專利名稱：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)叢生竹類，尤其是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢 生竹類的方法，屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，竹類基因克隆及其遺傳改良方面的研究尚處起步和探索階段。在基因克隆 方面，盡管相繼在慈竹、綠竹、毛竹上克隆了調(diào)控竹木質(zhì)素相關(guān)合成酶基因，但未見在工業(yè) 紙漿用竹中成功進行遺傳轉(zhuǎn)化的研究報道。原因是還未建立大型工業(yè)紙漿用竹遺傳轉(zhuǎn)化體 系，制約了相關(guān)基因表達與調(diào)控的研究及其在竹遺傳改良方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述問題，本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的 方法，包括如下步驟a.愈傷組織誘導(dǎo)取竹種子成熟胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2上培養(yǎng)2_3周 后，獲得愈傷組織，3-4周后，獲得竹胚性愈傷組織；b.預(yù)培養(yǎng)將處于誘導(dǎo)后期的竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基MS2中預(yù)培養(yǎng)1周；c.含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸挑取含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在含有 50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB上劃線，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩 天；挑取單菌落于另一新鮮的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB 上繼續(xù)培養(yǎng)兩天；在超凈臺中刮取農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB平板上的農(nóng)桿菌于誘導(dǎo)液中重懸混 勻，使0D600接近0. 2 ；d.侵染和共培養(yǎng)取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的竹胚性愈傷組織于誘導(dǎo)液中振蕩30min，取出 竹胚性愈傷組織，在無菌濾紙上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培 養(yǎng)兩天；e.篩選抗性愈傷組織取出竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有75mg/L卡那霉素和 500mg/L羧芐青霉素的抗性篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織；f.叢生芽分化和伸長將篩選到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入?yún)采糠只囵B(yǎng)基，誘導(dǎo)叢 生芽；g.伸長叢生芽根的誘導(dǎo)取健壯叢生芽幼苗直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根；幼苗在生 根培養(yǎng)基中生長15-20天，誘導(dǎo)生根，獲得再生小植株；h.轉(zhuǎn)化植株鑒定用PCR方法對上述獲得的再生小植株進行檢測，確定外源基因 已經(jīng)整合到竹子基因組DNA中，確定轉(zhuǎn)化小植株；i.幼苗移栽將上述轉(zhuǎn)化小植株洗凈培養(yǎng)基，移入營養(yǎng)缽中，利用人工噴水保持 環(huán)境濕度，經(jīng)過馴化煉苗20-30天后，移栽入裝有花園土、直徑為30cm的花盆中。
所述的步驟a、b中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2 的配方為MS+2，4-D 2mg/L+KT0. 2mg/L+IBA0. 4mg/L,蔗 糖 30g/L,瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟c中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB的配方為細菌蛋白胨5g/L，酵母浸膏l(xiāng)g/L，牛肉浸膏5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 04g/L，瓊脂 16g/L，ρΗ7· 0 ；誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L, ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟d中，誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L，pH5. 6-5. 8 ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方為MS2，乙酰丁香酮14. 7mg/L,麥芽糖30g/L，瓊脂7g/L， ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟e中，抗性篩選培養(yǎng)基的配方為MS2，卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/ L,瓊脂 7g/L，pH5. 6-5. 8 ；所述的步驟f中，叢生芽分化培養(yǎng)基的配方為MS+KT2. 5mg/L+IAA 0. 5mg/L,卡那霉素75mg/L，羧 芐青霉素 500mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟g中，生根培養(yǎng)基的配方為MS+NAA0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/L,羧芐青霉素500mg/L，蔗糖 30g/L，瓊脂 5g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟i中，營養(yǎng)缽中的配方為腐葉土 石英砂土壤=2:1:1;培養(yǎng)條件為晝溫度25°C，夜溫度18°C，光照時間14h/d。本發(fā)明的有益效果是，解決了大型叢生紙漿用竹難于進行遺傳轉(zhuǎn)化的問題?？梢?有效抑制農(nóng)桿菌對植物外植體所造成的污染，縮短獲得轉(zhuǎn)基因植物的周期，提高獲得轉(zhuǎn)基 因植物的幾率。篩選一個月后即獲得了抗性愈傷組織，二至四個月可獲得再生的轉(zhuǎn)基因植 株。轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，對大型叢生紙漿用竹遺傳改良和竹功能基因組學(xué)研究等具有重 要的作用及廣闊的應(yīng)用前景。適用于慈竹、梁山慈竹等大型叢生紙漿用竹的生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步說明。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法，包括如下步驟a.愈傷組織誘導(dǎo)取竹種子成熟胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2上培養(yǎng)2_3周 后，獲得愈傷組織，3-4周后，獲得竹胚性愈傷組織；b.預(yù)培養(yǎng)將處于誘導(dǎo)后期的竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基MS2中預(yù)培養(yǎng)1周；c.含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸挑取含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在含有 50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB上劃線，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩 天；挑取單菌落于另一新鮮的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB
5上繼續(xù)培養(yǎng)兩天；在超凈臺中刮取農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB平板上的農(nóng)桿菌于誘導(dǎo)液中重懸混 勻，使0D600接近0. 2 ；d.侵染和共培養(yǎng)取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的竹胚性愈傷組織于誘導(dǎo)液中振蕩30min，取出 竹胚性愈傷組織，在無菌濾紙上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培 養(yǎng)兩天；e.篩選抗性愈傷組織取出竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有75mg/L卡那霉素和 500mg/L羧芐青霉素的抗性篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織；f.叢生芽分化和伸長將篩選到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入?yún)采糠只囵B(yǎng)基，誘導(dǎo)叢 生芽；g.伸長叢生芽根的誘導(dǎo)取健壯叢生芽幼苗直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根；幼苗在生 根培養(yǎng)基中生長15-20天，誘導(dǎo)生根，獲得再生小植株；h.轉(zhuǎn)化植株鑒定用PCR方法對上述獲得的再生小植株進行檢測，確定外源基因 已經(jīng)整合到竹子基因組DNA中，確定轉(zhuǎn)化小植株；i.幼苗移栽將上述轉(zhuǎn)化小植株洗凈培養(yǎng)基，移入營養(yǎng)缽中，利用人工噴水保持 環(huán)境濕度，經(jīng)過馴化煉苗20-30天后，移栽入裝有花園土、直徑為30cm的花盆中。所述的步驟a、b中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2 的配方為MS+2，4-D 2mg/L+KT0. 2mg/L+IBA0. 4mg/L,蔗 糖 30g/L,瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟c中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB的配方為細菌蛋白胨5g/L，酵母浸膏l(xiāng)g/L，牛肉浸膏5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 04g/L，瓊脂 16g/L，ρΗ7· 0 ；誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L，pH5. 6-5. 8 ；所述的步驟d中，誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L，pH5. 6-5. 8 ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方為MS2，乙酰丁香酮14. 7mg/L,麥芽糖30g/L，瓊脂7g/L， ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟e中，抗性篩選培養(yǎng)基的配方為MS2，卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/ L,瓊脂 7g/L，pH5. 6-5. 8 ；所述的步驟f中，叢生芽分化培養(yǎng)基的配方為MS+KT2. 5mg/L+IAA 0. 5mg/L,卡那霉素75mg/L，羧 芐青霉素 500mg/L，蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟g中，生根培養(yǎng)基的配方為MS+NAA0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/L,羧芐青霉素500mg/L，蔗糖 30g/L，瓊脂 5g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟i中，營養(yǎng)缽中的配方為腐葉土 石英砂土壤=2:1:1;培養(yǎng)條件為晝溫度25°C，夜溫度18°C，光照時間14h/d。
權(quán)利要求
一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法，其特征在于，包括如下步驟a.愈傷組織誘導(dǎo)取竹種子成熟胚置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2上培養(yǎng)2 3周后，獲得愈傷組織，3 4周后，獲得竹胚性愈傷組織；b.預(yù)培養(yǎng)將處于誘導(dǎo)后期的竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2中預(yù)培養(yǎng)1周；c.含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸挑取含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB上劃線，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩天；挑取單菌落于另一新鮮的含有50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB上繼續(xù)培養(yǎng)兩天；在超凈臺中刮取農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB平板上的農(nóng)桿菌于誘導(dǎo)液中重懸混勻，使OD600接近0.2；d.侵染和共培養(yǎng)取經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的竹胚性愈傷組織于誘導(dǎo)液中振蕩30min，取出竹胚性愈傷組織，在無菌濾紙上吸干水分，然后在含有乙酰丁香酮的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上共培養(yǎng)兩天；e.篩選抗性愈傷組織取出竹胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接至含有75mg/L卡那霉素和500mg/L羧芐青霉素的抗性篩選培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織；f.叢生芽分化和伸長將篩選到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入?yún)采糠只囵B(yǎng)基，誘導(dǎo)叢生芽；g.伸長叢生芽根的誘導(dǎo)取健壯叢生芽幼苗直接轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基生根；幼苗在生根培養(yǎng)基中生長15 20天，誘導(dǎo)生根，獲得再生小植株；h.轉(zhuǎn)化植株鑒定用PCR方法對上述獲得的再生小植株進行檢測，確定外源基因已經(jīng)整合到竹子基因組DNA中，確定轉(zhuǎn)化小植株；i.幼苗移栽將上述轉(zhuǎn)化小植株洗凈培養(yǎng)基，移入營養(yǎng)缽中，利用人工噴水保持環(huán)境濕度，經(jīng)過馴化煉苗20 30天后，移栽入裝有花園土、直徑為30cm的花盆中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法，其特征在于，所述的步 驟a、b中，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS2的配方為MS+2，4-D 2mg/L+KT0. 2mg/L+IBA0. 4mg/L,蔗糖 30g/L，瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟c中，農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB的配方為細菌蛋白胨5g/L，酵母浸膏l(xiāng)g/L，牛肉 浸膏 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 04g/L，瓊脂 16g/L，ρΗ7· 0 ；誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L, ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟d中，誘導(dǎo)液為MS2，麥芽糖30g/L, ρΗ5· 6-5. 8 ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基的配方為MS2，乙酰丁香酮14. 7mg/L,麥芽糖30g/L，瓊脂7g/L， ρΗ5· 6-5. 8 ；所述的步驟e中，抗性篩選培養(yǎng)基的配方為MS2，卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/L，瓊 脂 7g/L，pH5. 6-5. 8 ；所述的步驟f中，叢生芽分化培養(yǎng)基的配方為MS+KT2. 5mg/L+IAA 0. 5mg/L,卡那霉素75mg/L，羧芐青霉素 500mg/L,蔗糖 30g/L,瓊脂 7g/L，ρΗ5· 6-5. 8 ； 所述的步驟g中，生根培養(yǎng)基的配方為MS+NAA0. 25mg/L+IBA 0. 4mg/L，羧芐青霉素500mg/L，蔗糖30g/ L,瓊脂 5g/L，pH5. 6-5. 8 ； 所述的步驟i中，營養(yǎng)缽中的配方為腐葉土 石英砂土壤=2:1:1; 培養(yǎng)條件為晝溫度25°C，夜溫度18°C，光照時間14h/d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)法生產(chǎn)大型叢生竹類的方法，屬于植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。它包括愈傷組織誘導(dǎo)、預(yù)培養(yǎng)、含有目的基因農(nóng)桿菌的活化與重懸、侵染和共培養(yǎng)、抗性愈傷組織篩選、叢生芽分化和生長、轉(zhuǎn)化植株鑒定、轉(zhuǎn)化植株培育和幼苗移栽等步驟，以及轉(zhuǎn)化各過程中的專用培養(yǎng)基和誘導(dǎo)液的配方。本發(fā)明解決了大型叢生竹難于進行遺傳轉(zhuǎn)化的問題?？捎行б种妻r(nóng)桿菌對植物外植體所造成的污染，縮短獲得轉(zhuǎn)基因植物的周期，提高獲得轉(zhuǎn)基因植物的幾率。篩選一個月后即獲得了抗性愈傷組織，二至四個月可獲得再生的轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高，重復(fù)性好，對大型叢生紙漿用竹遺傳改良和竹功能基因組學(xué)研究等具有重要的作用及廣闊的應(yīng)用前景。適用于慈竹、梁山慈竹等大型叢生紙漿用竹的生產(chǎn)。
文檔編號A01H4/00GK101906434SQ20101023001
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者任鵬, 盧學(xué)琴, 曹穎, 李曉瑞, 段寧, 胡尚連 申請人:胡尚連