專利名稱：一株植物乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株植物乳桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳酸菌細(xì)菌素(Bacteriocins of LAB)是指乳酸菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成 的一類具有抗菌活性的多肽或蛋白質(zhì)類物質(zhì)。它們通?？梢砸种埔恍┏Ｒ?jiàn)的腐敗菌和致病 菌，如金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等。而且大部 分乳酸菌細(xì)菌素穩(wěn)定性較好，可與食品一起加熱使用，而且易被人體中的蛋白酶降解，不會(huì) 在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加 劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株的產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌及其應(yīng)用，該菌株生產(chǎn)的細(xì)菌 素抑制常見(jiàn)的G+和G—腐敗菌和病原菌。本發(fā)明提供的植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5，其在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No . 4200。上述植物乳桿菌是以一些最常見(jiàn)的G+和G_腐敗菌和病原菌為指示菌，篩選出產(chǎn)廣 譜細(xì)菌素的植物乳桿菌菌株，已于2010年09月30日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院，中國(guó)科學(xué)院微生 物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No . 4200。本發(fā)明提供的應(yīng)用，即植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) QZ-5CGMCC No . 4200在抑制細(xì)菌中的應(yīng)用，以及植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5CGMCC Ns .4200在生產(chǎn)細(xì)菌素中的應(yīng)用。所述細(xì)菌為上述所述G+和G—腐敗菌和病原菌，具體可為藤黃微球菌 (Micrococcusluteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella enterica)、銅綠假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌(Escherichiacoli)，優(yōu)選為藤黃微球菌(Micrococcus luteus)28001、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 26003、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 63501、沙門氏菌(Salmonella enterica) 50094、銅綠假單孢桿菌(Pseudomonas aeruginosa) 10104、大腸桿菌(Escherichia coli) 30105。本發(fā)明的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5可以產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和 腐敗菌具有抑制作用的細(xì)菌素，該細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感，具有很好的熱穩(wěn)定性，在121°C 作用30min仍然保持較高活性，該細(xì)菌素在pH2. 0-8. 0范圍內(nèi)處理30min后，回調(diào)到pH6. 0 后，均保持很強(qiáng)的抑制指示菌藤黃微球菌(Micrococcus luteus) 28001的能力。并且該細(xì)菌 素具有抑菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)?？梢詰?yīng)用為具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑。


圖1為細(xì)菌素對(duì)酶的敏感性檢測(cè)結(jié)果；圖2為細(xì)菌素提取條件對(duì)其活性的影響；圖3為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) QZ-5產(chǎn)細(xì)菌素對(duì)藤黃微球菌生長(zhǎng) 曲線的影響
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5 的獲得一、植物桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ—5 的獲得菌種來(lái)源分離自西藏的青貯飼料。本發(fā)明以一些最常見(jiàn)的G+和G—腐敗菌和病 原菌為指示菌，篩選出產(chǎn)廣譜細(xì)菌素的乳酸菌菌株，具體方法為在無(wú)菌條件下，取乳制品 材料5g，加入到45mL無(wú)菌蒸餾水中，充分震蕩5min，以10倍系列稀釋，從10—1 10_7梯度， 選合適的梯度，取100 yL分別涂布于含有MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，30°C靜置培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。其 中，含MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)皿為厭氧培養(yǎng)48h，厭氧培養(yǎng)設(shè)備采用三菱株式化學(xué)社出品的厭氧包 與厭氧培養(yǎng)盒。從含MRS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中挑取單菌落，劃線純化2次，并進(jìn)行革蘭氏染色 試驗(yàn)，鏡檢。利用牛津杯雙層平板法含1. 5%瓊脂的指示菌培養(yǎng)基冷卻至50°C左右，按每 平皿15mL傾倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，超凈工作臺(tái)中冷卻；制備含0. 8%瓊脂的指示菌培養(yǎng)基，冷 卻至50°C左右，按1 %的接種量加入指示菌菌懸液作為上層培養(yǎng)基，傾倒5mL上層培養(yǎng)基于 含1. 5%瓊脂培養(yǎng)基的平板中冷卻，然后用無(wú)菌鑷子將牛津杯輕輕放置于平板上，將無(wú)細(xì)胞 發(fā)酵上清液加入牛津杯中于超凈工作臺(tái)上擴(kuò)散5h，置于適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后觀察 抑菌圈的出現(xiàn)，選取牛津杯周圍有明顯抑菌圈的菌株做復(fù)篩。結(jié)果獲得一株廣泛抑制指示 菌的菌株，命名為QZ-5。二、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5 的鑒定QZ-5菌株生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，碳源發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表2所示；16SrRNA 基因序列如序列表中序列1所示。根據(jù)細(xì)胞顯微形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)和16S rRNA基因序列 數(shù)據(jù)，將QZ-5菌株鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)，并于2010年09月30 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝 陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院QZ-5，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No . 4200。表1、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果
革細(xì)發(fā)生長(zhǎng)溫度(°c)生長(zhǎng)pH值NaCl 濃葡過(guò)胞酵度(％)萄氧氏形類糖化染態(tài)型101545503.03.54.04.55.09.510.03.06.5產(chǎn)氫色氣酶QZ-5+桿 狀同 型+++w十++++++++一一注+代表反應(yīng)為陽(yáng)性；-代表反應(yīng)為陰性；w代表反應(yīng)為弱陽(yáng)性表2.碳源發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果
編號(hào)碳源QZ-50對(duì)照1Glycerol甘油一2Erythritol赤癬醇—3D- ArabinoseD-阿摶伯糖4L- ArabinoseL-阿拉伯糖5Ribose核糖■6D xyloseD-木糖一7L xyloseL-木糖一8Adonitol阿東醇9[3-Methyl -XylosideP-甲基-D-木糖甙10Galactose-T-乳糖■11Glucose葡萄糖+12Fructose果糖+13MannosE甘露糖+14SorbosE山梨糖15Rhamnose鼠李糖一16Dulcitol衛(wèi)茅醇一17Inositol肌醇18Mannitol11露醇 19Sorbitol山梨醇+20a-Methyl-D Mannosidea-甲基-D-甘露糖甙+21a-Methyl-D Glucosidea-甲基-D-葡萄糖甙22N-Acetyl GlucosamineN-乙酰-葡糖胺■23Amygdalin苦杏仁甙+24Arbutin熊果甙+25Esculin七葉靈+26Salicin柳醇+27Cellobiose纖維二糖+28Maltose麥芽糖+29Lactose乳糖+30Melibiose蜜二糖+31Sucrose蔗糖+32Trehalose海藻糖+33nu1in菊糖一34Melezitose松二糖+35Raffinose棉子糖+36Starch淀粉一37Glycogen糖原一38Xylitol木糖醇—39Gentiobiose攏牛兒糖+40D-TuranoseD-松二糖一41D-LyxoseD-來(lái)蘇糖一42D-TagatoseD-塔塔糖一43D-FucoseD-巖糖一44L-FucoseL-巖糖一45D-ArabitoLD-阿拉伯糖醇w46L-ArabitoLL-阿拉伯糖醇—47Gluconate葡萄糖酸鹽W482-Ceto- Gluconate2-酮基-葡萄糖酸鹽--―495-Ceto- Gluconate5-酮S-葡萄糖酸鹽一注+代表及應(yīng)為陽(yáng)性；-代表反應(yīng)為陰性；w代表反應(yīng)為弱陽(yáng)性實(shí)施例2、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5抑菌效果鑒定從實(shí)施例1看出本發(fā)明的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) QZ-5對(duì)一些 最常見(jiàn)的G+和G—腐敗菌和病原菌具有抑菌性，因此推測(cè)該菌株可以分泌細(xì)菌素，通過(guò)以下 方法對(duì)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)QZ-5的抑菌效果和其分泌的細(xì)菌素進(jìn)行鑒 定?！⑴懦蛩馗蓴_1、排除酸的干擾抑制病原菌的試驗(yàn)方法為牛津杯雙層平板法含1. 5%瓊脂的指示菌培養(yǎng)基NA培 養(yǎng)基(用于藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢桿菌、短小芽孢桿菌、 沙門氏菌的培養(yǎng))牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂15g，蒸餾水1. 0L，pH7. 0 7. 2。 LB培養(yǎng)基(用于大腸桿菌的培養(yǎng))蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1.0L， pH7.0。PDA培養(yǎng)基(用于白色念珠菌)馬鈴薯浸出粉4.0g，葡萄糖20g，瓊脂15g，蒸餾水 1. 0L，pH5. 6。冷卻至50°C左右，按每平皿15mL傾倒在無(wú)菌培養(yǎng)皿中，超凈工作臺(tái)中冷卻； 制備含0.8%瓊脂的指示菌培養(yǎng)基(同上)，冷卻至50°C左右，按(體積百分含量)的 接種量加入指示菌(表2所示)菌懸液(用接種環(huán)挑取活化的指示菌一環(huán)接種于該菌適合 的培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)24h。并調(diào)整菌液濃度為107cfu/mL，4°C冰箱保存?zhèn)溆?混勻作 為上層培養(yǎng)基，傾倒5mL上層培養(yǎng)基于上述制備的含1. 5%瓊脂培養(yǎng)基的平板中冷卻，然后 用無(wú)菌鑷子將牛津杯輕輕放置于平板上，將上述待測(cè)液加入牛津杯中于超凈工作臺(tái)上擴(kuò)散 5h，置于適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈。用鹽酸和乳酸分別調(diào)蒸餾水和MRS液體培養(yǎng)基的pH值為pH3. 0,4. 0,5. 0,6. 0， 為對(duì)照PH值，利用牛津杯雙層平板法，對(duì)上述各種pH值的蒸餾水和MRS液體培養(yǎng)基做抑菌試驗(yàn)。用乳酸和鹽酸分別調(diào)蒸餾水和MRS液體培養(yǎng)基的pH值，結(jié)果表明不同pH值 對(duì)6種指示菌的抑菌效果不同。用乳酸和鹽酸調(diào)蒸餾水pH值在3. 0 6. 0對(duì)指示菌都 沒(méi)有抑菌效果；乳酸和鹽酸調(diào)MRS液體培養(yǎng)基在pH3. 0下都有抑菌效果，pH4. 0對(duì)大腸桿 菌(Escherichia coli) 30105、藤黃微球菌(Micrococcus luteus) 28001、銅綠假單孢桿 菌(Pseudomonasaeruginosa) 10104 者β有效果，而對(duì)金Hfe葡萄 求菌(Staphylococcus aureus) 26003、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is) 63501 和沙門氏菌(Salmonella enterica) 50094沒(méi)有抑菌效果，pH5. 0對(duì)藤黃微球菌和銅綠假單孢桿菌抑制作用較小，對(duì) 其它四種指示菌無(wú)抑制作用，而PH6. 0對(duì)六種指示菌都沒(méi)有抑菌效果，選擇pH6. 0作為對(duì)照 pH。挑取MRS培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) QZ-5, 接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24h，12000rpm，4°C離心15min后，測(cè)上清液的pH 值，并用lmol/L NaOH (已滅菌)和lmol/L HCl調(diào)離心發(fā)酵上清液至上述確定的對(duì)照pH值 6. 0，按照上述牛津杯雙層平板法做抑菌試驗(yàn)。MRS液體培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基可購(gòu)自上海滬峰生物科技有限公司，貨號(hào)為HB0384， 其配方為每升由蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸 銨2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，吐溫801 mL,瓊脂15g，蒸餾水1. OL組成， pH6. 5。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5不 僅對(duì)藤黃微球菌(Micrococcus luteus) 28001、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 26003、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 63501、沙門氏菌(Salmonella enterica)50094> M fx 單 包桿菌(Pseudomonas aeruginosa)10104> 大腸桿菌 (Escherichia coli) 30105有明顯的抑制作用，該抑制作用不受pH的影響。所用指示菌如 表3所示，所有指示菌均購(gòu)于河南省食品藥品檢驗(yàn)所。表3.排除酸抑制作用的試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ 5，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC №.4200。
2.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)QZ-5CGMCC Ns . 4200 在抑制細(xì)菌中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)菌為藤黃微球菌、金黃色葡萄球 菌、枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、銅綠假單孢桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述細(xì)菌為藤黃微球菌28001、金黃色葡 萄球菌26003、枯草芽孢桿菌63501、短小芽孢桿菌63202、銅綠假單孢桿菌10104、沙門氏菌 50094和大腸桿菌30105。
5.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)QZ-5 CGMCC Ns . 4200 在生產(chǎn)細(xì)菌素中的 應(yīng)用。
6.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)QZ-5 CGMCC Ns . 4200 在制備食品或飼料 防腐劑中的應(yīng)用。
7.培養(yǎng)植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) QZ-5 CGMCC Ns . 4200 的培養(yǎng)基，由葡 萄糖3 %，胰蛋白胨1. 5 %，蛋白胨1. 5 %，酵母膏1 %，硫酸鎂0. 058 %，吐溫800.2%和水組 成，其中百分含量為質(zhì)量百分含量。
8.植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)QZ-5 CGMCC Ns . 4200 在制備細(xì)菌抑制劑 中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株植物乳桿菌及其應(yīng)用。該植物乳桿菌為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)QZ-5，其在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC №.4200。植物乳桿菌QZ-5可以產(chǎn)生對(duì)多種病原菌和腐敗菌具有抑制作用的細(xì)菌素，并且該細(xì)菌素具有很好的熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性，并且對(duì)蛋白酶的敏感，抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)?？梢詰?yīng)用為具有廣闊應(yīng)用前景的天然食品防腐劑和飼料添加劑。
文檔編號(hào)A23K1/16GK101974467SQ201010527149
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者常勝合, 龐會(huì)利, 李宗偉, 楊飛飛, 焦湞, 王雁萍, 秦廣雍, 蔡義民, 談重芳 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)