專利名稱：具有改良生長特性的植物及其制備方法
具有改良生長特性的植物及其制備方法本申請(qǐng)為2005年5月30日提交的、發(fā)明名稱為“具有改良生長特性的植物及其制 備方法”的PCT申請(qǐng)PCT/EP2005/052465的分案申請(qǐng)，所述PCT申請(qǐng)進(jìn)入中國國家階段的日 期為2007年1月26日，申請(qǐng)?zhí)枮?00580025230. 2。本發(fā)明涉及用于改良植物生長特性的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過增加植物 莖干組織中E2F 二聚化配偶體(DP)編碼基因的表達(dá)和/或通過增加植物莖干組織中DP蛋 白質(zhì)的活性來改良植物生長特性的方法。本發(fā)明還涉及在莖干優(yōu)選的控制元件控制下的DP 編碼基因轉(zhuǎn)化的植物，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，該植物具有改良的生長特性。由于世界人口的持續(xù)增加，提高農(nóng)業(yè)效率一直是研究的主要目標(biāo)。農(nóng)作物和園藝 改良的常規(guī)手段利用選育技術(shù)來鑒定具有期望特性的植物。然而，這種選育技術(shù)具有若干 缺點(diǎn)，即這些技術(shù)一般是勞動(dòng)密集型的，而且產(chǎn)生通常含有異質(zhì)遺傳組分的植物，這并非總 是產(chǎn)生自親本植物傳遞過來的期望性狀。相反，分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)使人們能夠更精確 地操作植物的種質(zhì)。植物的基因工程需要分離和操作遺傳物質(zhì)(通常以DNA或RNA的形 式)和繼之將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入植物。這類技術(shù)導(dǎo)致具有多種改良的經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)藝學(xué)或園藝性 狀的植物的開發(fā)。具體的目標(biāo)經(jīng)濟(jì)性狀包括高的產(chǎn)量和生物量。改良一種或多種植物生長特性的能力將在農(nóng)作物改良、植物育種、觀賞植物的生 產(chǎn)、樹木栽培、園藝、林學(xué)以及在藻類或植物的生產(chǎn)領(lǐng)域具有多種應(yīng)用(用作生物反應(yīng)器， 例如用于藥物如抗體或疫苗的生產(chǎn)，或用于有機(jī)廢物的生物轉(zhuǎn)化，或在高產(chǎn)的藻類和植物 的實(shí)例中用作燃料)。相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，已發(fā)現(xiàn)在植物莖干組織中，DP編碼基因表達(dá)的增加和 /或DB蛋白質(zhì)活性的增加使植物具有改良的生長特性。DP蛋白質(zhì)是廣泛保守的蛋白質(zhì)并且涉及細(xì)胞周期的控制(Gutierrez等人(2002) Current Opinion in Plant Biology 5:480-486)。DP 因子與 E2F 因子一起作用，形成能 夠起始S期特異基因轉(zhuǎn)錄的異二聚體。Magyar等人，2000 (FEBS letters, 486 :79_97)報(bào)道 T E2F因子、DP因子和E2F-DP樣(DEL)因子的鑒別?；谛蛄斜容^，如Vandepoele等人， 2002 (Plant Celll4(4) :903_16，在此處完整引入作為參考)所述，將編碼這些蛋白質(zhì)的擬 南芥屬(Arabidopsis)基因劃分為不同的種類。此外，由Magyar等人報(bào)道(在此處也完整 引入作為參考)了典型DP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性。例如，Magyar等人的圖3A和B顯示在擬南 芥DP蛋白質(zhì)中特征性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的位置。Vand印oele等人的圖5很 好地說明由于存在一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域，DP蛋白質(zhì)與相關(guān)的蛋白質(zhì)， 如E2F因子和DEL不相同。以Pioneer Hi-Bred之名公布的國際專利申請(qǐng)W000/47614表明使用組織特異性 或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子控制DP表達(dá)提供不同的生長特性。具體而言，其表明(i)使用種子特 異性啟動(dòng)子將刺激細(xì)胞分裂速率，產(chǎn)生增加的種子生物量；(ii)使用強(qiáng)表達(dá)的早期雄花穗 特異性啟動(dòng)子將增加這一完整生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育；和(iii)使用根特異性啟動(dòng)子將產(chǎn)生更大 的根和更快的生長(即更多的生物量積累)。然而，在該申請(qǐng)中沒有產(chǎn)生或例證具有這類不 同生長特性的植物。
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后來以Consejo Superior De Investigaciones Cientificas為名申請(qǐng)的國際專 利申請(qǐng)W001/21644僅表明可以通過重組DP的表達(dá)控制植物生長，而沒有例證。盡管陳述 “特別有用的是使用組織特異性啟動(dòng)子或化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制表達(dá)的核酸”，沒有提到或 例證使用這類核酸轉(zhuǎn)化并且具有改良生長特性的植物的應(yīng)用。盡管存在上述啟示，使用現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)還沒有產(chǎn)生改良的轉(zhuǎn)基因植物，其說明 如現(xiàn)有技術(shù)所啟示的，使用DP在改良植物生長特性中是無效的。出人意料地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過增加植物莖干組織中DP蛋白質(zhì)的活性和/或通過 增加DP編碼基因在植物莖干組織中的表達(dá)來改良植物生長特性。本發(fā)明提供相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，用于改良植物生長特性的方法，其包括特 別在植物莖干組織中增加DP蛋白質(zhì)或其同源物活性和/或在植物莖干組織中增加DP編碼 基因或其功能變體的表達(dá)。有利地，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，本發(fā)明方法的操作使植物具有多種改良的生 長特性，特別是增加的生物量。所述改良的生長特性可以是穩(wěn)定的并且可以遺傳至下一代。術(shù)語“生長特性”在下文詳述的關(guān)于生長的其他特性中包括增加的生物量。術(shù)語“生物量”指產(chǎn)生的生物物質(zhì)的量。生物量的增加可以是在相對(duì)于對(duì)應(yīng)的參考 植物的生物量(例如相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物的生物量)的植物的一個(gè)或多個(gè)部分。本發(fā) 明植物的特征在于增加的地上生物量，其對(duì)于農(nóng)作物植物的營養(yǎng)組織生長特別重要。例如， 對(duì)于青貯飼料玉米，典型的經(jīng)濟(jì)價(jià)值參數(shù)是地上生物量和葉的能量含量；對(duì)于樹和甘蔗，典 型的經(jīng)濟(jì)價(jià)值參數(shù)是莖的地上生物量。本文所用的術(shù)語“增加的生物量”還可以包括增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量。本文所定義的術(shù)語“增加的產(chǎn)率”意指相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，在如下的一個(gè)或 多個(gè)方面的增加(i)植物一個(gè)或多個(gè)部分增加的生物量(重量)，特別是地上(可收獲) 部分，增加的根生物量或增加的任何其他可收獲部分的生物量，( )增加的種子產(chǎn)率，其可 能源于增加的種子生物量(粒重)，可以是每株植物粒重的增加或單個(gè)種子基礎(chǔ)上的增加， 并且所述粒重的增加可以是因改變的種子大小所致，如種子長度和/或種子寬度和/或種 子面積；(iii)增加的(飽滿)種子數(shù)；(iv)增加的種子大小，其還可以影響種子的組成； (ν)增加的種子體積，這也可能影響種子的組成；(Vi)增加的收獲指數(shù)，其可以表達(dá)為可收 獲部分如種子的產(chǎn)量占總生物量的比率；和(Vii)增加的千籽粒重(TKW)，其是從所計(jì)的飽 滿種子數(shù)和它們的總重量推斷的。增加的TKW可能源于增加的種子大小和/或粒重。以玉米為例，產(chǎn)量增加可以表現(xiàn)為以下一個(gè)或多個(gè)方面每公頃或每英畝植物數(shù) 的增力口、每株植物穗的增力口、畦數(shù)、每畦種子數(shù)、粒重、千籽粒重、穗長度/直徑的增加。以稻 為例，產(chǎn)量的增加可以表現(xiàn)在下列的一個(gè)或多個(gè)方面的增加每公頃或每英畝的植物數(shù)、每 株植物圓錐花序數(shù)、每個(gè)圓錐花序的小穗數(shù)、每個(gè)圓錐花序的花數(shù)、種子飽滿率的增加、千 籽粒重的增加等等。產(chǎn)量的增加還可以產(chǎn)生改變的構(gòu)造或可以作為改變的構(gòu)造的結(jié)果發(fā) 生。因?yàn)楸景l(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物具有增加的產(chǎn)率，相對(duì)于處于其生活周期的相應(yīng)階段的 對(duì)應(yīng)野生型植物的生長速率而言，這些植物很可能顯示出增加的生長速率(在它們至少部 分的生活周期期間)。增加的生長速率可以是植物的一個(gè)或多個(gè)部分(包括種子)特異性的，或可以基本存在于整個(gè)植物中。具有增加的生長速率的植物甚至可以呈現(xiàn)提早開花。生 長速率的增加可以發(fā)生在植物生命周期的一個(gè)或多個(gè)階段或基本在整個(gè)植物生命周期中。 在植物生命周期中早期增加的生長速率可以反映增強(qiáng)的活力。生長速率的增加可以改變植 物的收獲周期，使得植物能夠比可能的情形更晚播種和/或更早收獲。如果生長速率充分 增加，可能允許播種相同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類植物，接著播種和收 獲更多的稻類植物，所有這些都在一個(gè)常規(guī)的生長期內(nèi))。類似地，如果生長速率充分增加， 可能允許播種不同植物物種的更多種子(例如播種和收獲稻類植物，接著，例如，播種和任 選地收獲大豆、馬鈴薯或任何其它合適的植物)。在一些植物的情形下從同一根莖收獲增加 的次數(shù)也是可能的。改變植物的收獲周期可能導(dǎo)致每英畝年生物量產(chǎn)量的增加(由于(比 方說在一年里)任何特定植物生長和收獲的次數(shù)增加)。與野生型相似物相比，生長速率 的增加還可以使能夠在更廣闊的地域栽培轉(zhuǎn)基因植物，因?yàn)榉N植作物的地域限制通常由種 植時(shí)(早季)或收獲時(shí)(晚季)不利的環(huán)境條件所決定的。如果縮短收獲周期，可以避免 這類不利條件?？梢酝ㄟ^生長實(shí)驗(yàn)測繪生長曲線得到多個(gè)參數(shù)來確定生長速率，這類參數(shù) 可以是=T-Mid(植株達(dá)到其最大大小的50%所需的時(shí)間)和T-90(植物達(dá)到其最大大小的 90%所需的時(shí)間)等等。本文所用的術(shù)語“生長特性”還包括植物構(gòu)造。本發(fā)明的植物呈現(xiàn)改變的構(gòu)造，其 為由于增加的生物量而表現(xiàn)出的地上部分改變的形狀和尺寸。這一特性對(duì)于多種觀賞植物 是有利的。本文所用的術(shù)語“構(gòu)造”包括植物的外觀或形態(tài)，包括任何一種或多種結(jié)構(gòu)特性 或結(jié)構(gòu)特性的組合，所述結(jié)構(gòu)特性如植物的細(xì)胞、組織、器官或植物的細(xì)胞、組織或器官的 組的形狀、尺寸、數(shù)量、位置、質(zhì)地、排列和模式。特別優(yōu)選的是具有下列任一項(xiàng)或多項(xiàng)的植 物增加的分蘗(或相應(yīng)的植物部分)的數(shù)量、尺寸、形狀；增加的枝條和/或葉的數(shù)量。在植物處于無脅迫條件，或植物相對(duì)于對(duì)照植物暴露于多種脅迫下發(fā)生任何前述 生長特性的改良。植物通常通過更為緩慢地生長來應(yīng)答暴露的脅迫。在嚴(yán)重脅迫的條件中， 植物甚至可以完全停止生長。另一方面，中等脅迫在本文中定義為當(dāng)植物暴露于此而不導(dǎo) 致植物完全停止生長的任何脅迫。由于耕作方法(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)的進(jìn)展，栽培 的農(nóng)作物植物常常不會(huì)遭遇到嚴(yán)重脅迫。因此，中等脅迫誘導(dǎo)的受損的生長經(jīng)常是農(nóng)業(yè)上 的不理想特性。中等脅迫是植物可能接觸的典型脅迫。這些脅迫可以是植物可以被暴露于 其的日常生物的和/或非生物的(環(huán)境的)脅迫。典型的非生物或環(huán)境脅迫包括由反常的 熱或冷/冰凍溫度產(chǎn)生的溫度脅迫；鹽脅迫；水脅迫(干旱或過量的水)。非生物脅迫還可 以由化學(xué)藥品產(chǎn)生。生物脅迫一般是由病原體，如細(xì)菌、病毒、真菌和昆蟲產(chǎn)生的那些脅迫。
在多種植物物種可以有利地修飾上述生長特性。 本文所用得術(shù)語“植物”包括整個(gè)植物、植物和部分植物的祖先和后代，包括種 子、莖干、莖、根(包括塊莖)以及植物細(xì)胞、組織和器官。術(shù)語“植物”還因此包括懸浮 培養(yǎng)物、胚、分生區(qū)、胼胝體組織、葉、種子、根、莖干、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本 發(fā)明的方法中特別有用的植物包括屬于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，特 別是單子葉和雙子葉植物，包括選自如下物種的飼料或飼料豆科植物、觀賞植物、糧食作 物、喬木或灌木金合歡屬物種(Acacia spp.)、槭樹屬物種(Acerspp.)、獼猴桃屬物種 (Actinidia spp.) >^PfWMi^ft (Aesculus spp.) >IfM^JHtE^ (Agathis australis)、 Albizia amara、Alsophila tricolor、須芒草屬物禾中(Andropogon spp.)、落花生屬
6物禾中(Arachis spp·)、模榔(Arecacatechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、 Baikiaea pluri juga、|^7KjS (Betula spp.) λ^^Μ (Brassica spp. )、7^_ (Bruguiera gymnorrhiza) Λ Burkea 已fric^n已、胃錫P (Butea frondosa) Λ Cadaba f&rinos&、^:—^^jS^/ 禾中(Calliandra spp.)、大口十茶(Camellia sinensis) ,^AM (Canna indica)、辣椒屬物 禾中(Capsicum spp·)、決明屬物禾中(Cassia spp·)、距豌豆(Centroema pubescens)、木瓜 屬物禾中(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、 Colophospermum mopane、變異小冠花(Coronillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂 屬物種(Crataegus spp.)、香瓜屬物種(Cucumis spp.)、桕木屬物種(Cupressus spp.)、 Cyathea dealbata、媼梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅 屬 禾中(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、tm W (Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、大葉骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蟥屬物種(Desmodium spp·)、粗糙 蟲豐貝蔽(Dicksonia squarosa)、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、,廉扁豆屬物 禾中(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloa pyramidalis、Ehrartia spp.、 禾參子(Eleusine coracana) Λ IjM ^M^ft (Eragrestis spp.)、束Ij桐屬·禾中(Erythrina spp.)、㈱屬·禾中(Eucalyptus spp.)、Euclea schimperi、Eulalia villosa、胃*屬·禾中 (Fagopyrum spp.)、費(fèi)約果(Feijoa sellowiana)、草莓屬物禾中(Fragaria spp.)、千斤拔 屬物禾中(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪屬物 禾中(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃蔑屬物禾中(Hedysarum spp.)、牛鞭 草(Hemarthia altissima)、扭黃茅(Heteropogon contortus)、大麥(Hordeum vulgare)、 Hyparrhenia rufa、小連翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、白花庭藍(lán) (Indigo incarnata)、胃■屬·禾中(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、古月fe〒屬· 禾中(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、Leucaenaleucocephala、Loudetia simplex、羅屯頁 豆(Lotonus bainesii)、百脈根屬物種(Lotus spp. ) Λ Macrotyloma axillare、蘋果屬物 禾中(Malus spp.) λ Manihot esculenta、紫苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides) Λ(Musa sap i en turn)(Nicotianum spp.)、H
豆屬物禾中(Onobrychis spp.)、Ornithopus spp.、禾S屬物禾中(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬物禾中(Pennisetum spp.)、Persea gratissima、碧冬前屬物禾中 (Petunia spp.)、菜豆屬物禾中(Phaseolus spp.)、模相β 竹(Phoenix canariensis)、 Phormium cookianum、石楠屬物禾中(Photinia spp.)、白云杉(Picea glauca)、松屬 ^ 禾中(Pinus spp.M (Pisum sativum)λ fr H ^ ^r Χ 豐公(Podocarpus totara)、 Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬·禾中(Populus spp.)、ft W (Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西 洋梨(Pyrus communis)、櫟屬物禾中(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、美味棒 花棕(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、荼 薦子屬物種(Ribes spp·)、洋槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇屬物種(Rosa spp·)、懸 鉤子屬物種(Rubus spp.)、柳屬物種(Salix spp. )、Schyzachyrium sanguineum、金松 (Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬物禾中(Spinacia spp·)、Sporobolusfimbriatus> Stiburus alopecuroides> Stylosanthos humilis、^|p茶屬物禾中(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、車軸草屬物種 (Trifolium spp·)、小麥屬物種(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔 屬物種(Vacciniumspp.)、野豌豆屬物種(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、錐穗沃森
(ffatsonia pyramidata)(Zantedeschia aethiopica)(Zeamays) >
洋薊、蘆筍、椰菜、孢子甘藍(lán)、卷心菜、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣綠甘藍(lán)、亞麻、羽衣甘 藍(lán)、小扁豆、油料種子油菜、秋葵、洋蔥、馬鈴薯、稻、大豆、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、番 茄、squash tea、樹、草(包括飼料草)和藻類等。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特性，植物是農(nóng)作物植物，如浮游植物、大豆、向日葵、油菜、油 菜籽、棉花、苜蓿、番茄、土豆、萵苣、煙草、木瓜、南瓜、楊樹、桉樹、松樹、leguminosa、亞麻、 lupinus和高梁。根據(jù)本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施方案，所述植物是單子葉植物，如甘蔗、洋蔥或竹 子。進(jìn)一步優(yōu)選的植物是谷類，如稻、玉米(包括飼料玉米)、小麥、大麥、粟、燕麥和黑麥。術(shù)語“DP”意指E2F 二聚化配偶體。如名稱所示，DP蛋白質(zhì)能夠與E2F/DEL轉(zhuǎn)錄因 子二聚化。這可以通過，例如，如Magyar等人，2000 (FEBSletters，486 :79_97)所述的雙雜 交測定或通過免疫沉淀檢測。Magyar等人報(bào)道了典型的DP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性，其在此處完 整引入作為參考。例如，Magyar等人的圖3A和B顯示在擬南芥DP蛋白質(zhì)中的特征性DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域的位置。Vand印oele等人，2002 (Plant Cell 14(4) 903-16) 的圖5很好地說明由于存在一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域，DP蛋白質(zhì)與相關(guān)的 蛋白質(zhì)，如E2F因子和DEL不相同。圖3顯示在擬南芥(Arabidopsis thaliana)DPb序列 中這些結(jié)構(gòu)域的位置。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于可獲得的知識(shí)將能夠容易地鑒別DP蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的特性，DP蛋白質(zhì)由SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 2的同源物代表 這類同源物的具體實(shí)例包括Magyar等人，2000 (FEBS，486(1) :79_87)所述的擬南芥DP蛋 白質(zhì)、Ramirez-Parra 和 Gutierrrez，2000 (FEBS，86(1) :73_8)所述的普通小麥(Triticum aestivum)DP蛋白質(zhì)和以Du Pont名稱公布的國際專利申請(qǐng)W099/53075中的鳳仙花屬 (Impatiens)、大豆和玉米的DP蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本文所定義的DP蛋白質(zhì)或其同源物指與DP蛋白質(zhì)，例如，與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23中任一個(gè)具有一定的序列同一性的多肽，所述序列同一性按照 增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?40 %、41 %、42 %、43 %、44 %、45 %、46 %、47 %、48 %、49 %、50 %、 51 52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 62%,63%,64%,65%, 66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%, 81 82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%或 99%。如Vand印oele 等人，2002 (Plant Cell 14 (4) :903_16)所示，可以將擬南芥的 DP 蛋白質(zhì)細(xì)分為兩個(gè)不同類別，DPa和DPb。本文所用的術(shù)語“同源物”也包括兩類成員。在 本發(fā)明的方法中可以方便地使用這些不同類別的DP蛋白質(zhì)或其編碼核酸。用于本發(fā)明方法中的DP核酸或DP蛋白質(zhì)優(yōu)選獲自從植物，優(yōu)選來自雙子葉植 物，進(jìn)一步優(yōu)選來自十字花科(Brassicaceae)，更加優(yōu)選地來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。根據(jù)另一實(shí)施方案，DP多肽是DPb多肽?！癉Pb”指相對(duì)于AtDPa更接近于AtDPb 的蛋白質(zhì)?？梢匀缦挛乃鐾ㄟ^計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)，或者通過建立保守基序的存在來
8將查詢序列分類為DPa或是DPb。鑒別查詢序列為DPa或DPb的另一方法是將查詢序列導(dǎo) 入系統(tǒng)樹，如在圖5所示的那個(gè)。相對(duì)于AtDPa，DPb蛋白質(zhì)應(yīng)該聚類更接近于AtDPb。用于本發(fā)明方法中優(yōu)選的DP多肽或同源物是與DP蛋白質(zhì)，例如，與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的DP蛋白質(zhì)中任一個(gè)具有一定序列同一性的那些，所述 序列同一性按照增加的優(yōu)選順序?yàn)橹辽?0%A1%A2%A3%A4%A5%A6%A7%, 48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%, 78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。可以經(jīng)由一般存在于所有DP蛋白質(zhì)中的保守 區(qū)計(jì)算百分?jǐn)?shù)同一性。這一區(qū)域從殘基CEKVES (如從SEQ ID N02的位置111)附近開始至 FVLKTM(如，到SEQ ID NO 2的位置290)附近；見圖3。在DP蛋白質(zhì)亞類中有三個(gè)基序是特別保守的，所述亞類包括擬南芥的DPb。在 這里由 SEQ ID NO 9(基序 1，LDIXXDDA)、SEQ ID NO 10 (基序 2，KKKK/RR)和 SEQ ID NO 11 (基序3，AXGXDK)代表這些“DPb”基序的共有序列(見圖3)。優(yōu)選地，本發(fā)明方法中使用的DP多肽或同源物中存在這些基序。圖3顯示具有 “DPb”基序位置的DP蛋白質(zhì)的比對(duì)。由該比對(duì)所見，精制共有序列是可能的。例如，在基 序1的位置4有Q或H殘基的高概率，并且在位置5有G或A殘基的高概率。同樣地，在基 序3的位置2有V、T或A殘基的高概率，并且在位置4有P或A殘基的高概率。本領(lǐng)域技 術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到SEQ ID NO 9、10或11所代表的DPb基序，其可以通過例如1或2個(gè)錯(cuò)配 與共有的DPb基序而不同，但沒有任何功能損失。還可以使用上述新鑒別的“DPb”基序搜索數(shù)據(jù)庫，并鑒別同源的DPb多肽和編碼 序列。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、基序和盒的鑒別在本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍內(nèi)將是容易做到的。 可以通 PRODOM(http://www. biochem. ucl. ac. uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj. html)、PIR(http://pir. georgetown. edu/)、PR0SITE (http://au. expasy. org/PROSITE/) 或pFAM(http://pFAM.mistl.edu/)數(shù)據(jù)庫獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域信息。為這類結(jié)構(gòu)域搜索而 設(shè)計(jì)的軟件程序包括，但不限于 MotifScan、MEME, SIGNALSCAN 和 GENESCAN。MotifScan 是優(yōu)選的軟件程序并且可獲自http://hits. isb-sib. ch/cgi-bin/PFSCAN,該程序使用 PR0SITE和pFAM的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域信息。MEME算法(版本3. 0)可以在GCG程序包或在 http //www. sdsc. edu/MEME/meme 找到。SIGNALSCAN 版本 4. 0 可獲自 http //biosci. cbs.umn.edu/software/sigscan.html。 GENESGAN 可 在 http://gnomic. Stanford, edu/ GENESCANW. html 找到。DP多肽或同源物可以在(公共的)序列數(shù)據(jù)庫中找到。DP蛋白質(zhì)同源物在序列數(shù) 據(jù)庫中比對(duì)和鑒別的方法是本領(lǐng)域公知的。這些方法涉及使用由本發(fā)明提供的序列，例如 SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23(或SEQ ID NO 1)篩選序列數(shù)據(jù)庫。用于序列比對(duì) 和比較的不同的搜索算法和軟件是本領(lǐng)域眾所周知的，并且包括例如GAP、BESTFIT、BLAST、 FASTA和TFASTA。優(yōu)選使用計(jì)算序列同一性百分比并進(jìn)行序列之間相似性統(tǒng)計(jì)分析的 BLAST軟件。被稱為BLAST程序的程序組具有5個(gè)不同的執(zhí)行程序三個(gè)為核苷酸序列查詢 而設(shè)計(jì)(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)，兩個(gè)為蛋白質(zhì)序列查詢而設(shè)計(jì)(BLASTP和TBLASTN)(Coulson, Trends in Biotechnology 76~80,1994 ；Birren 等人，GenomeAnalysis, 1 543,1997) 0用于進(jìn)行BLAST分析的軟件可以公開獲自生物技術(shù)信息國家中心。有用的序 列數(shù)據(jù)庫包括，但不限于 Genbank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/web/Genbank)、歐洲分 子生物實(shí)驗(yàn)室核酸數(shù)據(jù)庫(EMBL) (http:/w. ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或它的 譯本或 MIPS 數(shù)據(jù)庫(http //mips. gsf. de/)。用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選DP多肽具有與SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23 中任一個(gè)至少40%序列同一性?？梢允褂门鋵?duì)全球比對(duì)程序執(zhí)行Needleman-Wunsch算法 (J. Mol. Biol. 48 =443-453,1970)來計(jì)算序列同一性百分?jǐn)?shù)，該算法最大化配對(duì)數(shù)且最小 化空位數(shù)。為了計(jì)算上述百分?jǐn)?shù)，可以使用具有空位開放罰分為10并且空位延伸罰分為 0. 1的程序needle(EMB0SS包)。對(duì)于蛋白質(zhì)，優(yōu)選使用具有字長為3的blosum62矩陣。對(duì) 于核酸，使用由EMBOSS包提供的，字長為11的矩陣“DNA-full”。Needleman-Wunsch算法 最適于從蛋白質(zhì)的全長上分析相關(guān)的蛋白質(zhì)序列。備選地，可以在如以上提到的保守區(qū)、結(jié) 構(gòu)域或基序中進(jìn)行計(jì)算，分析相關(guān)的蛋白質(zhì)，并確定如以上提到的序列同一性百分?jǐn)?shù)。符合“DP多肽或其同源物”定義的多肽的實(shí)例是擬南芥DPb (SEQID NO 2和對(duì)應(yīng)的 編碼序列SE ID NO 1)。在圖3中給出了 SEQ ID NO 12到23代表的DP蛋白質(zhì)的其他實(shí) 例，以及它們的Genbank登錄號(hào)、它們的編碼序列和它們的蛋白質(zhì)序列。目前可在公共數(shù)據(jù) 庫如Genbank獲得擬南芥和稻(Oryza sativa)的基因組序列，并且正在測序其他基因組。 因此，期望使用程序BLASTX或BLASTP或其他程序，通過與SEQ ID NO 1到4或12到23中 任一個(gè)進(jìn)行序列比對(duì)，可以容易地鑒別更多的同源物。盡管其可能呈現(xiàn)“至少40 %同一性”的相對(duì)低序列同源性，DP蛋白質(zhì)都具有DNA結(jié) 合結(jié)構(gòu)域和二聚化結(jié)構(gòu)域，是高度保守的。應(yīng)該理解的是，術(shù)語DP多肽或其同源物不限于 由SEQ ID NO 2、4、13、15、17、19、21和23代表的序列，而是具有DP特征性特點(diǎn)，即⑴二 聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu) 域的任何多肽，所述多肽可以用于本發(fā)明的方法。具有這類特性的DP多肽保留了 DP蛋白 質(zhì)的相似功能活性和/或生物活性，或至少部分的功能活性和/或生物活性。生物活性是 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于其天然環(huán)境下的活性?？梢酝ㄟ^，例如在Magyar等人，2000 (FEBS letters, 486 79-97)所述的雙雜交或使用免疫共沉淀檢測二聚化活性(即，DP與E2F轉(zhuǎn)錄因子二聚 化的能力)。DP多肽/蛋白質(zhì)或其同源物是由“DP編碼核酸”或由“DP編碼基因”編碼；該術(shù) 語在此可互換使用，并意指編碼上述DP多肽或其同源物的核酸。DP編碼核酸的實(shí)例包括由 SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的那些。DP的編碼核酸及其功能變體 可用于實(shí)施本發(fā)明的方法。DP編碼核酸的功能變體包括這類核酸的部分和/或能夠與DP 編碼核酸雜交的核酸。用于本發(fā)明方法中的功能變體(部分或雜交序列)是編碼多肽的那 些，所述多肽具有DP特征性特點(diǎn)，S卩(i) 二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化 結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述功能變體可以用于本發(fā)明的方法中。本文所用的術(shù)語部分指包含至少80個(gè)核苷酸的DNA片段，并且該部分編碼的多肽 具有DP的特征性特點(diǎn)，S卩(i) 二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域) 和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些部分可以用于本發(fā)明的方法?？梢岳缤ㄟ^對(duì) DP編碼核酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)缺失來制備所述部分。所述部分優(yōu)選地是SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的核酸的部分，并且該部分符合上述要求。DP編碼核酸的另一功能變體是能夠與DP編碼核酸雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下雜交 的核酸。本文定義的這類雜交序列在長度上是至少80個(gè)核苷酸并且編碼的多肽具有DP特 征性特點(diǎn)，即(i) 二聚化活性(其屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu)域)和(ii)結(jié)合 DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這類雜交序列可以用于本發(fā)明的方法。所述雜交序列優(yōu)選能夠與 SEQ ID NO 1、3、12、14、16、18、20和22中任一個(gè)代表的核酸雜交，并且該雜交序列符合上述 要求。本文所用的術(shù)語“雜交”意指在雜交過程中與基本同源的互補(bǔ)核酸序列的退火。雜 交過程可以完全發(fā)生在溶液中，即兩條互補(bǔ)核酸都在溶液中。雜交過程還可以如此進(jìn)行，即 其中互補(bǔ)核酸之一固定于基質(zhì)如磁珠、瓊脂糖凝膠珠子或任何其它樹脂上。此外雜交過程 可還可以如此進(jìn)行，即其中互補(bǔ)核酸之一固定于固相支持物如硝化纖維素膜或尼龍膜上， 或通過例如照相平版印刷術(shù)固定到例如硅酸玻璃支持物上(后者稱之為核酸陣列或微陣 列，或稱之為核酸芯片)。為了使得雜交發(fā)生，通常使核酸分子熱變性或化學(xué)變性，以使雙 鏈解鏈成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去發(fā)夾或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫 度、鹽濃度和雜交緩沖液組成條件等的影響。在簡化的嚴(yán)格條件，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。雜交的嚴(yán)格性受諸如溫度、鹽 濃度和雜交緩沖液組成條件等的影響。在簡化的嚴(yán)格條件，優(yōu)選地在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。 嚴(yán)格條件的實(shí)例如下表1所示嚴(yán)格條件是那些至少如，例如條件A-L的嚴(yán)格性；并且簡化 的嚴(yán)格條件是至少如，例如條件M-R的嚴(yán)格性。表1 雜交和洗滌條件的實(shí)例
1權(quán)利要求
相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括在植物莖干組織中特異性增加DP多肽或其同源物的活性，和/或增加植物莖干組織中DP編碼基因或其功能變體的表達(dá)，以及任選選擇具有改良生長特性的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中優(yōu)選在編碼DP多肽或其同源物的基因座上引入遺傳修 飾來實(shí)現(xiàn)所述增加活性和/或增加表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過定點(diǎn)誘變、定向進(jìn)化、同源重組、TILLING、T-DNA激 活中的任一種或多種，以及通過將編碼DP多肽或其同源物的DP編碼核酸或其功能變體導(dǎo) 入植物來實(shí)現(xiàn)所述遺傳修飾。
4.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，改良植物生長特性的方法，其包括將DP編碼核酸或其功 能變體導(dǎo)入植物，并在莖干組織中特異性表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述功能變體是部分DP編碼核酸，或者能夠與DP編碼 核酸雜交的序列，其中所述功能變體編碼的多肽具有(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚 化結(jié)構(gòu)域的二聚化活性；和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)的方法，其中所述DP編碼核酸或其功能變體，或DP多 肽或其同源物是植物來源的，優(yōu)選來自雙子葉植物，更優(yōu)選來自十字花科，進(jìn)一步優(yōu)選來自 擬南芥。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)的方法，其中所述DP編碼核酸是(i)包括SEQID NO 1、3、12、14、16、18、20或22，或其中任一個(gè)序列的功能變體的核 酸，其中所述核酸或功能變體編碼的多肽包含(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化結(jié)構(gòu) 域的二聚化活性；和( )結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或(ii)編碼SEQID NO 2、4、13、15、17、19、21或23代表的蛋白質(zhì)，或編碼其中任一個(gè)序 列的同源物的核酸，其中所述蛋白質(zhì)或同源物包含(i)屬于部分，或優(yōu)選屬于整個(gè)二聚化 結(jié)構(gòu)域的二聚化活性；和(ii)結(jié)合DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
8.根據(jù)權(quán)利要求4到7中任一項(xiàng)的方法，其中所述核酸或其功能變體在啟動(dòng)子的控制 下，能夠在莖干組織中特異性表達(dá)所述DP編碼核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子具有與β擴(kuò)展蛋白啟動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜。
10.根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的 植物生長特性是增加的生物量。
11.根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的 植物生長特性是增加的產(chǎn)量，特別是增加的種子產(chǎn)量。
12.根據(jù)權(quán)利要求1到11中任一項(xiàng)的方法，其中相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，所述改良的 植物生長特性是增加的生長速率。
13.根據(jù)權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的方法，其中所述改良的植物生長特性是改變的構(gòu) 造，特別是分蘗或?qū)?yīng)植物部分的增加的數(shù)量、尺寸、形狀中的一個(gè)或多個(gè)；枝條和/或葉 的增加的量。
14.根據(jù)權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1到14中任一項(xiàng)的方法獲得的植物。
16.遺傳構(gòu)建體，其包括(a) DP編碼核酸或其功能變體；(b)能夠在莖干組織中驅(qū)動(dòng)核酸(a)表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄控制序列；及任選的(c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的遺傳構(gòu)建體，其中所述控制序列能夠在幼生莖干組織中特異性 表達(dá)所述DP編碼核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的遺傳構(gòu)建體，其中所述控制序列是具有與β擴(kuò)展蛋白啟 動(dòng)子相當(dāng)?shù)谋磉_(dá)譜的啟動(dòng)子。
19.轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所定義的遺傳構(gòu)建體。
20.轉(zhuǎn)基因植物或植物的部分，其包含權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)所定義的遺傳構(gòu)建體。
21.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，產(chǎn)生具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法 包括(a)將根據(jù)權(quán)利要求16到18中任一項(xiàng)的遺傳構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞；(b)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)所述植物細(xì)胞。
22.相對(duì)于對(duì)應(yīng)的野生型植物，具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物，所述改良生長特性由 導(dǎo)入所述植物的，在莖干特異性啟動(dòng)子控制下的DP編碼核酸或其功能變體產(chǎn)生。
23.根據(jù)權(quán)利要求15、19、20或22的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物是單子葉植物，如甘蔗 或谷類，如稻、小麥、大麥、玉米、粟、黑麥、燕麥或高梁。
24.權(quán)利要求15、19、20、22和23中任一項(xiàng)所定義的植物的部分，優(yōu)選可收獲部分，例如 植物的種子或無性繁殖體。
25.權(quán)利要求15、19、20、22、23和24所定義的植物的后代，其中所述后代與其來源的親 本植物呈現(xiàn)一種或多種相同的基因型特性。
26.直接來源于權(quán)利要求15、19、20、22、23到25中任一項(xiàng)所定義的植物或后代的產(chǎn)物。
27.在莖干特異性啟動(dòng)子控制下，DP編碼核酸或其功能變體用于改良植物生長特性的 用途，所述植物生長特性選自以下一種或多種增加植物生物量、增加產(chǎn)量、增加種子產(chǎn)量、 改變植物構(gòu)造和增加生長速率。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過增加莖干組織中DP蛋白質(zhì)的活性或通過增加植物莖干組織中DP編碼基因的表達(dá)來改良植物生長特性的方法。本發(fā)明還涉及由本發(fā)明方法產(chǎn)生的，具有改良生長特性的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)A01H1/00GK101946714SQ20101027418
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月28日
發(fā)明者C·魯茲, V·弗蘭卡德 申請(qǐng)人:克羅普迪塞恩股份有限公司