專(zhuān)利名稱(chēng)：一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種保護(hù)液，可用于儲(chǔ)存和保護(hù)新鮮樣本，尤其指臨床手術(shù)后的組織 樣本。其可以保護(hù)組織樣本中的RNA在常溫下不被降解，從而可以用于隨后的實(shí)驗(yàn)室研究 或臨床試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
關(guān)于人類(lèi)疾病的研究具有特殊性，因?yàn)檠芯咳祟?lèi)自身與其他動(dòng)物不同的是，對(duì)于 其他動(dòng)物，我們可以根據(jù)自己的需要，構(gòu)建動(dòng)物模型，比如小鼠，通過(guò)環(huán)境誘導(dǎo)使其得病，然 后再用藥物治療，在各個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以設(shè)置正常小鼠參照，最后處死小鼠，取出組織，以 供我們做分子水平、細(xì)胞水平以及活體水平的各種科研實(shí)踐。然而這對(duì)于人類(lèi)就不可能通 過(guò)這種手段進(jìn)行科研實(shí)踐。雖然人類(lèi)與小鼠的基因組有著90%以上的相似性，但還是存在 很大的差異，并且由于人的社會(huì)活動(dòng)性，所處的環(huán)境不同，也造成了人與人之間的差異。因此，我們要研究人類(lèi)自身的疾變，最多的是依賴于已患疾病的病人組織、血液、 體液等樣本，通過(guò)基因芯片診斷、細(xì)胞生物學(xué)分析、組織切片、蛋白分離純化等生物學(xué)技術(shù)， 并結(jié)合病人的個(gè)人信息，包括社會(huì)活動(dòng)和環(huán)境接觸，來(lái)推算出該疾病患病的原因。這就非常 依賴于現(xiàn)有疾病樣本的收集和研究。而對(duì)于組織樣本的研究，一般是根據(jù)組織中的RNA來(lái) 研究基因表達(dá)差異；或者通過(guò)組織中的DNA來(lái)研究基因組差異，比如測(cè)序研究單核苷酸多 態(tài)性，基因突變等；或者通過(guò)組織中的蛋白差異來(lái)研究一些特異性的標(biāo)記物，從而篩選并發(fā) 現(xiàn)一些能用于早期診斷的分子標(biāo)記物。然而，RNA—旦組織離體后，就很容易降解；質(zhì)量差的組織，對(duì)于后續(xù)的科研工作 的重要性就會(huì)大大降低，甚至毫無(wú)作用，或者起誤導(dǎo)作用。由于環(huán)境中充滿了各種RNA酶， 從新鮮組織中提取RNA時(shí)，樣品若不能馬上處理，則通常需要立即保存于液氮，而液氮和超 低溫冰箱并不能普及到每個(gè)實(shí)驗(yàn)室或者醫(yī)院，并且液氮和超低溫冰箱的維護(hù)也需要較高的 費(fèi)用。液氮雖然解決了保存問(wèn)題，但仍然無(wú)法有效的解決樣品的運(yùn)輸問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑及其制備方法，本發(fā)明 的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑能在常溫下保護(hù)離體組織的RNA不被降解。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法，包括 以下步驟1)、配制 pH 為 7. 8 8. 2 的 Tris-EDTA ；2)、配制摩爾濃度為3. 8 4. 2mol/L的(NH4)2S04溶液；3)、在680 720ml步驟2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步驟1)所得的 Tris-EDTA 180 220ml，然后于攪拌狀態(tài)下滴加0. 08 0. 12M的NaOH溶液，直至pH為 8. 1 8. 2 ；再用18. 2M歐姆的去離子水定容至IOOOml ；得離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。作為本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法的改進(jìn)=TriS-EDTA和(NH4)2S04溶液中均以18. 2M歐姆的去離子水作為溶劑。本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑制備方法的最佳技術(shù)方案如下1)、配制 pH 為 8.0 的 Tris-EDTA;2)、配制摩爾濃度為4mol/L的(NH4) 2S04溶液；3)、在700ml步驟2)所得的(NH4) 2S04溶液中加入步驟1)所得的Tr i s_EDTA 200ml，然后于攪拌狀態(tài)下滴加0. IM的NaOH溶液，直至pH為8. 15 ；再用18. 2M歐姆的去離 子水定容至IOOOml ；得離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。上述pH為8. 0的Tris-EDTA的制備方法如下將0. 5 Imol 的 Tris 和 0. 002 0. Olmol 的 EDTA 溶解于 800ml 的 18. 2M 歐姆 的去離子水，利用0. IM的HCl溶液調(diào)節(jié)pH為8. 0 ；然后用18. 2M歐姆的去離子水定容至 IOOOml ；得 pH 為 8. 0 的 Tris-EDTA。在本發(fā)明中，NaOH溶液和HCl溶液均以18. 2M歐姆的去離子水作為溶劑。本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法制備而得的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑是一種液態(tài)的、無(wú)毒的組織保存試劑，能迅速穩(wěn)定 離體組織，保護(hù)非冷凍狀態(tài)下的離體組織的RNA不被降解。使用本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保 護(hù)劑，能實(shí)現(xiàn)在任何時(shí)間、任何地點(diǎn)收集臨床組織樣品；且不需要在液氮中冷凍樣品或立即 將樣品送回實(shí)驗(yàn)室冰箱保存，大大提高了樣本收集的可操作性，是臨床及科研領(lǐng)域內(nèi)完美 的樣本保護(hù)劑。由于浸泡在本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的離體組織能常溫下較長(zhǎng)時(shí)間保 存，因此還可以解決樣本(離體組織)在不同地方的運(yùn)輸問(wèn)題。本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑可在常溫下保存，保存期為1 2周；如在_20°C的 低溫下則可長(zhǎng)時(shí)間保存。在保存期內(nèi)如果出現(xiàn)沉淀物，屬正?，F(xiàn)象，只需將其置于60度水 浴 鍋蒸煮至澄清即可。本發(fā)明實(shí)際使用時(shí)，可將臨床樣本切割成小于0. 5cm的小塊，然后將臨床樣本浸 泡在本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑中，一般每0. 5g的臨床樣本對(duì)應(yīng)5. Oml的離體組織穩(wěn)定 保護(hù)劑；從而使本發(fā)明的保護(hù)劑能滲入到樣本的細(xì)胞中，從而穩(wěn)定RNA。隨后該浸泡在本發(fā) 明的穩(wěn)定保護(hù)劑中的樣品可于室溫(25°C )保存1-2周，4°C保存3-6個(gè)月，或者在-20°C下 長(zhǎng)期保存。在實(shí)際進(jìn)行RNA分離時(shí)，只需將組織從穩(wěn)定保護(hù)劑中取出，按照常規(guī)采集后進(jìn)行 的常規(guī)操作即可。在-20°C下被冰凍的樣品可用研缽研磨，或者使其解凍后按照處理新鮮組 織的方式進(jìn)行常規(guī)操作，而不影響RNA的質(zhì)量。綜上所述，本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑能夠成功維持RNA的完整性，大大提高了 RNA相關(guān)科學(xué)研究的工作效率。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖1是經(jīng)本發(fā)明保護(hù)劑處理和未經(jīng)處理的樣本中提取的總RNA的電泳圖；圖2是經(jīng)本發(fā)明保護(hù)劑處理和未經(jīng)處理的樣本中提取的總RNA的峰圖；上述圖1中，從第1-12條道的樣本分別對(duì)應(yīng)為1—0小時(shí)；2—無(wú)保護(hù)劑室溫下1小時(shí)，3—無(wú)保護(hù)劑室溫下4小時(shí)，4—無(wú)保護(hù)劑室溫下24小時(shí)，5-無(wú)保護(hù)劑室溫下1周；6—無(wú)保護(hù)劑4°C下3個(gè)月； 7—本發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下1小時(shí)，8—本發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下4小時(shí)，9一本 發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下24小時(shí)，10-本發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下1周，11-本發(fā)明的保護(hù)劑 中4°C下3個(gè)月，12—標(biāo)記條帶(ladder)。上述圖2中， Ohr-O小時(shí)；Ihr-RT-無(wú)保護(hù)劑室溫下1小時(shí)，4hr_RT—無(wú)保護(hù)劑室溫下4小時(shí)， 24hr-RT—無(wú)保護(hù)劑室溫下24小時(shí)，Iweek-RT-無(wú)保護(hù)劑室溫下1周；3m0nth-4C—無(wú)保 護(hù)劑4°C下3個(gè)月；lhr-RT-sto—本發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下1小時(shí)，4hr-RT-sto—本發(fā)明的保護(hù)劑中 室溫下4小時(shí)，24hr-RT-sto—本發(fā)明的保護(hù)劑中室溫下24小時(shí)，7day-RT-St0—本發(fā)明的 保護(hù)劑中室溫下1周，3m0nth—st0 4C—本發(fā)明的保護(hù)劑中4°C下3個(gè)月，ladder—標(biāo)記 條帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟1)、配制 pH 為 8.0 的 Tris-EDTA稱(chēng)取Imol的Tris和0. Olmol的EDTA，溶解于800ml的18. 2M歐姆的去離子水中， 用直徑2cm的攪拌子在磁力攪拌器中300rpm攪拌，直至固體全部溶解，然后用移液槍緩慢 加入0. IM的HCl溶液，每加50ul左右的HCl溶液，就在25度的室溫下，用pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)， 直至PH為8.0為止。再加18. 2M歐姆的去離子水，用容量瓶定容至1000ml。2)、配制(NH4) 2S04 溶液稱(chēng)取4mol的(MM)2SO4用18. 2M歐姆的去離子水定容至IL ；用直徑2cm的攪拌子 在磁力攪拌器中300rpm攪拌，直至(NH4) 2S04全部溶解；得(NH4)2S04溶液。3)、配制穩(wěn)定液在700ml的(MM)2SO4溶液中加入200ml pH為8. 0的Tris-EDTA，然后用移液槍 緩慢加入0. IM的NaOH溶液，每加一滴NaOH，攪拌均勻后，在25度的室溫下，用pH計(jì)進(jìn)行檢 測(cè)，直至PH為8. 15為止。再加18. 2M歐姆的去離子水，用容量瓶定容至1000ml。得離體組 織穩(wěn)定保護(hù)劑。實(shí)驗(yàn)1、一、獲取臨床樣本，并設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)比組取balb/c小鼠，斷頸處死，以手術(shù)剪剪開(kāi)胸腔，切取肝臟組織，并分成11份，每份 切成0. 5cm3大??；得11份組織樣品。立即進(jìn)行以下操作以1. 5ml的離心管作為容器，將上述任意5份組織樣品分別浸潤(rùn)在4度預(yù)冷的實(shí) 施例1所得的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑中(每0. 5g的組織樣品對(duì)應(yīng)5. Oml的離體組織穩(wěn)定保 護(hù)劑)；4份在室溫中保存，1份在4°C保存；分別在第1小時(shí)、第4小時(shí)、第24小時(shí)和1周對(duì) 室溫中保存的組織樣品進(jìn)行RNA的提取，在3個(gè)月對(duì)4°C保存的組織樣品進(jìn)行RNA的提??； 從而分別獲得5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。同理，以1. 5ml的離心管作為容器，直接將上述任意5份組織樣品分別放入離心管 中；4份在室溫中保存，1份在4°C保存；分別在第1小時(shí)、第4小時(shí)、第24小時(shí)和1周對(duì)室溫中保存的組織樣品進(jìn)行RNA的提取，在3個(gè)月對(duì)4°C保存的組織樣品進(jìn)行RNA的提取；從 而分別獲得5個(gè)對(duì)比組。將第11份樣品當(dāng)場(chǎng)實(shí)時(shí)進(jìn)行RNA的提取(即對(duì)應(yīng)0小時(shí))，作為標(biāo)準(zhǔn)組；二、按照常規(guī)方法對(duì)RNA進(jìn)行提取可利用Qiagen公司的RNeasy Mini Kit貨號(hào)74104，從而提取各個(gè)組織中的RNA。三、利用Agilent 2100Nano6000kit (步驟中所有kit均可從安捷倫公司購(gòu)得，貨 號(hào)1511-6012)，檢測(cè)不同時(shí)間段提取的RNA。檢測(cè)結(jié)果如圖1顯示下圖顯示6個(gè)時(shí)間段(0小時(shí)，1小時(shí)，4小時(shí)，24小時(shí)，1周， 3個(gè)月)，經(jīng)本發(fā)明穩(wěn)定保護(hù)劑保護(hù)和未經(jīng)本發(fā)明穩(wěn)定保護(hù)劑保護(hù)的樣本中提取的總RNA的 電泳圖?？俁NA中的rRNA總RNA的90%以上，而完整的rRNA由1800bp的18S和4000bp 左右的28S構(gòu)成，因此，完整的總RNA —般只有兩條清晰的條帶，而一旦RNA發(fā)生降解后，條 帶就會(huì)發(fā)生彌散，并降解成多條帶。圖1和圖2顯示，未經(jīng)本發(fā)明保護(hù)的樣本的RNA，在4小時(shí)就開(kāi)始出現(xiàn)較淡的彌散 條帶，室溫下24小時(shí)以及4度下3個(gè)月，28S基本降解完畢；而有本發(fā)明的穩(wěn)定劑保護(hù)的 RNA,即使在室溫下放置1周，或4度下放置3個(gè)月，條帶依然清晰。以不同小鼠重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)1，結(jié)論相同。以人體的胃部組織替代上述實(shí)驗(yàn)1的小鼠肝臟組織，其余類(lèi)同實(shí)驗(yàn)1 ；結(jié)論是未 經(jīng)本發(fā)明保護(hù)的樣本的RNA室溫下4小時(shí)即出現(xiàn)降解；而有本發(fā)明的穩(wěn)定劑保護(hù)的樣本 RNA，在室溫下放置1周沒(méi)有出現(xiàn)降解現(xiàn)象。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑，其特征是包括以下步驟1)、配制pH為7.8～8.2的Tris-EDTA；2)、配制摩爾濃度為3.8～4.2mol/L的(NH4)2SO4溶液；3)、在680～720ml步驟2)所得的(NH4)2SO4溶液中加入步驟1)所得的Tris-EDTA180～220ml，然后于攪拌狀態(tài)下滴加0.08～0.12M的NaOH溶液，直至pH為8.1～8.2；再用18.2M歐姆的去離子水定容至1000ml；得離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法，其特征是所述Tris-EDTA 和(NH4)2S04溶液中均以18. 2M歐姆的去離子水作為溶劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑的制備方法，其特征是所述pH為 8. 0的Tris-EDTA的制備方法如下將0. 5 Imol的Tris和0. 002 0. Olmol的EDTA溶解于800ml的18. 2M歐姆的去離 子水，利用0. IM的HCl溶液調(diào)節(jié)pH為8. 0 ；然后用18. 2M歐姆的去離子水定容至IOOOml ； 得 PH 為 8. 0 的 Tris-EDTA。
4.如權(quán)利要求1 3中任意一種方法制備而得的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑，包括以下步驟1)配制pH為7.8～8.2的Tris-EDTA；2)配制摩爾濃度為3.8～4.2mol/L的(NH4)2SO4溶液；3)在680～720ml的(NH4)2SO4溶液中加入Tris-EDTA 180～220ml，然后于攪拌狀態(tài)下滴加0.08～0.12M的NaOH溶液，直至pH為8.1～8.2；再用18.2M歐姆的去離子水定容至1000ml；得離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑。本發(fā)明的離體組織穩(wěn)定保護(hù)劑能在常溫下保護(hù)離體組織的RNA不被降解。
文檔編號(hào)A01N1/02GK101816299SQ20101016141
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2010年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月29日
發(fā)明者吳箭, 姜超, 宓婭娜, 洪旭濤, 王珺, 陳瑩瑩 申請(qǐng)人:杭州銳創(chuàng)生物技術(shù)有限公司