專(zhuān)利名稱(chēng)：一種芍藥組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種芍藥組織培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
芍藥(Paeonia lactiflora)為芍藥科芍藥屬多年生草本植物，是我國(guó)的傳統(tǒng)名 花，有悠久的栽培觀賞歷史，自古與“花王”牡丹相伴被稱(chēng)為“花相”。芍藥的傳統(tǒng)繁殖方式有 分株、播種、扦插和壓條等，其中分株繁殖法應(yīng)用最廣，也有利于保持品種原有的優(yōu)良性狀， 但是該法繁殖系數(shù)小，無(wú)法滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的要求。隨著市場(chǎng)的開(kāi)放，芍藥優(yōu)良的觀賞特性 和切花品質(zhì)受到世界矚目，歐美地區(qū)每年對(duì)芍藥的需求量很大，但是我國(guó)芍藥種苗的生產(chǎn) 形勢(shì)遠(yuǎn)不能滿足國(guó)際花卉市場(chǎng)的需求。組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到園林植物繁殖上，但在觀賞芍藥繁殖上應(yīng)用的還很 少。以組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)芍藥進(jìn)行離體快繁不僅能提高其繁殖系數(shù)，也能縮短其育種年限，對(duì) 芍藥的生產(chǎn)具有重要的意義。CN200510039010. 7公開(kāi)了一種芍藥離體組織培養(yǎng)方法，具體 描述了從取材消毒到繼代的過(guò)程，沒(méi)有對(duì)生根及組培苗移栽成活做進(jìn)一步的研究。目前，芍 藥屬植物的離體快繁研究多集中在牡丹上，有關(guān)芍藥組織培養(yǎng)的國(guó)內(nèi)外研究較少，已有的 關(guān)于芍藥組織培養(yǎng)技術(shù)，僅討論了無(wú)菌體系的建立，還沒(méi)有形成一整套利用芍藥地下芽快 速繁殖的方法，也沒(méi)有涉及到芍藥組培苗的生根和移栽，不能為生產(chǎn)提供依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、成本低廉且適于多種觀賞芍藥快速繁殖的芍 藥組織培養(yǎng)方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種芍藥組織培養(yǎng)方法，其包括芍藥莖尖的滅菌 消毒以及對(duì)滅菌消毒后的芍藥莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟。前述的組培方法，其中所述的芍藥莖尖取材自芍藥休眠期的地下芽。前述的組培方法，其中所述的芍藥莖尖的滅菌消毒使用酒精和84消毒液。前述的組培方法，其中所述的藥莖尖的滅菌消毒分兩步進(jìn)行1)將帶有鱗片的芽 用濃度為70% 75%的酒精浸泡30 60秒后，用無(wú)菌水沖洗，然后用經(jīng)過(guò)稀釋的84消毒 液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 3 4的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?)剝?nèi)パ亏[， 露出莖尖，用經(jīng)過(guò)稀釋的84消毒液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 5 7的 體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笥脽o(wú)菌水沖洗。前述的組培方法，其中初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/ L lmg/L 6-BAU/2MS+0. lmg/L lmg/LGA3+lmg/L6-BA+0. lmg/L 0. 5mg/L NAA,優(yōu) 選 l/2MS+lmg/LGA3+lmg/L 6-BA ；繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L6_BA、 1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZU/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L6_BA，優(yōu)選 1/2MS+0. 2mg/L 6-BA ；生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/L IBA、ffPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA。
前述的組培方法，其中繼代培養(yǎng)的次數(shù)為4 5次。前述的組培方法，其中生根培養(yǎng)分三步進(jìn)行1)將繼代培養(yǎng)得到組培苗在3 6°C 冷藏8 10天，轉(zhuǎn)接到含NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天，其中含NAA的生根培養(yǎng)基 優(yōu)選WPM+1. Omg/L NAA ；2)將組培苗轉(zhuǎn)接到WPM+2% AC培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)20 30天，生 根后進(jìn)行煉苗；3)將生根苗移栽到珍珠巖基質(zhì)中。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)本發(fā)明通過(guò)對(duì)芍藥莖尖的滅菌消毒、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，得到完 整的芍藥組培苗植株，生根率最高達(dá)到26. 7%，并能實(shí)現(xiàn)出瓶移栽。(2)采用莖尖進(jìn)行離體培養(yǎng)產(chǎn)生的組培苗能夠保持原品種的優(yōu)良性狀，為良種繁 育和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。(3)本發(fā)明的芍藥組織培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適于多數(shù)觀賞芍藥的快速繁殖。(4)對(duì)外植體表面進(jìn)行滅菌消毒時(shí)，僅使用了酒精和84消毒液，對(duì)環(huán)境友好。(5)分兩步對(duì)外植體表面滅菌消毒，保證了消毒徹底且消毒液不對(duì)外植體造成傷 害，莖尖成活率達(dá)25%以上。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.材料與方法于10月份取大田中3 4年生的芍藥品種‘種生粉’的地下芽作為外植體，放入 4°C冰箱冷藏保存4周后接種。接種前，將市售“金魚(yú)牌”洗潔精用水稀釋800倍，用稀釋后的洗潔精溶液浸泡清 洗外植體，然后用水洗凈，再用鑷子剝?nèi)ネ鈱喻[片，留下最里面的一兩層黃白色鱗片并切去 基部多余部分，然后再用稀釋后的洗潔精溶液浸泡，用毛筆仔細(xì)刷洗鱗片和側(cè)芽的縫隙，最 后用自來(lái)水沖洗1小時(shí)。在超凈工作臺(tái)中，將帶有一兩層鱗片的芽用濃度為70%的酒精浸泡60秒，無(wú)菌水 沖洗3次，用經(jīng)過(guò)稀釋的84消毒液浸泡15分鐘，其中84消毒液與水按1 3的體積比進(jìn) 行稀釋?zhuān)辉跒V紙上剝?nèi)ナＳ圜[片，露出黃白色莖尖，再用經(jīng)過(guò)稀釋的84消毒液浸泡15分鐘， 其中84消毒液與水按1 5的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笥脽o(wú)菌水沖洗5次，切去基部被消毒 液滲透的部分，切口盡量平齊，減小創(chuàng)傷面積，保留2個(gè)側(cè)芽，輕輕放置在培養(yǎng)基表面上，每 瓶接2個(gè)芽子。初代培養(yǎng)采用不同的啟動(dòng)培養(yǎng)基分批次進(jìn)行，所采用的啟動(dòng)培養(yǎng)基包括 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/L 0. 5mg/L NAA。待莖尖伸長(zhǎng)展葉后，分別將上述分批次培養(yǎng)的莖尖轉(zhuǎn)接到 增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)采用不同的增殖培養(yǎng)基分批次進(jìn)行，所采用的增殖 培養(yǎng)基包括 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZU/2MS+0. lmg/ L 0. 2mg/L 6-BA。增殖4代后，分別選擇上述分批次培養(yǎng)的生長(zhǎng)健壯的組培苗放到4°C冰 箱中冷藏處理10天后轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，生根培養(yǎng)采用不同的生根培養(yǎng)基分批次進(jìn)行，所采用的生根培養(yǎng)基包括WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/L IBA、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、 WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA.WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA。15 天后再分別將上述分批次 培養(yǎng)的組培苗轉(zhuǎn)接到WPM+2% AC培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。生根培養(yǎng)30天后，將打開(kāi)封口膜煉 苗。1周后，將生根苗從三角瓶中取出，洗凈根部的瓊脂，移栽到盛有珍珠巖基質(zhì)的穴盤(pán)中， 噴施稀釋50倍的MS稀釋液，用保鮮膜覆蓋。2.結(jié)果與分析(1)無(wú)菌體系的建立地下芽接種后2-3天，基部與培養(yǎng)基接觸處出現(xiàn)白色的菌絲，隨著芽的萌動(dòng)和分 化，污染情況加重，最后導(dǎo)致芽的死亡，可能是地下芽在土壤中接觸細(xì)菌較多，消毒困難或 消毒時(shí)保留外層芽鱗，消毒不充分。參照上述芍藥莖尖的滅菌消毒方法，當(dāng)使用酒精濃度75%處理帶有鱗片的芽 30s、84消毒液1 4稀釋處理15min;再用、84消毒液1 7稀釋處理15min，其莖尖成活 率為25%以上。參照上述芍藥莖尖的滅菌消毒方法，當(dāng)使用酒精濃度70%處理帶有鱗片的芽 60s、84消毒液1 3稀釋處理12min;再用84消毒液1 5稀釋處理12min，其莖尖成活 率為25%以上。采用本發(fā)明芍藥莖尖的滅菌消毒方法，接種后的莖尖成活率最高可達(dá)31. 5%。(2)叢生芽的誘導(dǎo)接種后，黃白色的芽在光下變成綠色，莖尖伸長(zhǎng)，隨后側(cè)芽萌動(dòng)，葉片伸展開(kāi)，葉片 呈綠色。出現(xiàn)污染的芽依然能夠萌動(dòng)和分化，但是隨著污染情況的加重，逐漸死亡。采用本發(fā)明提供的初代培養(yǎng)的啟動(dòng)培養(yǎng)基1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+0. 2mg/ L lmg/L 6-BA 或 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/L 0. 5mg/L NAA 可 使地下芽最高萌動(dòng)率達(dá)到100%，最高分化率達(dá)到56. 25%，部分芽基部出現(xiàn)愈傷組織。(3)叢生芽的增殖采用本發(fā)明提供增殖培養(yǎng)基1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L
0.2mg/L TDZ或1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L 6-BA進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果表明，添加了 TDZ的 培養(yǎng)基誘導(dǎo)叢生芽的增殖系數(shù)大于添加6-BA的培養(yǎng)基，但是TDZ導(dǎo)致部分叢生芽的生長(zhǎng)畸 形，葉片扭曲膨大，且組培苗莖葉細(xì)弱，顏色較淺，有玻璃化的趨勢(shì)，高濃度的6-BA也能引 起部分組培苗出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象。低濃度的6-BA能夠保證組培苗穩(wěn)定增殖，增殖系數(shù)達(dá)到 2. 1，且生長(zhǎng)健壯。因此低濃度的6-BA是增殖培養(yǎng)階段適宜的激素。(4)生根培養(yǎng)采用本發(fā)明提供的生根培養(yǎng)基WPM、WPM+0. lmg/L 0. 5mg/LIBA、WPM+0. 5mg/L
1.Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA 或 WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L NAA 誘導(dǎo)生根，然 后將組培苗轉(zhuǎn)接到含活性炭的空白培養(yǎng)基上培養(yǎng)，生根培養(yǎng)最高生根率達(dá)到26. 7%，每株 平均生根數(shù)為2. 25條，平均根長(zhǎng)為0. 88cm。在含有NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的組培苗基部 有白色的愈傷組織。3.總結(jié)在芍藥地下芽的組織培養(yǎng)中，采用兩步消毒法可以使成活率達(dá)到25%以上，啟動(dòng) 培養(yǎng)采用培養(yǎng)基l/2MS+lmg/L GA3+lmg/L 6-BA較為適宜；增殖培養(yǎng)基采用1/2MS+0. 2mg/L
56-BA能使組培苗穩(wěn)定的增殖；在生根培養(yǎng)過(guò)程中，先用生根培養(yǎng)基WPM+1.0mg/L NAA處理， 再轉(zhuǎn)接到WPM+2% AC培養(yǎng)基上，生根效果好。 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種芍藥組織培養(yǎng)方法，其包括芍藥莖尖的滅菌消毒以及對(duì)滅菌消毒后的芍藥莖尖 進(jìn)行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟，其特征在于，芍藥莖尖的滅菌消毒分兩步進(jìn)行1)將帶有鱗片的芽用濃度為70% 75%的酒精浸 泡30 60秒后，用無(wú)菌水沖洗，然后用經(jīng)過(guò)稀釋的84消毒液浸泡12 15分鐘，其中84 消毒液與水按1 3 4的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?)剝?nèi)パ亏[，露出莖尖，用經(jīng)過(guò)稀釋的84消 毒液浸泡12 15分鐘，其中84消毒液與水按1 5 7的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笥脽o(wú)菌 水沖洗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，生根培養(yǎng)分三步進(jìn)行1)將繼代培養(yǎng)得到 組培苗在3 6°C冷藏8 10天，轉(zhuǎn)接到含NAA的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)15 20天；2)將組 培苗轉(zhuǎn)接到WPM+2% AC培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)20 30天，生根后進(jìn)行煉苗；3)將生根苗移栽 到珍珠巖基質(zhì)中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述芍藥莖尖取材自芍藥休眠期的地 下芽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+0.Img/ L lmg/L GA3+0. 2mg/L lmg/L 6-BA 或 1/2MS+0. lmg/L lmg/L GA3+lmg/L 6-BA+O. lmg/ L 0. 5mg/L NAA ；繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 1/2MS+0. 5mg/L lmg/L 6-BA、1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L TDZ 或 1/2MS+0. lmg/L 0. 2mg/L 6-BA ；生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為 WPM、WPM+0. lmg/ L 0. 5mg/L IΒΑ、WPM+0. 5mg/L 1. Omg/L IBA、WPM+1. Omg/L 2. Omg/L IBA或WPM+0. 5mg/ L 1. Omg/L NAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為lAMS+lmg/L GA3+lmg/L 6-BA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS+0.ang/L 6-BA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，繼代培養(yǎng)的次數(shù)為4 5次。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步驟1)的含NAA的生根培養(yǎng)基 為 WPM+1. Omg/L NAA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種芍藥組織培養(yǎng)方法，其包括對(duì)芍藥莖尖滅菌消毒的步驟，以及對(duì)滅菌消毒后的芍藥莖尖進(jìn)行初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的步驟，其中對(duì)芍藥莖尖的滅菌消毒分兩步進(jìn)行，保證了消毒徹底且對(duì)外植體無(wú)傷害，莖尖成活率高。本發(fā)明的芍藥組織培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單、成本低廉、生根率高，并能實(shí)現(xiàn)出瓶移栽，適于多數(shù)觀賞芍藥品種的快速繁殖，同時(shí)，采用本發(fā)明的組培方法能夠保持原品種的優(yōu)良性狀，為良種繁育和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102124946SQ201010102618
公開(kāi)日2011年7月20日 申請(qǐng)日期2010年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月27日
發(fā)明者于曉南, 張啟翔, 潘瞳 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)