGATCACACACACACTCCCGTGTCCCG TGCTCTATATATATACGCGCACAGCCACAGAAGGCGCCGGGGTTGCGTCGTCCCCTGTTTTGTCGCGTGGACGGCGC GGGATAGAGATGACCGGCCGGAACCCACCCACCGCCACGCGCGGGGGCGGCCGTTTTTGTTCGCTACTTGGGGCGAC ACGTTTCTCGCTTTCTCCCCTTCTCCTGCGCGCGTTTGCACCTTTGCGTTCGTCTCATCTGGCTTCCCCCCGCATGG TAAGCATTCATCCCTATCCCTCCCTCCCAGGATGTGCGATCCGGACAGCTGCCCCCGGTTTCGCTGCACCGGCGCCA TGCGTGCCGCATGCGTGCCAGGGCGTACAAACACATATACATCTTGCCAGTTGCCACCGCACCGGCAGCATCTCTGC ATCAGTTGTTGCGTTGAGCTGGTAAGGGACAAGGCTACCTGCTGATTTAGTTTTCTGGATGTGTGTTGCGTTTGTTC AGATCACCGTGGCACAGGTTTGAGTTCTTGGCACTCCAATCTGCATGCATGATGCGTGCTTGTAGCTGTATCCAAGG AGGAGATAGTGCTGAATAAAGGATTTACAAGGCAGCGAGGGTGTGTATAGTTCACACCAAAATTGAAATTGAAAGTT TAGTTAAAATTGAAACGATGCGACGAAAAAGTTGAAAGTTTGTGTGTGTAAGAAAGTTTTGATGTGAAAGAAAAATT GGAAGTTTGAAGAAAAATTTTGAAACTAAACTCGATCGGCCTGAATGAGAGATTTCACTCCCACACAAGTCAACTGAGAACATCGTCGATGG(SEQ ID NO :1)。在本發(fā)明中，將SEQ ID NO 1所示的啟動子序列稱為啟動子BgIosP514，或簡稱為 P 514啟動子。帶有該啟動子和β -葡萄糖苷酸酶(β _g lUctoonidase，⑶S)基因的水稻愈傷組 織經(jīng)GUS染色后，所述水稻愈傷組織變?yōu)樗{色。帶有該啟動子和GUS基因的水稻和煙草小 苗經(jīng)⑶S染色后，水稻和煙草的根、葉均呈現(xiàn)藍色。典型地，“雜交條件”根據(jù)測量雜交時所用條件的“嚴緊性”程度來分類。嚴緊性 程度可以以例如核酸結(jié)合復合物或探針的解鏈溫度(Tm)為依據(jù)。例如，“最大嚴緊性”典 型地發(fā)生在約Tm-5°C (低于探針Tm 5°C )；“高等嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約5_10°C;“中等 嚴緊性”發(fā)生在探針Tm以下約10-20°C ；“低嚴緊性”發(fā)生在Tm以下約20_25°C。作為替 代，或者進一步地，雜交條件可以以雜交的鹽或離子強度條件和/或一或多次的嚴緊性洗 滌為依據(jù)。例如，6XSSC =極低嚴緊性；3XSSC =低至中等嚴緊性；IXSSC =中等嚴緊性； 0. 5XSSC =高等嚴緊性。從功能上說，可以采用最大嚴緊性條件確定與雜交探針嚴緊同一 或近嚴緊同一的核酸序列；而采用高等嚴緊性條件確定與該探針有約80%或更多序列同 一性的核酸序列。對于要求高選擇性的應用，典型地期望采用相對嚴緊的條件來形成雜交體，例如， 選擇相對低的鹽和/或高溫度條件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，實驗 室手冊，ColdSpring HarborPress,Plainview,N. Y.)提供了包括中等嚴緊性和高等嚴緊性 在內(nèi)的雜交條件。為便于說明，用于檢測本發(fā)明的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴緊 條件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液預洗；在 50_65°C下在 5XSSC 中 雜交過夜；隨后用含0. 1% SDS的2X、0. 5X和0.2XSSC在65°C下各洗滌兩次20分鐘。 本領(lǐng)域技術(shù)人員應當理解，能容易地操作雜交嚴緊性，如改變雜交溶液的含鹽量和/或雜 交溫度。例如，在另一個實施方案中，合適的高度嚴緊雜交條件包括上述條件，不同之處在 于雜交溫度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本發(fā)明中，所述在高等嚴緊條件下與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列雜交的核 苷酸序列，其具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行一個或多個堿基的取代、 缺失、添加修飾的核苷酸序列，是指分別或同時在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列內(nèi)部進行例如不超過2-45個，或者不超過2-30個，或者不超過3-20個，或者不超 過4-15個，或者不超過5-10個，或者不超過6-8個的分別用逐個連續(xù)整數(shù)表示的堿基的取 代、缺失、添加修飾。在本發(fā)明中，所述對SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列進行如上述一個或多個堿基 的取代、缺失、添加修飾的核苷酸序列具有與SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的 啟動子活性。通過一種多核苷酸進行說明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQID NO 1的參考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ IDNO 1的參考核苷酸序列之每100個核 苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達5個核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷 酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%相同的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核 苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄校渲胁迦氲暮塑账峥啥噙_參考序列之總核苷酸的5% ；或在一些核苷 酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達參考序列之總核苷酸的5%。參考 序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在這些末端位置之間的 任意地方，它們或單獨散在于參考序列的核苷酸中，或以一個或多個鄰近的組存在于參考 序列中。在本發(fā)明中，用于確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文獻中所述或者默認參數(shù)，BLAST 和BLAST 2.0可以用于確定本發(fā)明的核苷酸序列同一性百分數(shù)。執(zhí)行BLAST分析的軟件可 以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括與SEQ ID NO :1所公開序列基本同一的多核苷酸序列，例如當采用本 文所述方法(例如采用標準參數(shù)的BLAST分析)時，與本發(fā)明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、優(yōu)選至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本發(fā)明中，所述與SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的啟動子活性。在本發(fā)明中，所述的啟動子來源于單子葉植物，具體地，所述單子葉植物為水稻， 例如所述水禾S為曰本晴(Oryza sativaL. ssp. japonica cv. Nipponbare)。本發(fā)明的另一方面涉及一種核酸構(gòu)建體，其包含本發(fā)明所述的啟動子，與啟動子 可操作連接的基因序列，其中所述啟動子與所述基因序列來源相同或者不同。在本發(fā)明的 一個實施方案中，所述基因為GUS基因。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體，其特征在于，所述載體含有本發(fā)明所述的核苷 酸序列或核酸構(gòu)建體，所述載體可以通過例如將上述核苷酸序列或核酸構(gòu)建體插入克隆載 體或表達載體而得到，或者可以通過人工合成得到。在本發(fā)明的實施方案中，所述載體為本發(fā)明的啟動子或啟動子與GUS基因可操作 連接的核酸構(gòu)建體與PMD18-T或p8質(zhì)粒經(jīng)重組得到的重組載體pMD18-T+P514或p8+P514。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組載體的克隆載體包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T SimpleVecter、pMD19_T Simple Vecter 等。適于構(gòu)建本發(fā)明所述的表達載體包括但不限于，例如pBI 121、pl3W4、pGEM等。本發(fā)明的另一方面涉及一種含有本發(fā)明所述載體的重組細胞，所述重組細胞可以 通過將含有本發(fā)明所述的載體轉(zhuǎn)化至宿主細胞而得到。適于構(gòu)建本發(fā)明所述重組細胞的宿主細胞包括但不限于，例如根癌農(nóng)桿菌細胞 LBA4404、EHA105、GV 3101 等。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述重組細胞為重組農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105-P514o本發(fā)明的還一方面涉及一種植物愈傷組織或外植體，其特征在于，所述愈傷組織 或外植體轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的核苷酸序列和/或核酸構(gòu)建體和/或載體和/或感染有本發(fā)明的重組細胞。外植體可以為植物的胚、胚乳、子葉、幼苗、莖尖、根、莖、葉等，在本發(fā)明的一個實 施方案中，為煙草的葉。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述愈傷組織為水稻愈傷組織。本發(fā)明的還一方面涉及一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化有本 發(fā)明的核苷酸序列和/或核酸構(gòu)建體和/或載體和/或感染本發(fā)明的重組細胞。本發(fā)明的還一方面涉及用于擴增本發(fā)明所述啟動子的引物對，其特征在于 所述引物對的兩條引物分別含有序列TTAACACTAGTTTGTATATATGG (SEQ ID NO 2)和 CCATCGACGATGTTCTCAGT(SEQ ID NO 3)；優(yōu)選的，所述引物對的兩條引物在5，端還分別連接 有限制性酶切位點和/或保護堿基。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述引物對的兩條引物 分別具有^^ ID NO :4禾Π Seq ID NO :5所示的序列。本發(fā)明的還一方面涉及制備SEQ I D NO :1所示的啟動子的方法，包括以水稻日本 晴基因組DNA為模板，使用一對擴增引物進行擴增，所述擴增引物根據(jù)SEQ ID Ν0:1在水稻 日本晴gDNA中的序列分別針對首尾進行設(shè)計，例如為本發(fā)明所述的引物對。本發(fā)明的還一方面涉及一種調(diào)控植物中目的基因表達的方法，所述方法包括將本 發(fā)明的核苷酸序列和/或核酸構(gòu)建體和/或載體轉(zhuǎn)化入植物愈傷組織或外植體中的步驟， 或用本發(fā)明的重組細胞感染植物愈傷組織或外植體的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述目的基因為⑶S基因。在本發(fā)明的一個實施方案中，將含有重組載體P8+P514的重組細胞EHA105-P514 轉(zhuǎn)化入水稻愈傷組織中，水稻愈傷組織分化為水稻苗，愈傷組織和水稻苗經(jīng)⑶S染色均證 明⑶S基因已表達。在本發(fā)明的另一個實施方案中，將含有重組載體p8+P514的重組細胞 EHA105-P514轉(zhuǎn)化入煙草葉中，煙草葉經(jīng)組織培養(yǎng)發(fā)育為煙草苗，煙草苗經(jīng)⑶S染色證明 ⑶S基因已表達。為實現(xiàn)上述調(diào)控目的基因表達的目的，本發(fā)明所述啟動子可以以單拷貝和/或多 拷貝的形式應用，也可以與現(xiàn)有技術(shù)中已知的啟動子聯(lián)用。在本發(fā)明中，可采用植物基因轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因插入到植物基因組中，包括農(nóng) 桿菌介導轉(zhuǎn)化、病毒介導的轉(zhuǎn)化、顯微注射、粒子轟擊、基因槍轉(zhuǎn)化和電穿孔等。本領(lǐng)域周 知，農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)化常被用于單子葉植物和雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)化，但其它轉(zhuǎn)化技 術(shù)也可用于本發(fā)明所述單子葉植物的基因轉(zhuǎn)化。當然，適于本發(fā)明的轉(zhuǎn)化單子葉植物的另 一種方法是粒子轟擊(顯微金或鎢粒子包覆轉(zhuǎn)化的DNA)胚性愈傷組織或胚胎開發(fā)。另外， 還可以采用的轉(zhuǎn)化單子葉植物的方法是原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化?；蜣D(zhuǎn)化后，采用通用的方法來篩 選和再生整合有表達單元的植株。本發(fā)明的還一方面涉及一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括在有效產(chǎn)生植物的條件 下培養(yǎng)本發(fā)明的重組細胞或植物愈傷組織或植物外植體。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的核苷酸序列和/或核酸構(gòu)建體和/或載體和/或 重組細胞用于調(diào)控植物目的基因表達的用途，以及用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的 用途。在本發(fā)明的一個實施方案中，目的基因為GUS基因。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的愈傷組織或外植體用于制備轉(zhuǎn)基因植物或用于植物育種的用途。在本發(fā)明中，所述植物優(yōu)選是單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物優(yōu)選為 稻屬植物，例如水稻或旱稻，所述雙子葉植物優(yōu)選為煙草屬植物，例如煙草或花煙草。所述單子葉植物包括但不限于水稻、谷子、小麥、高粱、玉米，優(yōu)選為水稻，所述水 稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、臺北309、丹江8號、云稻2號、汕優(yōu)63、汕優(yōu)608、 豐優(yōu)22，黔優(yōu)88,11優(yōu)416,11優(yōu)107,11優(yōu)128,11優(yōu)718、準兩優(yōu)527、川農(nóng)1號、雜0152、 皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻 193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101(上 述水稻品種均可購自安徽徽商農(nóng)家福有限公司)。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述水稻為 日本晴。所述雙子葉植物包括但不限于煙草、大豆，馬鈴薯、蠶豆、蘿卜、花生，優(yōu)選為煙草， 所述煙草包括但不限于K326、K346, K394、NC82、NC89、G140、G28、G80以及中煙90，在本發(fā) 明的一個實施方案中，所述煙草為煙草NC89。水稻或煙草是典型的基因工程模式植物，本發(fā)明選擇水稻或煙草進行轉(zhuǎn)基因研 究，以證明本發(fā)明的啟動子在單子葉植物或雙子葉植物中的效果。實驗結(jié)果表明，該啟動子 能在轉(zhuǎn)基因水稻或煙草中起作用。發(fā)明的有益效果發(fā)明人通過生物信息學研究獲得，并采用生物學實驗驗證了所述啟動子P514的 功能。啟動子P514可以用于調(diào)控單子葉植物或雙子葉植物目基因的表達，具體地，所述啟 動子能夠在水稻和煙草中調(diào)控GUS基因表達。本發(fā)明為研究單子葉植物或雙子葉植物基因 表達提供了新的工具和選擇。關(guān)于牛物材料保藏的說明本發(fā)明涉及以下生物材料煙草NC89種子2010年11月12日保藏于湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學保 藏中心，即中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號CCTCC No :P201017。


圖 lpCAMBIA-1301 質(zhì)粒示意圖。圖2p8質(zhì)粒示意圖。圖3經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織的⑶S染色結(jié)果。其中，轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌 P8+P514轉(zhuǎn)化的水稻愈傷組織(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍色；轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì) 粒的水稻愈傷組織(對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖4經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻苗的根的⑶S染色結(jié)果。其中，轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌P8+P514 的水稻苗的根(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍色；轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻苗的根 (對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖5經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻苗的葉的⑶S染色結(jié)果。其中，轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌P8+P514 的水稻苗的葉(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍色；轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的水稻苗的葉 (對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。圖6經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草苗的根的⑶S染色結(jié)果。其中，轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌P8+P514的煙草苗的根(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍色；轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的煙草苗的根 (對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。 圖7經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草苗的葉的⑶S染色結(jié)果。其中，轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌P8+P514 的煙草苗的葉(右)經(jīng)GUS染色后呈現(xiàn)藍色；轉(zhuǎn)化有重組根癌農(nóng)桿菌p8質(zhì)粒的煙草苗的葉 (對照，左)經(jīng)⑶S染色后顏色未發(fā)生變化。
具體實施例方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為 可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。其中N6D培養(yǎng)基、YM液體培養(yǎng)基、YM固體培養(yǎng)基、AAM培 養(yǎng)基和N6-AS共培養(yǎng)基的配制方法參見發(fā)明申請“一種啟動子BgIosP587、其制備方法及用 途”，申請?zhí)?200910238992. 0，
發(fā)明者倪雪梅, 孫紅正, 張耕耘, 李寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司