專利名稱：植物耐逆性相關蛋白TaDREB4B及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關蛋白TaDREB4B及其編碼基因和應用。
背景技術：
干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對逆境條件的應答與信號傳導機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務之一。在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。在干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平上做出相應的調整，以最大程度上減少環(huán)境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節(jié)其它相關基因的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環(huán)境的抗性。與脅迫相關的基因產物可以分為兩大類第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調節(jié)因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等)合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物；第二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節(jié)的蛋白因子，如蛋白激酶、轉錄因子等。其中，轉錄因子在植物脅迫應答的基因表達調控中起著重要作用。轉錄因子也稱為反式作用因子，是能夠與真核基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性作用的DNA結合蛋白，通過它們之間以及與其它相關蛋白之間的相互作用，激活或抑制轉錄。轉錄因子的DNA結合區(qū)決定了它與順式作用元件結合的特異性，而轉錄調控區(qū)決定了它對基因表達起激活或是抑制作用。此外，其自身活性還受到核定位及寡聚化等作用的影響。目前已知在植物中與脅迫相關的轉錄因子主要有具有AP2結構域的 AP2(APETALA2)/EREBP (乙烯應答元件結合蛋白，ethylene responsive element bindingprotein)轉錄因子家族、含有堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈的bZIP (basic region/ leucinezipper motif transcription factors)類轉錄因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY轉錄因子家族、含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉鏈的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MTO家族。這五個轉錄因子家族，除WRKY家族不參與植物的水脅迫反應外，其它四個家族均參與調節(jié)植物對干旱、高鹽和低溫等的逆境脅迫反應。其中， AP2/EREBP類轉錄因子在高等植物中廣泛存在，它是植物所特有的一類轉錄因子，近年來， 在擬南芥、煙草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有報道，這表明AP2/EREBP類轉錄因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。DREB (脫水應答元件結合蛋白，DRE-binding protein)類轉錄因子是AP2家族中 EREBP-Iike亞家族中的一個成員。DREB和EREBP類轉錄因子在氨基酸序列上沒有顯著的相同性，但都含有一段非常保守的由58個左右氨基酸組成的DNA結合區(qū)域(EREBP/AP2結構域)。蛋白質三維分析表明，該區(qū)域含有3個折疊，對識別各類順式作用元件起關鍵作用。其中位于第二個折疊中的第14、19位的兩個氨基酸殘基的差異，決定這類轉錄因子與不同順式作用元件的特異結合。DREB類轉錄因子第14位氨基酸是纈氨酸(V14)，第 19位氨基酸是谷氨酸(Ε19)，其中第19位的氨基酸并不保守，例如水稻的OsDREBI轉錄因子的第 19 位氨基酸就是纈氨酸(Dubouzet JG, Sakuma Y, Ito Y, Kasuga M, Dubouzet EG, Miura S, Seki Μ, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K, 2003) 在 DREB 相關蛋白中決定 DNA結合的特異性方面，V14的作用明顯要比Ε19重要(Sakuma Y,Liu Q,Dubouzet JG,Abe H, Shinozaki K andYamaguchi-Shinozaki K, 2002)；而 ERF 類轉錄因子第 14 位氨基酸是甘氨酸，第19位是天冬氨酸，因而DREB特異結合DRE/CRT順式元件，ERF特異結合GCC-盒。 AP2/EREBP結構域的C-端區(qū)還包含1個由18個氨基酸殘基組成的核心序列，該序列形成雙親性的α-螺旋，該α-螺旋可能參與同其它轉錄因子及DNA間的相互作用。目前，在許多植物中都發(fā)現(xiàn)含有EREBP/AP2結構域的轉錄因子，并分別與抗病、抗逆等信號傳遞有關(劉強，趙南明，Yamaguchi-Siinozaki K, Shinozaki K, 2000) 劉強等認為，一個DREB基因可以調控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關的功能基因的表達(劉強，趙南明，Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K, 2000) Kasuga 等的研究證實， 導入到擬南芥的DREBlA基因可以同時促進與逆境脅迫耐性有關的基因rd29、rdl7、kinl、 cor6. 6、corl5a以及erdlO的表達，轉基因植株的抗逆性大大增強(Kasuga M，Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K.，1999)。同樣，低溫耐性轉錄因子 CBFl 的轉基因植株的耐低溫能力有顯著提高(Jaglo-OttosenKR，Gilmour SJ, Zarka DG, Schabenberger O, Thomashow MF.，1998)。由于植物的逆境耐性是由多基因調控的復雜性狀，依靠導入單個功能性蛋白基因很難實現(xiàn)植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個關鍵性轉錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經成為植物抗逆基因工程的研究熱點。根據(jù)含DNA結合區(qū)的數(shù)目，AP2/EREBP轉錄因子分為AP2 (APETALA2)和乙烯應答元件結合蛋白 EREBP (ethylene-responsive element binding protein)以及 RAV 三個大類型。AP2型轉錄因子包括擬南芥的AP2、ANT，玉米的Glossy、idsl等。這種類型的轉錄因子含有兩個AP2/EREBP結構域，調節(jié)細胞的生長發(fā)育，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)14個AP2型轉錄因子基因；EREBP型轉錄因子僅含1個AP2/EREBP結構域，調節(jié)植物對激素(乙烯)、病原、低溫、干旱及高鹽等地分子應答反應。EREBP型轉錄因子中，已發(fā)現(xiàn)有煙草EREBP1-4、 番茄 Pti4-6、擬南芥 RAV1-2、AtEBP、AtERF 1-5、DREBlA-C (CBF1-3)和 DREB2A-B 等許多成員，分別與細胞發(fā)育、激素、抗病、低溫及干旱、高鹽等信號傳遞有關。這些EREBP型轉錄因子又可以再分為EREBP (ethylene-responsive element binding protein,艮口 ERF)亞組，包括煙草EREBP1-4、番茄Pti4-6、擬南芥AtEBP、AtERFl_5、這類轉錄因子與含核心序列AGCCGCC的GCC-盒特異結合，因此，它的DNA結合區(qū)又稱為GCC-盒結合域(GCC_box binding domain，GBD)，其中第2個G、第5個G、第7個C對ERF蛋白的識別有重要作用(Hao D，Ohme-Takagi M，Sarai A，1998)。用核磁共振對其三維空間結構的研究表明，AtERFl的 GBD通過形成3個反向的β -片層與其靶序列GCC-盒的大溝相結合；DREBP亞組，包括擬南芥DREBlA-C (CBFlD和DREB2A-B，這類轉錄因子在干旱、高鹽、低溫下特異結合干旱應答元件DRE/CRT，在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)IM個DREBP型轉錄因子基因；RAV型轉錄因子包括擬南芥RAVI、RAV2、含有兩個不同的DNA結合區(qū)-ERF/AP2和B3，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)6個RAV型轉錄因子基因。還有一類特殊的轉錄因子AL079349，它與以上的轉錄因子都不同，自
成一類。最近發(fā)現(xiàn)EREBl5s蛋白參與了干旱、高鹽和低溫脅迫的信號傳導和基因表達調控。 Mine等人從低溫儲藏的土豆塊莖中分離到了 EREBP轉錄因子CLP353，受低溫脅迫誘導強烈表達(Mine Τ, Hiyoshi Τ, Kasaoka K, Ohyama Α，2003)，說明可能有 EREBP 蛋白參與了受低溫脅迫的基因表達調控。Park等利用西紅柿為材料，得到了受高鹽、乙烯或茉莉酸誘導表達的 EREBP 轉錄因子 iTsi 基因，EMSA(Electrophoretic mobilityshift assays)試驗分析發(fā)現(xiàn)，Tsi蛋白與GCC-box和DRE/CRT順式元件都能結合(ParkJM，Park CJ, Lee SB, Ham BK, Shin R，Paek KH，2001)，盡管前者結合能力大于后者，但說明，某些EREBP蛋白能激活受滲透脅迫誘導表達的基因。在正常生長條件下，Tsi基因的超量表達提高了轉基因植株 (35S: :Tsil)的耐鹽性、增強了抗病性(ParkJM，Park CJ, Lee SB,Ham BK, Shin R，Paek KH, 2001)，以上說明了 Tsi基因可能參與了生物脅迫和非生物脅迫兩條信號傳導途徑。由高鹽脅迫激活的一條類MAPK信號傳遞模式(包括SIMKK和SIMK)，將脅迫信號傳遞給EIN2 (在乙烯信號傳遞途徑的CTRl下游)(Guo HW and Ecker J，2004)，最后激活某些EREBI3s轉錄因子，調控滲透脅迫相關基因的表達，提高植物的耐鹽性。對于是否存在含GCC-box元件， 且表達產物直接參與非生物脅迫響應的基因，還有待作進一步的證實。綜合目前的研究結果，植物在逆境脅迫條件下的信號傳遞途徑至少有以下六條途徑(1)依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導，激活MYB、MYC類轉錄因子基因，調控具有MYBR或MYCR順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導，激活ABF/AREB類轉錄因子基因，調控具有ABRE順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽誘導，激活CBF4，DREB1類轉錄因子基因，調控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因。(2)不依賴于ABA的信號傳遞途徑有三條受干旱、高鹽誘導，激活DREB2類轉錄因子基因，調控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受低溫誘導，激活CBF1-3/DREB1A-C類轉錄因子基因，調控具有DRE/CRT順式作用元件的靶基因；受干旱、高鹽或乙烯誘導，激活ERF類轉錄因子基因，調控具有DRE/CRT 或GCC順式作用元件的靶基因。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白TaDREB4B及其編碼基因和應用。本發(fā)明提供的蛋白質，為一種脫水應答元件結合蛋白，來源于小麥屬小麥 (Triticum aestivum L·)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。序列1所示蛋白質由346個氨基酸殘基組成，自氨基端第沈位-33位氨基酸殘基序列和第63位-67位氨基酸殘基序列為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第89位-147 位氨基酸殘基序列為保守的AP2/EREBP結構域。為了使(a)中的TaDREB4B便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的TaDREB4B可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得至IJ。上述(b)中的TaDREB4B的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5' 端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5，端第1 至1168位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第1 至1193位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的DNA分子。所述嚴格條件為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列2所示cDNA序列由1494個核苷酸組成，該基因的開放閱讀框架為自5'端第 1 位-1168位核苷酸。含有所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA 片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導 (Ti)質?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、 玉米的泛素啟動子⑴biquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外， 使用本發(fā)明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的， 可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。所述重組表達載體具體可為YEP-GAP-TaDREB4B、pBI121_TaDREB4B或 pAHC25-TaDREB4B ；所述YEP-GAP_TaDREB4B為將所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點得到的重組質粒。所述YEP-GAP-TaDREB4B優(yōu)選為將序列表的序列2自5，端第1 至1193位核苷酸所示的DNA片段插入YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒。所述pBI121_TaDREB4B為將所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒。 所述pBI121-TaDREB4B優(yōu)選為將序列表的序列2自5，端第1 至1193位核苷酸所示的 DNA片段插入pBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒。所述pAHC25_TaDREB4B為將所述基因插入pAHC25的多克隆位點得到的重組質粒。 所述pBI121-TaDREB4B優(yōu)選為將序列表的序列2自5，端第1 至1193位核苷酸所示的 DNA片段插入pAHC25的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質粒。本發(fā)明還保護一種培育轉基因植物的方法，是將所述基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達載體導入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接 DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規(guī)生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。所述耐逆性可為耐非生物脅迫或抗病。所述耐非生物脅迫具體可為耐旱和/或耐鹽和/或耐高溫(如43°C )。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥(如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)、小麥(如濟麥19)等。所述耐旱可體現(xiàn)為如下⑴和/或(II)(I)所述轉基因植物的脯氨酸含量和/或可溶性總糖含量和/或過氧化物酶活性和/或光合速率高于所述目的植物；(II)干旱條件下，所述轉基因植物的株粒重和/或千粒重高于所述目的植物；所述抗病可為抗白粉病，具體可為抗由白粉病病原菌E09引起的白粉病。本發(fā)明還保護所述蛋白作為轉錄因子的應用。本發(fā)明的TaDREB4B在干旱、高鹽、高溫、低溫、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA的誘導下表達，并且可以特異的調控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉錄表達； 提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐高溫性，以及對白粉病病原菌的抗性。本發(fā)明的TaDREB4B為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發(fā)揮重要的作用。


圖1為TaDREB4B與小麥TaDREB氨基酸序列的同源性比對結果。圖2為TaDREB4B受脅迫誘導表達的實時熒光定量PCR圖譜；A 脫落酸處理；B 乙烯處理；C 高溫處理；D 茉莉酸甲酯處理；E 冷害處理；F 鹽漬處理；G 干旱處理；H 水楊酸處理；I :白粉病病原菌處理。圖3為酵母單雜交系統(tǒng)證明轉錄因子體內結合特異性和激活特性的原理示意圖。圖4為野生型和轉基因擬南芥的抗旱性比較。圖5為野生型和轉基因擬南芥的耐鹽性比較。圖6為野生型和轉基因擬南芥的耐高溫性比較。圖7為野生型和轉基因小麥的抗旱指標比較；A 脯氨酸含量；B 可溶性總糖含量；C:P0D酶活性；D:SPAD值。圖8為野生型和轉基因小麥對白粉病病原菌的耐性比較。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。實施例1、TaDREB4B的克隆一、mRNA 的分離將水培的生長10天左右的小白麥(國家種質資源庫，編號ZMM2)三葉期幼苗干旱處理2小時，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩２捎肣uikpr印Micro mRNA Purification Kit (Pharmacia)進行 mRNA 的分離。二、cDNA文庫的構建及滴度測定l、cDNA文庫的構建采用Timesaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia)將步驟一得到的 mRNA 合成 cDNA雙鏈，并力口EcoRI/NotI adaptor ；采用 ZAP Express Predigested Gigapack IIIGold Cloning Kit(Stratagene)進行cDNA文庫的構建，共得到500ul庫液。2、滴度的測定(1)取 Iul 庫液用 SM Buffer 稀釋 1000 倍；(2)分別取Iul、IOul、IOOul稀釋液至三個IOml離心管中，分別加IOOul感受態(tài)宿主菌 XLl-Blue MRF，(OD600 為 1. 0)，于 37°C溫浴 20min ；(3)分別加入3ml頂膠(50°C )混勻，立即鋪于固體NZY平板上，凝固后倒置，37°C 培養(yǎng)過夜；(4)根據(jù)平板噬菌斑數(shù)，求平均值，即為庫容量。
計算公式mmm ^ χ稀釋因子 ιηηη 171 噬菌體稀釋液的體積(ul)經計算，該cDNA文庫的滴度為3. 0 X IO6個噬菌斑。
三、cDNA文庫的篩選1、探針的準備根據(jù)已克隆的DREB基因的AP2保守區(qū)序列設計引物WAPF和WAPR，以普通小麥的 cDNA為模板進行PCR擴增。WAPF :5，-ACC GCG GTG TGA GGC AGA GGA-3，；WAPR 5' -TGA GAA GTT GAC ACG TGC TTT GGC-3，。PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳。2、探針的回收采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV805A)回收純化180bp位置的條帶(探針)。3、轉膜(1)取Iul步驟二的1的庫液，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)噬菌體，大概6. OX l(fpfu ；(2)噬菌斑培養(yǎng)好后放在4°C冷卻，臨用時取出置于超凈臺吹干，防止轉膜時頂膠被膜粘起；(3)將Hybrond-N+膜剪成圓形，比直徑為150mm的培養(yǎng)皿稍小，用鉛筆在膜上表明編號及日期(與培養(yǎng)皿對應)；(4)用鑷子夾住膜兩邊，有字面朝上，中間先接觸平板，慢慢松開，不要移動，不要有氣泡，使膜自然攤平，完全攤平后，計時；(5)用注射器針頭在膜上扎三個不對稱的孔，在培養(yǎng)皿背面對應的位置用記號筆做好標記；(6) ;3min后，用鑷子從一邊開始輕輕揭起膜，不要帶起頂膠；(7)將膜迅速放入盛有變性液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml變性液)變性 7min，有字面朝下，注意避免溶液到達膜的上表面；(8)將膜轉移至盛有中和液的培養(yǎng)皿中(放一層濾紙及15ml中和液)中和兩次， 每次3min ；(9)然后將膜轉入漂洗液中洗30min，可輕輕搖動；(10)取出膜，在干凈的濾紙上吸干，有字面朝下；(11)用保鮮膜將膜包好，在紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)lmin，4°C存放備用；4、預雜交和雜交反應65°C預雜交5_6h (新膜)；探針標記完后，加入NaOH溶液，混勻后于室溫靜置 IOmin使探針變性，然后65°C雜交過夜。5、洗脫在55°C _65°C條件下洗膜。用濾紙吸干洗好的膜，保鮮膜包好，壓X-光片。6、陽性克隆的二輪篩選(1)將X光片與膜對齊，確定位置，描下膜上的三個不對稱點的位置；(2)在讀片機上放上X光片及相應的培養(yǎng)皿，根據(jù)不對稱點使培養(yǎng)皿定位；C3)用去頭的Iml槍頭取出確定的陽性雜交斑，放在Iml SM緩沖溶液中，加入50ul 氯仿；(4)振蕩30秒，室溫放置1小時，離心，取上清；
(5)取10-50ul上清再次鋪板，培養(yǎng)噬菌體進行二次篩選；(6) 二次篩選的步驟同上轉膜、預雜交和雜交反應、洗脫、壓X-光片，得到單個陽性噬菌斑。四、得到 TaDREB4B1、集群內刪除(Mass excision)(1)制備 XLl-Blue MRF’ 和 XLOLR 菌；用液體 LB 培養(yǎng)基培養(yǎng) XLl-Blue MRF’ 和 XLOLR菌，30°C過夜，培養(yǎng)基中添加0.2%麥芽糖、IOmM MgSO4和抗生素，分別為12. Syg/ml 四環(huán)素和50 μ g/ml卡那霉素；第二天，1000 X g離心IOmin收集菌體，用IOmM MgSO4重懸， 使 OD6tltl 達到 1. 0 ；(2)在一個IOml的無菌離心管中加入1 μ 1庫液(約含6. 0 X IO3噬菌體顆粒)XLl-Blue MRF，200 μ 1 (OD600 為 1. 0)ExAssist 助手噬菌體2 μ 1 ( > 1 X 1010pfu/ml)(3)37°C溫育 l5min ；(4)加入20ml液體NZY培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5_3h ；(5) 65-70 "C 加熱 20min ；(6) 1000 Xg離心lOmin，上清移至一個新管中；(7)在一個1. 5ml的離心管中混合200 μ 1 XLOLR菌和1 μ 1上清；(8)37°〇溫育15111土11;(9)取10 μ 1、100 μ 1菌液分別涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50 μ g/ml)上，37°C培養(yǎng)過夜。2、cDNA文庫插入片段的檢查(1)隨機挑取步驟1中集群內刪除的單菌落，提取它們的質粒DNA ；(2)用限制內切酶EcoR I (Takara)消化，反應體系10 μ 1 IOX 緩沖液 H1μ 1EcoR I(12U/y 1)0. 5 μ 1質粒DNA2 μ 1ddH206. 5 μ 1(3) 37°C消化》ι，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)95%以上的載體有插入片段，說明 95%以上的噬菌體含有重組子，因此文庫實際含有的重組子為2. 85X 106(cDNA文庫的滴度為3. OX IO6)。50%以上的重組子的插入片段在800bp-4Kb之間，說明構建的文庫較完整。3、單克隆內刪除(Single-clone excision)(1)將得到單個陽性噬菌斑從平板上摳下，放入到一個無菌的、已加有500μ 1 SM 緩沖液和20 μ 1氯仿的離心管中，漩渦振蕩10seC，4°C儲存；(2)用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)XLl-Blue MRF，和XLOLR菌，30°C過夜，培養(yǎng)基中添加 0. 2% (w/v)麥芽糖、IOmM MgSO4和抗生素，分別為12. 5 μ g/ml四環(huán)素和50 μ g/ml卡那霉素；(3)第二天，1000 Xg 離心 IOmin 收集菌體，用 IOmM MgSO4 重懸，使 OD6tltl 達到 1. 0 ；(4)在一個IOml的無菌離心管中加入
XLl-Blue MRF，噬菌體貯存液ExAssist助手噬菌體
200 μ 1 (OD600 為 1. 0) 250 μ 1 (至少含1 X IO5噬菌體顆粒) 1 μ 1 ( > 1 X 1010pfu/ml)(5)37°〇溫育15111士11;(6)加入3ml液體NZY培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)2. 5_3h ；(7)于 65-70°C水浴離心管 20min，然后 IOOOXg 離心 15min ；(8)將上清移至一個新的離心管中，即為噬菌粒懸浮液；(9)在一個1. 5ml的離心管中加入200 μ 1步驟(3)制備好的XLOLR菌和步驟(8) 制備好的噬菌粒懸浮液100 μ 1，再加入300 μ 1液體NZY培養(yǎng)基，37°C溫育45-60min ；(10)取50 μ 1菌液涂于LB固體培養(yǎng)基(含氨芐50 μ g/ml)上，37°C培養(yǎng)過夜；(11)第二天挑取陽性克隆，用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質粒，用EcoRI酶切， 電泳檢測插入片段長度。(12)選取插入片段大于SOObp的克隆進行測序，在ABI733測序儀 (GenecoreBiological Company)上，采用雙脫氧核苷酸鏈終止法測定序列，將得到的全序列與EMBL Bank以及GENEBANK等核苷酸數(shù)據(jù)庫比較，用DNASIS軟件進行分析。發(fā)現(xiàn)18號克隆有一個保守的AP2/EREBP結構域。且基因結構完整。(13)分析18號克隆的核苷酸序列及對應的氨基酸序列，得到序列表中序列2所示的核苷酸序列。將序列表的序列1所示的蛋白命名為TaDREB4B蛋白，由346個氨基酸殘基組成。 序列1中的自氨基端第26位-33位氨基酸殘基和第63位-67位氨基酸殘基為兩個可能的核定位信號區(qū)，自氨基端第89-147位氨基酸殘基為保守的AP2/EREBP結構域。TaDREB4B蛋白的同源序列比對結果如圖1所示(黑框表示一致的氨基酸部分)，TaDREB4B與已報道的小麥TaDREB(AAL01124)只有34. 97%的同源性，說明TaDREB4B是一個新發(fā)現(xiàn)的小麥蛋白。 將TaDREB4B蛋白的編碼基因命名為TaDREB4B基因，其開放閱讀框架為自序列表的序列2 的5'端第1 位-1168位核苷酸。實施例2、實時熒光定量PCR分析TaDREB4B的表達特性一、進行各種脅迫處理苗齡為10天的小白麥幼苗，進行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后取出材料，用液氮速凍，-80 °C
保存?zhèn)溆谩?2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2%的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl 與Na2SO4W質量百分比為3 2)中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、M小時后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?3)脫落酸處理將小麥幼苗置于200 μ M的脫落酸(ABA)水溶液中，光照培養(yǎng)30 分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存 (4)白粉病病原菌處理將小麥幼苗接種白粉病菌株，光照培養(yǎng)3小時、6小時、12 小時、2天、3天、4天、5天后，取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> (5)冷害處理將小麥幼苗置于4°C培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?6)茉莉酸甲酯處理將小麥幼苗置于50 μ M的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80 V
保存?zhèn)溆谩?7)乙烯處理小麥幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?8)水楊酸處理將小麥幼苗置于50 μ M的水楊酸(SA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、 1小時、2小時、4小時、8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?9)高溫處理將小麥幼苗置于42°C下，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時、2小時、4小時、 8小時、12小時、24小時后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?10)對照的處理直接取未經任何處理的小麥幼苗_80°C凍存作為對照(0小時)。二、mRNA 的分離Quikprep Micro mRNA Purification Kit(Pharmacia) πΛΝΑ 白勺^>畠。三.反轉錄為cDNA采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase (TIANGEN)將純化的 mRNA 反轉錄為 cDNA。四、實時熒光定量PCR根據(jù)TaDREB4B序列，在其可變區(qū)設計特異引物TaDREB4BRTF和TaDREB4BRTR。以 actin為內參基因，引物為actin-2F和actin_2R。TaDREB4BRTF :5’ -GATGTGTTCGAGCCATTGGAG-3，；TaDREB4BRTR 5，-TGGTCCAAGCCATCCAGGTAG-3，。actin-2F:5，-CTCCCTCACAACAACCGC—3，；actin-2R :5，-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3，。TaDREB4B對各個脅迫及激素表現(xiàn)出響應，見圖2。實施例3、TaDREB4B的激活特性用酵母單雜交系統(tǒng)證明轉錄因子的激活特性的主要原理如圖3所示，將DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件分別構建到pHISi-Ι載體和pLacZi載體的基本啟動子Pmin (minimal promoter)上游，Pmin啟動子下游連接報道基因(His3、LacZ和URA3)。 當連接有編碼轉錄因子的目的基因的表達載體YEP-GAP (不含激活功能)分別轉化到連有 DRE順式作用元件和突變體DRE順式作用元件的酵母細胞后，如果連有突變體DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因不能表達，而連有特定的DRE順式作用元件的酵母細胞中的報道基因能夠表達，說明該轉錄因子能與DRE順式作用元件結合，且具有激活功能，激活了 Riiin啟動子，促使報道基因表達。從而證明目的轉錄因子的體內結合特異性和激活功能。YEP-GAP 中國農業(yè)科學院作物科學研究保證向公眾提供；參考文獻Liu Q， KasugaM, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Two transcriptionfactors, DREBl and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate twocellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression, respectively,in Arabidopsis,Plant Cell 1998Aug ； 10(8) :1391-1406。YPD液體培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)用酵母抽提物(Bacto-Yeast Extract) 10g/L,細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨(Bacto-Ρ印tone)20g/L，調節(jié)pH至5. 8，121°C/15min滅菌，降至60°C以后加入40%的Glucose，使其終濃度為20g/L。SD/His-Z^ra-Ztrf選擇性培養(yǎng)基不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base) 6. 7g/L，營養(yǎng)缺陷型混合物(drop-out media without His/Ura/Trp) 100ml，瓊脂粉 (Bacteriological agar) 20g/L，調節(jié) pH 至 5. 8，121 °C /15min 滅菌，降至 60°C后加入 40% Glucose，使其終濃度為20g/L。營養(yǎng)缺陷型混合物(Drop-outmix) =(IOX) :L_Isoleucine (異亮氨酸)300mg/L， L-Valine (纈氨酸)1500mg/L，L-Adenine (腺嘌呤)200mg/L, L-Arginine (精氨酸)200mg/ L, L-Histidine Hcl monohydrate (MMM) 200mg/L, L-Leucine (^tMM) lOOOmg/L, L-Lysine Hcl (賴氨酸)300mg/L，L-Methionine (甲硫氨酸)200mg/L，L-Phenylalanine (苯丙氨酸)500mg/L，L-Threonine (蘇氨酸)2000mg/L，L-Tyrosine (酪氨酸)300mg/L。lXPEG/LiAc 50% PEG3350 8ml, IOXTE buffer lml, IOXLiAc 1ml。IOXTE Buffer =IOOmM Tris-Hcl, IOmM EDTA、pH = 7. 5，121°C高壓滅菌，室溫保存。ΙΧΤΕ/LiAc =IOXTE buffer lml, IOXLiAc lml, ddH20 8ml。Z Buffer :Na2HPO4 · 7H20 16. lg/L, NaH2PO4 ‘ H2O 5. 5g/L, KCl 0. 75g/L, MgSO4 · 7H200. 246g/L，調節(jié) pH 至 7. 0，121°C /15min 滅菌，4°C保存。X-gal 儲存液(X-gal Stock Solution)用 N，N-dimethyl-formamide (DMF)溶解 X-gal，使其終濃度為20mg/ml，-20°C貯存。含有X-gal 的 Z buffer 緩沖液 100ml (Ζ buffer with X-gal)，現(xiàn)用現(xiàn)配 Z buffer98ml, β-巰基乙醇(β -mercaptoethanol) 0. 27ml, X-gal 儲存液(X-gal stocksolution)1. 67ml。10 X LiAc =Clontech 公司。一、重組表達載體的構建1、獲得TaDREB4B基因的獲得根據(jù)TaDREB4B基因的序列設計引物TaDREB4B_EI和TaDREB4B_XI，引物末端分別引入EcoRI和BioI酶切位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增獲得TaDREB4B基因。TaDREB4B-EI :5，-GGGGAATTCATGACGGTAGATCGGAAGGAC-3，；TaBREB4B-XI 5’ -GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG-3 ’。PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2· O (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化1. 1Kb左右的PCR產物。2、重組表達載體的構建①用限制性內切酶EcoRI和BioI酶切步驟1回收純化的PCR產物，回收酶切產物；②用限制性內切酶EcoRI和BioI酶切表達載體YEP-GAP，回收載體骨架；
③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產物電擊轉化JM109菌株(Clontech公司購買)，37 °C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒YEP-GAP-TaDREB4B (在 YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5，端第128-1193位核苷酸所示的DNA片段)。二、TaDREB4B的體內結合特異性和激活特性的驗證1、酵母報道子的構建(1)正常雙重酵母報道子的構建DNA 片段 A (含 4 個 DRE 元件)5，-GAATTC-DRE-DRE-DRE-DRE-GTCGAC-3，(DRE 的核心序列TACCGACAT)。DNA片段A的核苷酸序列見序列表的序列3。將DNA 片段 A 構建到 pHis-Ι 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)的Rninms3啟動子上游，得到重組載體pHis-1-DRE，用Bio I和Nco I內切酶將 pHi s-1-DRE載體切成線狀。將DNA 片段 A 構建到 pLacZi 載體(MATCHMAKER One-Hybrid System, Clontech 公司)P·啟動子上游，得到重組載體pLacZi-DRE，用)(h0 I和Nco I內切酶分別將 pLacZi-DRE載體切成線狀。先將線狀pHi s-1-DRE載體轉化到酵母細胞(YM4271株系，MATCHMAKER One-HybridSystem, Clontech公司)內，獲得能在SD/His—培養(yǎng)基上正常生長的酵母轉化子(Yeasttransformant)。接著以這種酵母轉化子為寄主細胞，繼續(xù)轉化含線狀 pLacZi-DRE載體。這樣在同時缺乏組氨酸和尿嘧啶的SD/His_/^ra_培養(yǎng)基上，選擇獲得含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE的正常雙重酵母報道子。(2)突變體雙重酵母報道子的構建DNA 片段 B (含 4 個 MDRE 元件)5，-GAATTC-MDRE-MDRE-MDRE-MDRE-GTCGAC-3，(M DRE 將4個DRE元件的核心序列CCGAC突變成TTTTT)。DNA片段B的核苷酸序列見序列表的序列4。用DNA片段B代替DNA片段A，方法同步驟(1)，得到突變體雙重酵母報道子。2、PEG/LiAc法轉化酵母及結果分析(1)接種酵母菌株(YM4271株系)到Iml YPD液體培養(yǎng)基中，劇烈震蕩2分鐘，分散團塊后將懸浮液轉至含有50ml YPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30°C /250rpm搖過夜，測0D600 =1.7-1. 8 (計數(shù)約 4 X IO7 個/mL)；(2)取30ml步驟(1)過夜培養(yǎng)物接到300ml新鮮的YPD培養(yǎng)基中，30°C /250rpm 培養(yǎng)，約3小時(至0D600 = 0. 5士0. 1)，室溫IOOOg離心5min，收集菌體，棄上清，用1/2 體積1 XTE懸浮，1000g/5min離心；(3)吸棄上清，用1. 5ml新鮮配制的1 XTE/LiAc溶液懸浮，振蕩混勻備用；(4)取出0. Iml酵母感受態(tài)進行轉化，依次加下列溶液0. 1 μ g YEP-GAP-TaDREB4B、0. Img ssDNA(鮭魚精 DNA, Sigma)、0· 6mlPEG/LiAc,高速振蕩 1 分鐘， 300C /200rpm振蕩培養(yǎng)30分鐘；(5)加入70ul DMS0(sigma#D8779)，輕輕倒置混勻，42°C熱激30分鐘，其間輕輕振蕩，冰浴2分鐘，室溫IOOOg離心5min ；
(6)吸棄上清，加入0.5ml 1 X TE buffer懸浮細胞；(7)用接種環(huán)蘸取懸浮液，分別在含有0、15mmol/L 3_AT的ΞΟ/Η Γ/^^Λι^選擇性培養(yǎng)基上畫線培養(yǎng)。(8)平板的一半培養(yǎng)正常雙重酵母報道子，另一半培養(yǎng)突變體雙重酵母報道子，以便做對照分析。(9)顛倒放置于培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)3-4天。(10)結果發(fā)現(xiàn)在Ommol/L 3_AT的ΞΟ/Η Γ/^^Λι^的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子和突變的酵母報道子都有生長，但突變的酵母報道子的直徑明顯小；而在15mmol/ L3-AT的SD/His7toa7Trp_的培養(yǎng)基平板上正常的酵母報道子能正常生長，但突變的酵母報道子被抑止沒有生長。3、半乳糖苷酶活性檢測(1)從Ommol/L 3-AT的SD/His-Z^ra—Ztrf的培養(yǎng)基平板上分別挑取正常的酵母報道子和突變的酵母報道子菌落。轉至YPD液體培養(yǎng)基中，于30°C振蕩培養(yǎng)，待長至對數(shù)生長后期，取1. 5ml菌液，3000rpm離心30s ；(2)棄上清，控干管中液體，將離心管置于液氮中速凍lOmin，取出使其自然融解， 加50ul Z/X-gal溶液，30°C溫育，結果發(fā)現(xiàn)正常的酵母報道子在6- 內變藍，而突變的酵母報道子在12h內沒有變化，仍為白色。說明轉錄因子TaDREB4B能與DRE順式作用元件結合，且具有激活功能，激活了 Rnin啟動子，促使報道基因表達。從而證明了 TaDREB4B的體內結合特異性和激活功能。實施例4、TaDREB4B提高了擬南芥的抗旱、耐鹽、耐高溫性一、重組表達載體的構建l、TaDREB4B 基因的克隆根據(jù)TaDREB4B基因的序列設計引物對(TaDREB4B_121F和TaDREB4B_121R)，引物末端分別引入BamHI和BioI酶切識別位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaDREB4B。TaDREB4B-121F 5' -GGGGGATCCATGACGGTAGATCGGAAGGAC-3’ ；TaDREB4B-121R :5’ -GGGCTCGAGATGGTTTGGCCGCCGCAAAG-3，。PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，采用Agarose Gel DNA Purification KitVer. 2. 0 (TaKaRa 公司，Code No. :DV807A)回收純化 1. 1Kb 左右的條帶。2、重組表達載體的構建①用限制性內切酶BamHI和BioI酶切步驟1回收純化的PCR產物，回收酶切產物；②用限制性內切酶BamHI和BioI酶切pBI121 (Clontech公司購買)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產物電擊轉化T0P10菌株(天根生化科技(北京)有限公司購買)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒 pBI121-TaDREB4B(在pBI121的BamHI和XhoI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5， 端第128-1193位核苷酸所示的DNA片段)。二、轉基因植物的獲得
1、用重組質粒pBI121_TaDREB4B轉化農桿菌C58 (Clontech公司購買)，得到重組農桿菌。2、將重組農桿菌接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、3000rpm培養(yǎng)約30小時；3、將步驟2的菌液轉至YEP液體培養(yǎng)基(含50 μ g/L卡那霉素和50 μ g/L利福平)中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(菌液0D600達到1. 5-3. 0)；4、收集菌體，4°C、4000g離心 lOmin，用 10%蔗糖(含0. 02%silwet)稀釋至0D600 約為 0. 8-1. O ；5、將擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型Col-O，SALK公司購買)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進行正常的光照培養(yǎng)，收獲T1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50 μ g/L卡那霉素)陽性植株。將陽性植株進行PCR鑒定，鑒定結果表明，得到的轉基因植株(轉TaDREB4B基因植株)。T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株。三、轉空載體對照植物的獲得用質粒pBI121轉化農桿菌，得到重組農桿菌，用重組農桿菌轉化擬南芥Col-O，得到轉空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉基因植物的耐逆性鑒定分別將T3代轉基因植株、T3代轉空載體對照植株和擬南芥Col-O (各60株)進行耐旱性鑒定、耐鹽性鑒定和耐高溫鑒定。均設置三次重復實驗，結果取平均值。1、耐旱性將正常生長3周的幼苗，連續(xù)27不澆水，第觀天統(tǒng)計成活率。擬南芥Col-O全部死亡，但90%轉基因植株存活且能正常生長(見圖4，A 擬南芥Col-O ；B 轉基因植株)。轉空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。2、耐鹽性將正常生長3周的幼苗，用400mM NaCl澆灌，然后轉移到正?；ㄅ柚羞M行正常管理，2周后統(tǒng)計成活率。擬南芥Col-O幾乎全部死亡，但55%轉基因植株仍然能存活且正常生長(見圖5，A 轉基因植株；B 擬南芥Col-O)。轉空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O 一致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。3、耐高溫將正常生長2周的幼苗，進行高溫處理(43°C )，分別處理2小時、4小時、8小時， 然后常溫恢復生長1周，計算成活率。高溫處理2小時，擬南芥Col-O和轉基因植株的存活率都為100%;高溫處理4小時，擬南芥Col-O的存活率為50%，100%轉基因植株存活且能正常生長；高溫處理8小時，擬南芥Col-O的存活率為30%，55%轉基因植株存活且能正常生長(見圖6)。轉空載體對照植株的表型與擬南芥Col-O —致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。實施例5、TaDREB4B提高了小麥的抗旱性和對病原菌的耐逆性一、重組表達載體的構建1、TaDREB4B 基因的獲得
根據(jù)TaDREB4B基因的序列設計引物對(TaDREB4B_121F和TaDREB4B_121R)，引物末端分別引入SmaI和SpeI酶切位點，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴增TaDREB4B基因。TaDREB4B-121F 5' -TTTCCCGGGATGACGGTAGATCGGAAGGAC-3’ ；TaDREB4B-121R 5，-GGGACTAGTATGGTTTGGCCGCCGCAAAG-3，。PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 (TaKaRa 公司，Code No. DV807A)回收純化1. 1Kb左右的PCR產物。2、重組表達載體的構建①用限制性內切酶SmaI和SpeI酶切步驟1回收純化的PCR產物，回收酶切產物；②用限制性內切酶SmaI和SpeI酶切pAHC25 (購自北京拜爾迪生物技術公司)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產物電擊轉化T0P10菌株(購自天根生化科技(北京) 有限公司)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進行測序；測序結果表明，得到了重組質粒 pAHC25-TaDREB4B (在pAHC25的SmaI和SpeI酶切位點之間插入了序列表的序列2自5，端第128-1193位核苷酸所示的DNA片段)。二、轉基因植物的獲得1、基因槍法轉化轉化小麥愈傷組織取大田小麥(濟麥19 ；購自山東農業(yè)科學院)授粉后14天的未成熟胚，接種于SD2 培養(yǎng)基上，26°C黑暗條件下誘導愈傷組織，7-10d后準備基因槍轟擊。取適量金粉(1. Oym)懸浮液(60 μ g/槍)，將金粉和pAHC25_TaDREB4B的混合液在4°C振蕩lOmin，HOOOrpm離心5min去上清，加入無水乙醇(10 μ 1/槍加乙醇)準備用于
基因槍轟擊。采用PDS-1000/He基因槍(Bia-Rod公司生產)轟擊小麥幼胚誘導的愈傷組織。選擇IlOOI^i的可裂膜，對材料進行轟擊。轟擊后的愈傷組織繼續(xù)在原滲透壓培養(yǎng)基上培養(yǎng) 16-1 ，然后轉入不加篩選劑的SD2培養(yǎng)基(MM培養(yǎng)基也可)中暗條件下(^TC)恢復培養(yǎng) 2周。2周后，將愈傷組織轉入第一次篩選培養(yǎng)基上(1/2MS+玉米素0.5mg/L+2%蔗糖+雙丙氨膦鈉3mg/L ；或l/2MS+a-萘乙酸lmg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5mg/L+2%蔗糖+雙丙氨膦鈉 3mg/L也可)在(每天光照IOh)條件下篩選分化培養(yǎng)4周。待到愈傷組織分化出綠芽以后，將分化的綠芽轉入無激素培養(yǎng)基(1/2MS+雙丙氨膦鈉％ig/L)上直到小苗伸長(光照與溫度同前)，待到小苗伸長到l-2cm時(大概需要4周)，將抗雙丙氨膦鈉的再生植株移入壯苗培養(yǎng)基(1/2MS+生長素0. 5mg/L+多效唑0. 5mg/L)上壯苗，再生植株生長到適宜大小(苗高6-8cm，根系較好)時移入營養(yǎng)缽中，在15°C左右光照培養(yǎng)，待苗壯后置于溫室。將得到的陽性苗進行分子鑒定，結果表明得到了轉基因植株隊代)。T1代表示Ttl 代自交產生的種子及由它所長成的植株，T2代表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產生的種子及由它所長成的植株，T4代表示T3代自交產生的種子及由它所長成的植株，T5代表示T4代自交產生的種子及由它所長成的植株，T6代表示T5代自交產生的種子及由它所長成的植株。三、轉空載體對照植物的獲得
用pAHC25代替pAHC25_TaDREB4B，制備轉空載體對照植株，方法同步驟二。四、轉基因植物的抗旱性2008年10月將轉基因植株中的五個株系(08X10、08X11、08X24、08X27、08X51)的 T6代植株、轉空載體對照植株的T6代植株和濟麥19 (各30株)種植于大田，2009年測定抗旱指標。脯氨酸含量的測定方法見文獻張殿忠汪沛洪趙會賢，測定小麥葉片游離脯氨酸含量的方法199(K4) :62 65?？扇苄钥偺呛康臏y定方法見文獻鄒琦.植物生理生化實驗指導.北京中國農業(yè)出版社，1995。過氧化物酶活性(POD酶活性)的測定方法見文獻: 徐朗萊，葉茂炳過氧化物酶活力連續(xù)記錄測定法.南京農業(yè)大學學報，1989，12 (3) :82-83. Chedf M，Aseelin A，Belenger R R. Defense responseinduced by soluble silicon in cucumber roots infected by Pyshiumspp· phytopathology，1994，84 :236_275。光合速率 (SPAD值)用LI-6400便攜式光合作用測定儀測定。設置三次重復實驗，結果取平均值。結果見圖7。結果表明轉基因植株的脯氨酸含量(圖7A)、可溶性總糖含量(圖 7B)、過氧化物酶活性(圖7C)和光合速率(圖7D)均比濟麥19明顯提高。轉空載體對照植株的脯氨酸含量、可溶性總糖含量、過氧化物酶活性和光合速率與濟麥19沒有顯著差異。2008年10月將轉基因植株中的八個株系(08X6、08X10、08X11、08X18、08X24、 08X27,08X28,08X36)的T6代植株、轉空載體對照植株的T6代植株和濟麥19 (各30株)種植于旱地。2009年測定株高、穗數(shù)、株粒數(shù)、株粒重、千粒重等指標。設置三次重復實驗，結果取平均值。結果見表2。結果表明與濟麥19相比，轉基因植株的株粒重和千粒重明顯提高；轉空載體對照植株的各個指標與濟麥19沒有顯著差異。表2轉DREB4基因小麥各品系主要性狀值
權利要求
1.一種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因，優(yōu)選為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5，端第1 至1168位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第1 至1193位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性相關蛋白的DNA 分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性相關蛋白的 DNA分子。
3.含有權利要求2所述基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為 YEP-GAP-TaDREB4B,pBI121-TaDREB4B ^ pAHC25-TaDREB4B ；所述YEP-GAP-TaDREB4B為將權利要求2所述基因插入YEP-GAP的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第1 至1193位核苷酸所示的DNA片段插入 YEP-GAP的EcoRI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述pBI121-TaDREB4B為將權利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第1 至1193位核苷酸所示的DNA片段插入 PBI121的BamHI和BioI酶切識別位點之間得到的重組質粒；所述pAHC25-TaDREB4B為將權利要求2所述基因插入pAHC25的多克隆位點得到的重組質粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第1 至1193位核苷酸所示的DNA片段插入 PAHC25的SmaI和SpeI酶切識別位點之間得到的重組質粒。
5.一種培育轉基因植物的方法，是將權利要求2所述基因導入目的植物中，得到耐逆性高于所述目的植物的轉基因植物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于權利要求2所述基因通過權利要求3或4所述重組表達載體導入所述目的植物中；所述耐逆性為耐非生物脅迫或抗病。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述耐非生物脅迫為耐旱和/或耐鹽和/或耐高溫；所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥；所述方法為將權利要求2 所述基因通過所述pBI121-TaDREB4B導入所述目的植物中。
8.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述目的植物為小麥，優(yōu)選為濟麥19 ；所述耐非生物脅迫為耐旱；所述耐旱體現(xiàn)為如下(I)和/或(II)(I)所述轉基因植物的脯氨酸含量和/或可溶性總糖含量和/或過氧化物酶活性和/ 或光合速率高于所述目的植物；(II)干旱條件下，所述轉基因植物的株粒重和/或千粒重高于所述目的植物；所述方法為將權利要求2所述基因通過所述pAHC25-TaDREB4B導入所述目的植物中。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于 所述目的植物為小麥，優(yōu)選為濟麥19 ；所述抗病為抗白粉?。凰霭追鄄∈怯砂追鄄〔≡鶨09引起的； 所述方法為將權利要求2所述基因通過所述pAHC25-TaDREB4B導入所述目的植物中。
10.權利要求1所述蛋白作為轉錄因子的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關蛋白TaDREB4B及其編碼基因和應用。本發(fā)明提供的蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關的由序列1衍生的蛋白質。本發(fā)明的TaDREB4B在干旱、高鹽、高溫、低溫、病原菌、ABA、乙烯、JA、SA誘導下表達，可以特異的調控含有DRE/CRT順式元件(核心序列CCGAC)的基因的轉錄表達；提高植物的抗旱性、耐鹽性、耐高溫性，以及對白粉病病原菌的抗性。本發(fā)明的TaDREB4B為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和耐逆性增強的植物中發(fā)揮重要的作用。
文檔編號A01H5/00GK102234320SQ201010161640
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月27日 優(yōu)先權日2010年4月27日
發(fā)明者徐兆師, 李連城, 陳明, 馬有志 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所