專利名稱：一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑及其制備方 法。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病被稱為香蕉的“癌癥”，是典型的土傳病害，病原菌為古巴尖孢鐮刀菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense, FOC)。由于化學(xué)防治效果不理想、易產(chǎn)生抗性、污 染環(huán)境等缺點(diǎn)，采取生物防治香蕉枯萎病已逐步成為了枯萎病防治的新方向?？莶菅挎邨U菌是一種嗜溫性、好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌，其分布廣泛，極 易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢。目前該菌已經(jīng)在黃瓜、 辣椒、水稻、小麥、玉米等農(nóng)作物上顯出很好的病害防治效果。該菌批量生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本 也較低，施用方便，儲(chǔ)存期長(zhǎng)，是一種理想的生防微生物。目前用枯草芽孢桿菌制備生防制 劑防治植物病害的研究已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，有關(guān)枯草芽孢桿菌在植物生物防治上的 應(yīng)用報(bào)道很多，而發(fā)酵條件方面的研究較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑及其制備方法，并以提高其抑菌活性 為目標(biāo)，優(yōu)化了該枯草芽孢桿菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件，降低成本，提高效價(jià)， 發(fā)酵完成后可作為一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑，為枯草芽孢桿菌在生物防治方面的進(jìn)一 步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了依據(jù)。本發(fā)明的抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，該發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng) 基配制為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比);豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (重量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高壓滅菌30min。所述抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑的制備步驟如下 (1)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基配制
玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%(占水的重量比);豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (占水的重量比)；水1000ml ；PH6-8 ；在121°C下高壓滅菌30min。(2)枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25-35°C、100-200r/ min條件下震蕩培養(yǎng)10-50h ；所述細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基。( 3 )枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1-10% (v/v), 在溫度20-30°C下培養(yǎng)10-50h ；
(4)收集
發(fā)酵完成后收集枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；
(5)檢測(cè)
用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量，用打孔法檢測(cè)抑菌效果。
步驟(2)所述的活化在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化，活化時(shí)間24h ；所述細(xì)菌培養(yǎng)斜面的 配制如下牛肉膏5 g, NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.2。步驟(2)所述接種為菌株活化后挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三角瓶細(xì)菌液體發(fā)
酵培養(yǎng)基中。本發(fā)明的抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑的抑菌效果通過(guò)用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量，用 打孔法檢測(cè)抑菌效果；
所述的打孔法步驟如下
將香蕉枯萎病病原菌以劃線法接種到PDA培養(yǎng)基上，置于26°C下培養(yǎng)9天；從上挑 取1環(huán)孢子至10ml無(wú)菌水中，混勻，制成病原菌孢子懸液，按體積比1 :100加入冷卻至 40°C -60°C的PDA培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中；待凝固后用打孔器打孔，加入步驟(4)所述枯草芽 孢桿菌發(fā)酵液，在26°C培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈大小。本發(fā)明以發(fā)酵后發(fā)酵液的抑菌活性高低為標(biāo)準(zhǔn)，綜合了降低成本，節(jié)約能源，簡(jiǎn)化 環(huán)節(jié)，提高效率等因素，針對(duì)枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性，篩選培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)條件、發(fā)酵溫 度、接種量等。本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基原料經(jīng)濟(jì)便宜，發(fā)酵培養(yǎng)基濃度、接種量、裝瓶量適中， 可使發(fā)酵后產(chǎn)物具有較高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件可使 發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抑菌活性，且成本較低；采用的檢測(cè)方法快速方便，可獲得直接明了的 檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)
1、常見(jiàn)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵所用的培養(yǎng)基大多以牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖等為主，生 產(chǎn)成本較高，本發(fā)明選用的發(fā)酵培養(yǎng)基為淀粉、玉米粉、豆粕、黃豆粉等農(nóng)產(chǎn)品，容易獲得且 價(jià)格經(jīng)濟(jì)便宜；
2、發(fā)酵培養(yǎng)基濃度、接種量、裝瓶量適中，可使發(fā)酵后產(chǎn)物具有較高的抗香蕉枯萎病菌 活性。3、本發(fā)明以發(fā)酵后發(fā)酵液的抑菌活性高低為標(biāo)準(zhǔn)，綜合了降低成本，節(jié)約能源，簡(jiǎn) 化環(huán)節(jié)，提高效率等因素，針對(duì)枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特性，篩選出優(yōu)化的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng) 條件、發(fā)酵溫度、接種量等。
具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施案例，進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此。實(shí)施例1
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
糖蜜0. 5%，牛肉膏1%，水1000ml ；pH7. 5 ；55ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS12菌株(保存在福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)微生物研究室) 在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于 28°C、160r/min條件下震蕩培養(yǎng)24h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
4將CS12種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量5%)，30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)50h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。5、檢測(cè)
平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量。打孔法檢測(cè)抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號(hào)生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養(yǎng)基上，置于26°C下培養(yǎng)9天；從上挑取1環(huán)孢子至10ml無(wú)菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養(yǎng)皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS12發(fā)酵液，在26°C培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內(nèi)，說(shuō)明發(fā)酵液具有較高的抑菌活性。6、瓶裝或桶裝成成品。實(shí)施例2
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
玉米粉0. 5%，豆粕1%，水1000ml ；pH7. 0 ；50ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS18菌株(保存在福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)微生物研究室) 在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于 30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)24h。4、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS18種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量4%)，30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)10h。5、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。6、檢測(cè)
平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量。打孔法檢測(cè)抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號(hào)生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養(yǎng)基上，置于26°C下培養(yǎng)9天；從上挑取1環(huán)孢子至10ml無(wú)菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養(yǎng)皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS18發(fā)酵液，在26°C培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內(nèi)，說(shuō)明發(fā)酵液具有較高的抑菌活性。實(shí)施例3
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
蔗糖0. 4%，黃豆粉1. 2%，水1000ml ；pH7. 6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓 滅菌30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株(保存在福建省農(nóng)科院土壤肥料研究所農(nóng)業(yè)微生物研究室) 在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于 30°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量6%)，20°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)25h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。
5、檢測(cè)
平板計(jì)數(shù)法測(cè)定生物量。打孔法檢測(cè)抑菌效果將香蕉枯萎病病原菌福建4號(hào)生理小種(FJ4)以劃線法接 種到PDA培養(yǎng)基上，置于26°C下培養(yǎng)9天；從上挑取1環(huán)孢子至10ml無(wú)菌水中，混勻，制成 FJ4孢子懸液，再以1 :100的比例加入熔化后冷卻至45°C左右的PDA中，倒入培養(yǎng)皿中。待 凝固后用打孔器打孔，加入CS16發(fā)酵液，在26°C培養(yǎng)72h，觀察抑菌圈大小。抑菌透明圈直 徑在19mm-22mm范圍內(nèi)，說(shuō)明發(fā)酵液具有較高的抑菌活性。實(shí)施例4
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
玉米粉10%，豆粕9%，水1000ml ；pH8 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于35°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量10%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)
50h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。實(shí)施例5
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
玉米粉5%，豆粕6%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量1%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)24h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。實(shí)施例6
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
玉米粉0. 1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅 菌 30min。2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量1%)，28°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)10h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。實(shí)施例71、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
淀粉1%，豆粕1%，水1000ml ；pH6. 5 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于28°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量1%)，26°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)20h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。實(shí)施例8
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
糖蜜1%，麩皮5%，水1000ml ；pH7 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量1%)，29°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)30h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。實(shí)施例9
1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基制備
蔗糖0. 5%，豆粕5%，水1000ml ；pH6 ；45ml/250ml的三角瓶裝量，在121°C下高壓滅菌 30mino2、枯草芽孢桿菌種子液制備
將枯草芽孢桿菌CS16菌株在細(xì)菌培養(yǎng)斜面上活化24h，挑兩環(huán)接種到50ml/250ml的三 角瓶細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，置于25°C、180r/min條件下震蕩培養(yǎng)28h。3、枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵
將CS16種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(接種量1%)，27°C、200r/min條件下震蕩培養(yǎng)18h。4、發(fā)酵完成后收集發(fā)酵液。
權(quán)利要求
一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑，其特征在于所述抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑為枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，該發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)基配制為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1 10%(重量比)；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1 10%(重量比)；水1000ml；pH6 9；在121℃下高壓滅菌30min。
2.一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑的制備方法，其特征在于所述制備方法的具體步驟 如下(1)枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基配制玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10% (重量比)；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10% (重 量比)；水1000ml ；PH6-9 ；在121°C下高壓滅菌30min ；(2)枯草芽孢桿菌種子液制備將枯草芽孢桿菌菌株活化后接種到細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25-35°C、100-200r/ min條件下震蕩培養(yǎng)10-50h ；所述細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基為牛肉膏-蛋白胨培養(yǎng)基；(3)枯草芽孢桿菌搖瓶發(fā)酵將枯草芽孢桿菌種子液接種到枯草芽孢桿菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1-10% (v/v), 在溫度20-30°C下培養(yǎng)10-50h ；(4)收集發(fā)酵完成后收集枯草芽孢桿菌發(fā)酵液即為抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述的活化是在細(xì)菌培養(yǎng)斜 面上活化，活化時(shí)間24h。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述細(xì)菌培養(yǎng)斜面的配制如下牛肉 膏 5 g, NaCl 5 g，蛋白胨 10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.2。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)所述接種為菌株活化后挑兩 環(huán)接種到50ml/250ml的三角瓶細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑及其制備方法。所述抗香蕉枯萎病微生態(tài)菌劑發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉、淀粉、蔗糖或糖蜜0.1-10%；豆粕、黃豆粉、麩皮或牛肉膏1-10%；水1000ml；pH6-9。通過(guò)制備枯草芽孢桿菌種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；發(fā)酵完成后收集枯草芽孢桿菌發(fā)酵液。本發(fā)明采用的發(fā)酵培養(yǎng)基原料經(jīng)濟(jì)便宜，發(fā)酵培養(yǎng)基濃度、接種量、裝瓶量適中，可使發(fā)酵后產(chǎn)物具有較高的抗香蕉枯萎病菌活性。采用的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件可使發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抑菌活性，且成本較低；采用的檢測(cè)方法快速方便，可獲得直接明了的檢測(cè)結(jié)果。
文檔編號(hào)A01P3/00GK101911954SQ201010274100
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月7日
發(fā)明者張慧, 林戎斌, 林新堅(jiān), 林陳強(qiáng), 白丹紅, 蔡海松, 陳濟(jì)琛 申請(qǐng)人:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所