OMEGA-9級(jí)芥菜優(yōu)先權(quán)要求本發(fā)明要求2008年11月4日提交的題為“OMEGA-9級(jí)芥菜”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)流水號(hào)61/198,422的權(quán)益。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及下述領(lǐng)域：改進(jìn)的蕓薹屬(Brassica)物種，包括芥菜(Brassicajuncea)，改進(jìn)的來自芥菜的油和粕(meal)，生成此類改進(jìn)的蕓薹屬物種的方法，和選擇蕓薹屬種系的方法。其他實(shí)施方案涉及包含相對(duì)于現(xiàn)存商業(yè)芥菜栽培種具有增加的油酸含量和減少的亞麻酸含量的內(nèi)源油的芥菜的種子，以及具有穩(wěn)定并入其中使種子油中油酸含量增加且亞麻酸含量減少的特征的芥菜的種子。
背景技術(shù)：
：雙低菜(Canola)是由加拿大植物育種者專門針對(duì)其油和粕的特性，尤其是其低飽和脂肪水平而開發(fā)的菜籽的基因變型?！半p低菜”通常指在種子油中按重量計(jì)具有少于2%芥酸(Δ13-22:1)和每克不含油的粕少于30微摩爾的硫代葡萄糖酸鹽(glucosinolate)的蕓薹屬物種的植物。通常，雙低菜油可包含稱為棕櫚酸和硬脂酸的飽和脂肪酸，稱作油酸的單不飽和脂肪酸，和稱作亞油酸和亞麻酸的多不飽和脂肪酸。這些脂肪酸有時(shí)根據(jù)其碳鏈長(zhǎng)度和鏈中雙鍵的數(shù)量來指稱。舉例而言，油酸有時(shí)稱作C18:1，因?yàn)槠渚哂?8個(gè)碳的碳鏈和一個(gè)雙鍵，亞油酸有時(shí)稱作C18:2，因?yàn)槠渚哂?8個(gè)碳的碳鏈和兩個(gè)雙鍵，而亞麻酸有時(shí)稱作C18:3，因?yàn)槠渚哂?8個(gè)碳的碳鏈和三個(gè)雙鍵。雙低菜油可含有少于約7%的總飽和脂肪酸(主要為棕櫚酸和硬脂酸)和大于60%的油酸(按照占總脂肪酸的百分比)。傳統(tǒng)上，雙低菜油作物包括歐洲油菜(Brassicanapus)和蕪菁(Brassicarapa)的品種(variety)。近來，已將與其他雙低菜類型具有類似的油和粕質(zhì)量的雙低級(jí)芥菜品種加入雙低菜作物家族(2001年10月16日授予Potts等的美國(guó)專利6,303,849號(hào)；授予Yao等的美國(guó)專利7,423,198號(hào)；Potts和Males,1999)。植物油的脂肪酸組成影響該油的質(zhì)量、穩(wěn)定性和健康特性。舉例而言，已發(fā)現(xiàn)油酸(一種C18:1單不飽和脂肪酸)具有某些健康益處，包括減少血漿膽固醇水平的有效性，使得種子油中較高水平的油酸含量(>70%)成為期望的性狀。此外，并非植物油中所有的脂肪酸均同等程度地易受高溫和氧化影響。相反，各個(gè)脂肪酸對(duì)氧化的易感性取決于其不飽和程度。舉例而言，具有三個(gè)碳-碳雙鍵的亞麻酸(C18:3)氧化比僅具有一個(gè)碳-碳雙鍵的油酸快98倍，而具有兩個(gè)碳-碳雙鍵的亞油酸氧化比油酸快41倍(R.T.Holman和O.C.Elmer,“Theratesofoxidationofunsaturatedfattyacidesters,”J.Am.OilChem.Soc.24,127-1291947)。關(guān)于油酸、亞油酸和亞麻酸脂肪酸相對(duì)氧化速率的進(jìn)一步信息，參見Hawrysh,“StabilityofCanolaOil,”Chap.7,pp.99-122,CanolaandRapeseed:Production,Chemistry,Nutrition,andProcessingTechnology,Shahidi,ed.,VanNostrandReinhold,NY,1990。植物油的“穩(wěn)定性”可定義為油對(duì)氧化及因此由于造成酸敗并降低食物質(zhì)量的產(chǎn)物生成而導(dǎo)致的變質(zhì)的抗性。在相同的加工、配制、包裝和儲(chǔ)藏條件下，不同植物油之間穩(wěn)定性的差距主要是由于其不同的脂肪酸分布(profile)。因此在烹飪用途中優(yōu)選高油酸含量的植物油，因?yàn)槠湓跓崃看嬖谙聦?duì)氧化的抗性增加。不良的氧化穩(wěn)定性造成例如在使用所述油作為煎炒用油(fryoil)時(shí)縮短的操作時(shí)間，因?yàn)檠趸a(chǎn)生會(huì)嚴(yán)重減少油的市場(chǎng)價(jià)值的異臭(off-flavor)和味道。出于這些原因，植物油中的高油酸和低亞麻酸可為期望的。植物在其質(zhì)體中以棕櫚酰ACP(16:0-ACP)和硬脂酰ACP來合成脂肪酸。硬脂酰ACP向油酰ACP(18:1-ACP)的轉(zhuǎn)化由可溶性酶硬脂酰-ACPΔ9去飽和酶催化(Shanklin和Somerville,1991)。這些酰基ACP或者在葉綠體中用于糖脂合成，或作為?；鵆oA轉(zhuǎn)運(yùn)出葉綠體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。油酸的進(jìn)一步去飽和僅發(fā)生在其用于甘油脂類的合成并摻入膜之后，這導(dǎo)致多不飽和脂肪酸的合成。廣為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的是，油料種子作物中脂肪酸的不飽和度一部分是由脂肪酸去飽和酶(FAD)控制的。FAD酶通過從脂肪?；溕舷薅ǖ奶既コ龤湓由商?碳雙鍵來調(diào)節(jié)脂肪酸如硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亞油酸(C18:2)的不飽和度。多不飽和脂肪酸亞油酸(Δ9,12-18:2)和α-亞麻酸(Δ9,12,15-18:3)的合成以油酸(Δ9-18:1)轉(zhuǎn)化為亞油酸起始，該酶步驟由微粒體ω-6油酸去飽和酶(FAD2)催化。然后亞油酸通過由ω-3亞油酸去飽和酶(FAD3)進(jìn)行的進(jìn)一步去飽和轉(zhuǎn)化為ω-亞麻酸。有報(bào)道稱通過基因工程改造操縱FAD2基因可改變脂肪酸分布。舉例而言，大豆fad2基因在擬南芥(Arabidopsis)突變體種系中的異源表達(dá)導(dǎo)致多不飽和脂肪酸累積的急劇增加(Heppard等,1996)。與之相反，在擬南芥突變體種系fad2-5中，當(dāng)由于T-DNA插入造成fad2基因的轉(zhuǎn)錄顯著減少時(shí)，顯示油酸累積的急劇增加以及亞油酸和亞麻酸水平的顯著減少(Okuley等,1994)。這些發(fā)現(xiàn)提示FAD2基因在控制種子儲(chǔ)藏脂質(zhì)中油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸中起重要作用。已投入了大量精力操縱用于大規(guī)模生產(chǎn)商用油脂的植物尤其是油料種子品種如蕓薹屬物種的脂肪酸分布(參見，例如1997年4月29日授予的美國(guó)專利5,625,130號(hào)，1997年9月16日授予的5,668,299號(hào)，1998年6月16日授予的5,767,338號(hào)，1998年11月24日授予的5,840,946號(hào)，1998年12月15日授予的5,850,026號(hào)，1999年1月19日授予的5,861,187號(hào)，2000年5月16日授予的6,063,947號(hào)，2000年7月4日授予的6,084,157號(hào)，2001年1月2日授予的6,169,190號(hào)，2001年11月27日授予的6,323,392號(hào)，和1997年11月27日公開的國(guó)際專利申請(qǐng)WO97/43907和2000年9月8日公開的WO00/51415)。芥菜(AABB基因組；n=18)(在本文中也稱作“芥菜”(B.juncea))為蕓薹屬的雙二倍體植物，其通常認(rèn)為是來自蕪菁(AA基因組；n=10)和黑芥(Brassicanigra)(BB基因組；n=8)的雜交。歐洲油菜(AACC基因組；n=19)(在本文中也稱作“歐洲油菜”(B.napus))亦為蕓薹屬的雙二倍體植物，但其認(rèn)為是來自蕪菁和甘藍(lán)(Brassicaoleracea)(CC基因組；n=9)的雜交。在一些生長(zhǎng)條件下，芥菜可具有某些比歐洲油菜優(yōu)越的性狀。這些優(yōu)越的性狀可包括更高的產(chǎn)量，更好的干旱和熱耐受性以及更好的疾病抗性。大量的育種努力產(chǎn)生了其種子含有少于2%芥酸且其去脂肪的粕每克含有少于30微摩爾硫代葡萄糖酸鹽的蕓薹屬物種植物。術(shù)語(yǔ)“雙低菜”用來描述蕓薹屬物種含有低芥酸(Δ13-22:1)以及低硫代葡萄糖酸鹽的品種。通常，雙低菜油可含有少于約7%的總飽和脂肪酸以及大于60%的油酸(按照占總脂肪酸的百分比)。舉例而言，在美國(guó)，根據(jù)21CFR184.1555，來源于歐洲油菜或蕪菁的低芥酸菜籽油，當(dāng)其芥酸含量為不多于組分脂肪酸的2%，油酸(C18:1)含量按重量計(jì)超過50.0%，亞油酸(C18:2)含量按重量計(jì)少于40.0%，且亞麻酸(C18:3)含量按重量計(jì)少于14.0%時(shí)，承認(rèn)其為雙低菜油。在加拿大，CanolaCouncilofCanada將芥菜加入雙低菜定義設(shè)定了如下的附加要求，即芥菜雙低菜品種必須產(chǎn)生具有包含等于或大于種子中總脂肪酸55%的油酸含量的油的種子，且來源于芥菜雙低菜種子的粕必須為每克不含油的粕含有少于1微摩爾的烯丙基(2-丙烯基)硫代葡萄糖酸鹽。芥菜和歐洲油菜的油組成之間的差異在本領(lǐng)域是周知的。舉例而言，已知芥菜在多種組分上具有差異，包括但不限于酚類(例如生育酚)、甾醇類、硫化物、脂肪酸組分、礦物質(zhì)和異硫氰酸鹽/酯。芥菜還含有具有強(qiáng)抗微生物(細(xì)菌和真菌)性質(zhì)的揮發(fā)物。植物育種者還選擇了具有低硫代葡萄糖酸鹽如3-丁烯基、4-戊烯基、2-羥基-3-丁烯基或2-羥基-4-戊烯基硫代葡萄糖酸鹽的雙低菜品種。雙低級(jí)粕可例如定義為每克不含油的粕具有少于30微摩爾脂族硫代葡萄糖酸鹽的硫代葡萄糖酸鹽含量。目前，主要的商用雙低菜作物包含歐洲油菜和蕪菁(campestris)品種。2001年10月16日授予Potts等的美國(guó)專利6,303,849號(hào)公開了具有性質(zhì)類似于雙低菜的食用油的芥菜種系。該文中公開的芥菜種系具有包括芥菜種系J90-3450和J90-4316的譜系(lineage)，其分別以ATCC登錄號(hào)203389和203390保藏(兩者皆由AgricultureandAgri-FoodCanada根據(jù)布達(dá)佩斯條約的條款于1998年10月23日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBlvd.,Manassas,Va.USA20110-2209)。前述相關(guān)技術(shù)的實(shí)例及其相關(guān)的限定旨在為說明性的而并不是排他的。其他相關(guān)技術(shù)的限定對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了本說明書并研究了附圖之后會(huì)是顯而易見的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：下述實(shí)施方案及其多個(gè)方面是連同意為示例性和說明性而非限制保護(hù)范圍的系統(tǒng)、工具和方法一起進(jìn)行描述和闡明。在多種實(shí)施方案中，上述問題中的一個(gè)或多個(gè)已得到削減或消除，而其他實(shí)施方案涉及其他改進(jìn)。在多個(gè)方面，本發(fā)明提供芥菜植物、種子、細(xì)胞、核酸序列的等位變異(allelicvariation)和油。本發(fā)明植物種子中的食用油與見于其他芥菜植物種子中的相比可具有顯著更高的油酸含量和更低的亞麻酸含量。在本發(fā)明中公開了多種高油酸/低亞麻酸(“HOLL”)芥菜種系。在一個(gè)實(shí)施方案中，芥菜種系包含F(xiàn)AD2和FAD3基因，如公開于國(guó)際公開號(hào)WO2006/0248611A1，例示于其所附的圖1和3以及SEQIDNO:7、9、12和13中。所得的突變體等位基因編碼delta-12脂肪酸去飽和酶蛋白，其例示于所附的圖2以及SEQIDNO:8、10和11。在其他實(shí)施方案中，所述芥菜種系可在fad2-a和fad3-a基因座含有突變，且所得的突變體等位基因可在預(yù)測(cè)的BjFAD2-A和BjFAD3-A蛋白的序列中編碼一個(gè)或多個(gè)突變。適用于本發(fā)明的fad2-a和fad3-a突變基因和蛋白的代表性實(shí)例還包括但不限于：公開于國(guó)際公開WO2006/079567A3號(hào)(例如，圖1和2，以及SEQIDNO:3和4)；國(guó)際公開WO2005/107590A2號(hào)(例如SEQIDNO:1至12)；美國(guó)專利6,967,243B2號(hào)(例如圖2和3，以及SEQIDNO:11、12、15、16、17和18)；以及歐洲公開1862551A1號(hào)(例如圖1至10，以及SEQIDNO:22至33)中的那些。在其他實(shí)施方案中，BNfad2-a和Bnfad23-a轉(zhuǎn)化的種系可用于在蕓薹屬植物中尋找BJFAD2B和BJFAD3B中的天然變異，因?yàn)榭蓹z測(cè)含有BnFad2A、BnFad3A的芥菜植物中脂肪酸分布的顯著變異。在本發(fā)明的一個(gè)方面，令人意想不到地發(fā)現(xiàn)蕓薹屬植物中FAD2和/或FAD3酶活性的取代、缺失或沉默得到了能夠產(chǎn)生具有按重量計(jì)大于約70%的油酸含量和按重量計(jì)少于約5%的亞麻酸含量的油的植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，令人意想不到地發(fā)現(xiàn)在蕓薹屬植物中移動(dòng)或轉(zhuǎn)移修飾FAD2和/或FAD3酶活性的基因得到了能夠產(chǎn)生具有按重量計(jì)大于約70%的油酸含量和按重量計(jì)少于約5%的亞麻酸含量的油的植物。此類植物可例如為四倍體植物或雙二倍體植物，如芥菜或歐洲油菜。在一個(gè)方面，本發(fā)明相應(yīng)地提供在植物如在芥菜種系中對(duì)選定FAD2和FAD3編碼序列的缺失或沉默。來源于本發(fā)明植物的食用油可具有下述一個(gè)或多個(gè)特征：按重量計(jì)至少70%的油酸含量，按重量計(jì)少于約5%的亞麻酸含量，以及按重量計(jì)少于約7%的總飽和脂肪酸含量。本發(fā)明的其他方面包括植物和植物部分。如本文中所用的“植物部分”包括攜帶本發(fā)明核的酸或具有本發(fā)明的fad2/fad3編碼序列或具有調(diào)節(jié)序列，如表達(dá)來自歐洲油菜的FAD2和/或FAD3酶的FAD2/FAD3編碼區(qū)上游的序列的植物細(xì)胞、種子、花粉。提供了使用本發(fā)明植物包括通過本發(fā)明的標(biāo)記選擇的后代植物以獲得植物產(chǎn)品的方法。如本文中所用的“植物產(chǎn)品”包括任何來源于本發(fā)明植物之物，包括植物部分如種子、粕、脂肪或油，包括具有改變的油酸和亞麻酸濃度的植物產(chǎn)品。提供了修飾植物從而使得其具有能夠表達(dá)活性FAD2酶和/或FAD3酶的自歐洲油菜轉(zhuǎn)移的fad2/fad3編碼序列的方法。此類方法可例如涉及將一種或多種來自歐洲油菜的fad2-a和/或fad3-a編碼序列通過種間雜交轉(zhuǎn)移至植物，從而使得該植物具有取代的fad2和/或fad3編碼序列。此類方法使得所衍生的突變能夠得到鑒定并且準(zhǔn)確摻入芥菜。提供了用于鑒定本發(fā)明的fad2/fad3編碼序列一部分的擴(kuò)增引物，其可用于例如區(qū)分選定的FAD2和/或FAD基因座的不同等位基因。提供了使用本發(fā)明的fad2/fad3編碼序列，或本發(fā)明的fad2/fad3編碼序列的上游區(qū)獲得植物的方法。舉例而言，本發(fā)明的序列可用于指導(dǎo)或靶向可下調(diào)或改變選定FAD2和/或FAD3編碼序列表達(dá)的位點(diǎn)特異性突變，如通過下調(diào)或改變來自選定FAD2或FAD3基因座的FAD2和/或FAD3基因的表達(dá)，或通過截短由FAD2和/或FAD3基因編碼的FAD2和/或FAD3蛋白。常規(guī)植物育種技術(shù)如雜交和回交以及其他育種技術(shù)可用于將本發(fā)明的fad2和/或fad3編碼序列引入本發(fā)明的植物的后代中。一種其他實(shí)施方案包括芥菜品種的種子中的油，其具有包含按重量計(jì)至少68.0%油酸和按重量計(jì)少于4.0%亞麻酸的脂肪酸含量。本發(fā)明進(jìn)一步包括從本文所述的芥菜植物的種子獲得的粕，其中此種粕可為壓碎的種子、壓濾餅(presscake)、白色薄片(whiteflake)或來自常規(guī)壓碎和溶劑提取工藝的粕的形式。除了上述示例性的方面和實(shí)施方案之外，其他方面和實(shí)施方案通過參照附圖和通過研究下述描述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的。附圖說明圖1圖示了從DMS100和Quantum克隆的fad2基因的部分基因組核苷酸序列。上部是DMS100序列而下部是Quantum序列。箭頭指示C至T的單核苷酸突變，其產(chǎn)生終止密碼子(TAG)(帶陰影)。用于基于PCR的突變體等位基因特異性標(biāo)記的正向和反向引物為粗體和帶下劃線的。圖2提供了fad2基因的氨基酸序列，其為從克隆自DMS100、Quantum的基因組核苷酸序列以及從公開的歐洲油菜FAD2基因(BNFAD2)簡(jiǎn)并所得。箭頭指示DMS100中由單核苷酸突變(C至T)造成的終止密碼子的位置。圖3顯示從DMS100和Quantum克隆的fad3c基因的基因組核苷酸序列。上部是DMS100序列而下部是Quantum序列。外顯子標(biāo)以方框，內(nèi)含子未標(biāo)以方框，其對(duì)應(yīng)于蕪菁和擬南芥中的fad3基因的外顯子4、5、6和7以及內(nèi)含子4、5和6。箭頭指示G至A的單核苷酸突變。用于基于PCR的突變體等位基因特異性標(biāo)記的正向和反向引物為粗體和帶下劃線的。圖4圖示根據(jù)本發(fā)明的原理，高油酸-低亞麻酸選擇個(gè)體(selection)和芥菜親本(Zem1、Zem2和ZESkorospelka)之間的一個(gè)或多個(gè)回交(BC3和BC4)。具體實(shí)施方式為了清楚地加以描述，對(duì)本文中使用的一些術(shù)語(yǔ)解釋如下。術(shù)語(yǔ)“種系”指在共享該命名的個(gè)體之間顯示非常小的總體差異的一組植物?！胺N系”通常指?jìng)€(gè)體之間對(duì)于至少一個(gè)性狀顯示很小或無遺傳差異的一組植物。如本申請(qǐng)中使用的“DH(加倍單倍體，doubledhaploid)種系”指如下產(chǎn)生的一組植物，即通過培養(yǎng)單倍體組織然后不伴隨細(xì)胞分裂而加倍其染色體量以產(chǎn)生具有雙倍體數(shù)量的染色體的植物，其中每個(gè)染色體對(duì)由兩個(gè)復(fù)制的染色體組成。因此，DH種系通常顯示很小或無遺傳差異?！捌贩N”或“栽培種”為用于商業(yè)生產(chǎn)的植物種系，當(dāng)其繁殖時(shí)，其特征是明顯的、穩(wěn)定的和均一的。“加倍單倍體”(DH)種系指通過小孢子胚胎發(fā)生(microsporeembryogenesis)方法產(chǎn)生的種系，其中從單個(gè)小孢子產(chǎn)生植物。通過該方法，產(chǎn)生了同質(zhì)的種系，即該種系內(nèi)的所有植物具有相同的遺傳構(gòu)成(geneticmakeup)。原始DH植物稱作DH1，而后續(xù)世代稱作DH2、DH3等。加倍單倍體過程是周知的，且對(duì)于幾種作物已經(jīng)確立。針對(duì)芥菜的過程描述于Thiagrarajah和Stringham(1993)(Acomparisonofgeneticsegregationintraditionalandmicrospore-derivedpopulationsofBrassicajunceain:L.CzernandCoss.PlantBreeding111:330-334)。術(shù)語(yǔ)“高油酸”指根據(jù)上下文所指的芥菜或其他蕓薹屬物種，其油酸含量比野生型或其他參照品種或種系的高，更一般而言，其表明按重量計(jì)包含至少70.0%油酸的脂肪酸組成。“總飽和脂肪酸(saturate)”指棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、花生酸(C20：0)、山萮酸(behenic)(C22:0)和二十四烷酸(C24:0)脂肪酸的組合百分比。本文中討論的脂肪酸濃度根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的標(biāo)準(zhǔn)過程確定。具體過程在實(shí)施例中闡述。脂肪酸濃度表示為按總脂肪酸含量的重量計(jì)的百分比?！鞍肓７N子(half-seed)”分析指其中對(duì)一個(gè)子葉(半粒種子)進(jìn)行脂肪酸分析，并且如果分析結(jié)果是陽(yáng)性，則使用剩下的半粒種子來生成植物的過程?！罢T變”為其中將已知在遺傳物質(zhì)中引起突變的藥劑施于植物材料的方法。在實(shí)驗(yàn)工作中，使用的誘變劑為甲磺酸乙酯(EMS)。其目的是為了在物種中造成新的遺傳變異性，并通常是以具體的性狀為目的進(jìn)行的。用于單倍體以誘導(dǎo)新穎變異的誘變的實(shí)例已由Swanson等(PlantCellRep.7:83-87,1988)描述。應(yīng)理解的是，多種其他技術(shù)如與外源核酸片段重組可適用于生成突變體，且通過使用某些技術(shù)，可將突變體的生成導(dǎo)向特定的核苷酸或氨基酸變化而非完全隨機(jī)的。所有此類引入核酸序列變化的方法理解為包含于本文中使用的術(shù)語(yǔ)“誘變”中?！霸偕鄙婕皬倪x定的植物或品種選擇能夠再生的細(xì)胞(例如，種子、小孢子、胚珠、花粉、營(yíng)養(yǎng)部分)。可任選地對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行誘變，之后基于誘變細(xì)胞的類型使用再生、受精和/或生長(zhǎng)技術(shù)來從這些細(xì)胞發(fā)育植物。適用的再生技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，例如：Pua等,Bio/Technology5:815-817(1987);Jain等,Euphytica40:75-81(1989);Szarejko等,ProceedingsofanInternationalSymposiumontheContributionofPlantMutationBreedingtoCropImprovement,2:355-378(1991);Cegielska-Taras和Oleiste–OilseedCrops,XVIII,21-30(1997);Ferrie和Keller,Proc.9thInternationalRapeseedCongr.,Cambridge,3:807–809(1995);Martini等,Vortr.Pflanzenzüchtg.45:133-154(1999);Swanson等,TheoreticalandAppliedGenetics.78:525-530(1989);以及KirtiandChopra,PlantBreeding102:1,73-78(1988)。在此上下文中，“M0”指未處理的種子；“M1”指暴露于誘變劑的種子及所得的植物；“M2”為自花授粉的M1植物的后代(種子和植物)；“M3”為自花授粉的M2植物的后代(種子和植物)；“M4”為自花授粉的M3植物的后代(種子和植物)；“M5”為自花授粉的M4植物的后代(種子和植物)；余此類推。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”或“穩(wěn)定”用于給定受遺傳控制的脂肪酸組分時(shí)意指該脂肪酸組分在世代間維持基本上相同的水平(例如優(yōu)選±5%)至少兩個(gè)世代并優(yōu)選至少三個(gè)世代。本發(fā)明的方法能夠產(chǎn)生具有在世代間高達(dá)±5%穩(wěn)定的改進(jìn)的脂肪酸組成的芥菜種系。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解上述提及的穩(wěn)定性可受溫度、位置、應(yīng)激和種植時(shí)機(jī)影響。因此，雙低菜種系之間脂肪酸分布的比較應(yīng)使用在類似生長(zhǎng)條件下產(chǎn)生的種子進(jìn)行。當(dāng)術(shù)語(yǔ)“蕓薹屬植物”用于本發(fā)明的上下文中時(shí)，這還包括該組的任何單基因轉(zhuǎn)變型(singlegeneconversion)。術(shù)語(yǔ)“單基因轉(zhuǎn)變的植物(singlegeneconvertedplant)”用于本文指那些通過稱為回交的植物育種技術(shù)發(fā)育成的蕓薹屬植物，在該技術(shù)中，通過回交技術(shù)除了將單基因轉(zhuǎn)移入某個(gè)品種，還回收了該品種基本上所有所需的形態(tài)和生理特性?；亟环椒捎糜诒景l(fā)明以改善特征或?qū)⑵湟胨銎贩N。術(shù)語(yǔ)“回交”用于本文指將雜種后代往回與回歸親本重復(fù)雜交，即與回歸親本(鑒定為“BC1”、“BC2”等)回交一次或多次。貢獻(xiàn)具有所需特征的基因的親本蕓薹屬植物植物稱為“非回歸的”或“供體親本”。該術(shù)語(yǔ)涉及下述事實(shí)，即非回歸親本在回交實(shí)驗(yàn)方案中僅用一次，因此并不再次出現(xiàn)。來自非回歸親本的一個(gè)或多個(gè)基因所轉(zhuǎn)移至的蕓薹屬植物稱作回歸親本，因?yàn)槠湓诨亟粚?shí)驗(yàn)方案中使用了數(shù)輪(Poehiman&Sleper,1994;Fehr,1987)。在典型的回交實(shí)驗(yàn)方案中，將目標(biāo)原始品種(回歸親本)與攜帶待轉(zhuǎn)移的目標(biāo)單基因的第二品種(非回歸親本)雜交。然后將從該雜交所得的后代再次與回歸親本雜交，并重復(fù)該過程直至獲得下述蕓薹屬植物，其中當(dāng)在相同環(huán)境條件下生長(zhǎng)時(shí)，按照5%顯著水平確定，除了來自非回歸親本的單一轉(zhuǎn)移基因，在轉(zhuǎn)變的植物中還基本上回收了所述回歸親本所有所需的形態(tài)和生理特性。合適的回歸親本的選擇是成功回交過程的重要步驟。回交實(shí)驗(yàn)方案的目標(biāo)是改變或取代原始品種中的單個(gè)性狀或特征。為實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)，對(duì)回歸品種的單基因進(jìn)行修飾或用來自非回歸親本的所需基因取代，同時(shí)保留原始品種的基本上所有其他所需的遺傳物質(zhì)，并因此保留所需的原始品種的生理和形態(tài)組成。具體非回歸親本的選取會(huì)取決于回交的目的。一個(gè)主要目的是將一些商業(yè)上所需的、農(nóng)學(xué)上重要的性狀加入所述植物。準(zhǔn)確的回交實(shí)驗(yàn)方案會(huì)取決于進(jìn)行改變的特征或性狀以確定適當(dāng)?shù)臏y(cè)試實(shí)驗(yàn)方案。盡管當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)，回交方法得到簡(jiǎn)化，但也可轉(zhuǎn)移隱性等位基因。在此情況下，可能必需引入對(duì)后代的測(cè)試以確定所需的特征是否已成功地轉(zhuǎn)移。已經(jīng)鑒定了許多按常規(guī)并不選用于新品種開發(fā)，但是可通過回交技術(shù)來改進(jìn)的單基因性狀。單基因性狀可以是或可以不是轉(zhuǎn)基因的，這些性狀的實(shí)例包括但不限于雄性不育，蠟狀淀粉，除草劑抗性，對(duì)細(xì)菌、真菌或病毒疾病的抗性，昆蟲抗性，增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，工業(yè)應(yīng)用，產(chǎn)量穩(wěn)定性和產(chǎn)量提高。這些基因通常通過核來遺傳。這些單個(gè)基因性狀中的幾種描述于美國(guó)專利5,959,185、5,973,234和5,977,445號(hào)。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)任何本文所述或可由本文推導(dǎo)的多肽的抗體可應(yīng)用于確定公開的等位基因之一的存在或表達(dá)，并區(qū)分突變型和野生型蛋白或其他突變體。在本申請(qǐng)中“改進(jìn)的特征”意指所述特征與參照值或特性相比以所需和/或有益的方式改變，所述參照可涉及芥菜野生型株或任意其他所考慮的蕓薹屬種系的等同特征。一種其特征可作為參照(或?qū)φ?的合適的(possible)野生型芥菜株為J96D-4830，但也可用許多其他的，且其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員方便地鑒定。在本申請(qǐng)中“后代”意指所有的后裔(descendant)，包括植物的子代(offspring)和衍生物，且包括第一、第二、第三和后續(xù)世代，且可通過自花授粉或通過與具有相同或不同基因型的植物雜交來產(chǎn)生，且可通過一系列合適的基因工程技術(shù)來修飾。在本申請(qǐng)中“育種”包括所有發(fā)育或繁殖植物的方法，且包括種內(nèi)和種間以及種系內(nèi)和種系間雜交以及所有合適的常規(guī)育種和人工育種技術(shù)。所需的性狀可通過常規(guī)育種方法轉(zhuǎn)移至其他芥菜種系，且還可通過種間雜交轉(zhuǎn)移至其他蕓薹屬物種，如歐洲油菜和蕪菁。常規(guī)育種方法和種間雜交方法以及其他在植物之間轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的方法均充分記載于文獻(xiàn)中。在本申請(qǐng)中“分子生物學(xué)技術(shù)”意指所有形式的對(duì)核酸序列的操作以改變其序列和表達(dá)，并包括插入、缺失或修飾序列或序列片段，以及直接將新序列通過定向或隨機(jī)重組使用任何合適的載體和/或技術(shù)引入生物的基因組。在本申請(qǐng)中“遺傳衍生的”當(dāng)用于例如短語(yǔ)“從親本種系遺傳衍生的”時(shí)意指所述特征完全或部分由所述植物遺傳構(gòu)成的一個(gè)方面所決定。在本申請(qǐng)中術(shù)語(yǔ)“蕓薹屬”可包含任何或所有屬于蕓薹屬的物種，包括歐洲油菜、芥菜、黑芥、Brassicacarinata、甘藍(lán)和蕪菁。用于本申請(qǐng)的雙低芥菜(CanolaBrassicajuncea)指產(chǎn)生具有下述油和粕質(zhì)量的種子的芥菜，所述油和粕質(zhì)量分別符合商業(yè)命名為“雙低菜”油或粕的要求(即，具有在種子油中按重量計(jì)少于2%的芥酸(Δ13-22:1)和在每克不含油的粕中少于30微摩爾的硫代葡萄糖酸鹽的芥菜物種植物)。本發(fā)明的多種基因和核酸序列可為重組序列。術(shù)語(yǔ)“重組”意指經(jīng)重組之物，因此當(dāng)提及核酸構(gòu)建體時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指由連接在一起或通過分子生物學(xué)技術(shù)手段產(chǎn)生的核酸序列組成的分子。當(dāng)提及蛋白或多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”指使用通過分子生物學(xué)技術(shù)手段產(chǎn)生的重組核酸構(gòu)建體表達(dá)的蛋白或多肽分子。當(dāng)提及遺傳組成時(shí)，術(shù)語(yǔ)“重組”指具有親本基因組中未出現(xiàn)的新的等位基因組合的配子或后代。重組核酸構(gòu)建體可包括連接于或經(jīng)操作才連接于天然與其不連接的核酸序列或天然與其在不同位置連接的核酸序列的核苷酸序列。因此提及核酸構(gòu)建體為“重組”表明對(duì)該核酸分子使用遺傳工程即通過人工介入進(jìn)行了操作。例如重組核酸構(gòu)建體可通過轉(zhuǎn)化引入宿主細(xì)胞。此類重組核酸構(gòu)建體可包含來源于相同宿主細(xì)胞物種的序列，或來源于不同宿主細(xì)胞物種，而經(jīng)分離并重新引入宿主物種的序列。重組核酸構(gòu)建體序列可變?yōu)檎先胨拗骷?xì)胞基因組，無論是作為宿主細(xì)胞原始轉(zhuǎn)化的結(jié)果，還是作為后續(xù)重組和/或修復(fù)事件的結(jié)果。本文中所有的脂肪酸百分比指按其中所述脂肪酸為一組分的油的總脂肪酸重量計(jì)的百分比。舉例而言，提及植物具有70%油酸含量表明油的脂肪酸組分包含70%的油酸。種群中的“多態(tài)性”指其中在特定基因座最常見的變體(或等位基因)具有不超過99%的種群頻率的情況。術(shù)語(yǔ)“雜合性”(H)用于當(dāng)種群中一部分個(gè)體在特定基因座具有不同等位基因時(shí)(與相同等位基因的兩個(gè)拷貝相對(duì))。雜合性是種群中的個(gè)體在該基因座為雜合的概率。雜合性通常表示為百分比(%)，范圍為0至100%，或?yàn)?至1的尺度?！凹兒闲浴被颉凹兒稀北砻鞣N群中的一部分個(gè)體在特定基因座具有同一等位基因的兩個(gè)拷貝。當(dāng)植物為加倍單倍體時(shí)，假定除非在單倍體復(fù)制過程中發(fā)生任何自發(fā)突變，否則所有基因座均為純合的。根據(jù)上下文所指，植物可在一個(gè)、幾個(gè)或所有基因座為純合的?！耙铩睘榫酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)所需的短的多核苷酸或寡核苷酸，其與待擴(kuò)增的多核苷酸的一部分互補(bǔ)。舉例而言，引物可為不超過50個(gè)核苷酸長(zhǎng)，優(yōu)選少于約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)，且最優(yōu)選少于約24個(gè)核苷酸長(zhǎng)。本文中使用的“分離的”核酸或多核苷酸指從其原始環(huán)境(例如，如果其為天然存在的，則從其天然環(huán)境)移出的組分。分離的核酸或多肽可含有少于50%、少于75%、少于90%和少于99.9%或少于任何50至99.9%之間的整數(shù)值的與其原始相關(guān)的細(xì)胞組分。使用PCR擴(kuò)增從而與其他細(xì)胞組分充分地可分辨(例如在凝膠上)的多核苷酸可例如被視為“分離的”。本發(fā)明的多核苷酸可為“基本上純的”，即具有使用本領(lǐng)域已知的具體純化技術(shù)所能取得的最高程度的純度?！半s交”指其中核酸的一條鏈與互補(bǔ)鏈通過堿基配對(duì)結(jié)合的過程。當(dāng)一個(gè)多核苷酸的至少一條鏈可在限定的嚴(yán)格條件下與另一多核苷酸的一條鏈退火時(shí)，這些多核苷酸對(duì)于彼此是“可雜交的”。雜交需要兩個(gè)多核苷酸含有基本上互補(bǔ)的序列；然而，取決于雜交的嚴(yán)格度，可容忍錯(cuò)配。通常，兩個(gè)序列在高嚴(yán)格度(如例如，在65℃在0.5xSSC水溶液中)的雜交需要所述序列在其整個(gè)序列上呈現(xiàn)某種高程度的互補(bǔ)性。中等嚴(yán)格度(如例如在65℃的2xSSC水溶液)和低嚴(yán)格度(如例如在55℃的2xSSC水溶液)的條件相應(yīng)地需要進(jìn)行雜交的序列之間較低的總體互補(bǔ)性。(1xSSC是0.15MNaCl，0.015M檸檬酸Na)。如用于本文中，上述溶液和溫度指雜交過程中的探針洗滌階段。術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格(低，中等)條件下雜交的多核苷酸”旨在涵蓋單鏈和雙鏈多核苷酸，盡管僅一條鏈會(huì)與另一多核苷酸的互補(bǔ)鏈雜交。在指定的溶液中的洗滌可在從幾分鐘至幾日的時(shí)間范圍內(nèi)進(jìn)行，而本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)方便地選擇適當(dāng)?shù)南礈鞎r(shí)間以就不同水平的同源性區(qū)分結(jié)合的序列。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了蕓薹屬植物，如芥菜植物，其能夠產(chǎn)生具有按重量計(jì)包含高百分比的油酸和低百分比的亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量的種子。在具體實(shí)施方案中，所述油酸可包含多于約70.0%、71.0%、72.0%、73.0%、74.0%、75.0%、76.0%、77.0%、78.0%、79.0%、80.0%、81.0%、82.0%、83.0%、84.0%或85.0%，包括所有的整數(shù)及其分?jǐn)?shù)或任何具有大于85%的值的整數(shù)的油酸。在具體實(shí)施方案中，所述脂肪酸的亞麻酸含量可為少于約5%、4%、3%、2.5%、2.0%、1.5%、1.0%、0.5%或0%，且包含所有整數(shù)及其分?jǐn)?shù)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，所述植物是芥菜，其種子具有包含按重量計(jì)至少70%油酸和按重量計(jì)少于3%亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量。在一個(gè)其他的實(shí)施方案中，所述植物是芥菜植物，其種子具有包含按重量計(jì)至少70.0%油酸和按重量計(jì)不超過約5%亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供蕓薹屬植物，如芥菜植物，其能夠產(chǎn)生具有如表11所示，包含按重量計(jì)高百分比的油酸和低百分比的亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量以及可分別包含少于約5.5%總飽和脂肪酸或>10%總飽和脂肪酸的低總飽和脂肪酸或高總飽和脂肪酸的種子。已知來自芥菜種子的油的組成與來自歐洲油菜的種子的油在脂肪酸組分(例如較高的芥酸含量)、精油(例如，異硫氰酸烯丙酯(allylisothiocyanate))和次要組分(例如，生育酚、金屬、鞣酸、酚類、磷脂、色體(colorbody)等)方面有所不同。已發(fā)現(xiàn)來自芥菜的種子中的油(包括提取油)與來自歐洲油菜的油相比氧化穩(wěn)定性更高，盡管來自芥菜的油通常具有更高水平的C18:3。(C.Wijesundera等,“CanolaQualityIndianMustardoil(Brassicajuncea)isMoreStabletoOxidationthanConventionalCanolaoil(Brassicanapus),”J.Am.OilChem.Soc.(2008)85:693–699)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供增加蕓薹屬植物油酸含量并減少亞麻酸含量的方法。此類方法可包括：(a)在來自具有大于55%的油酸含量和少于14%的亞麻酸含量的蕓薹屬種系的至少一些細(xì)胞中誘導(dǎo)誘變；(b)從所述經(jīng)誘變的細(xì)胞至少之一再生植物，并選擇具有包含至少70%油酸(或者如上所示油酸的閾濃度)和少于3%的亞麻酸(或者如上所示亞麻酸的閾濃度)的脂肪酸含量的再生植物；和(c)從所述再生的植物衍生出更多世代的植物，所述植物的更多世代的個(gè)體植物具有包含至少70%油酸(或者如上所示油酸的閾濃度)和少于3%的亞麻酸(或者如上所示亞麻酸的閾濃度)的脂肪酸含量。在一些實(shí)施方案中，所述蕓薹屬物種可為芥菜。術(shù)語(yǔ)“高油酸含量”和“低亞麻酸含量”涵蓋了上述可能的值的全部范圍。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可包括就減少的亞油酸含量(如上述可能值的范圍)選擇一種或多種種系，再生植物和更多世代的植物。在其他實(shí)施方案中步驟(c)可涉及選擇并培養(yǎng)來自步驟(b)的再生植物的種子。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可包括重復(fù)指定步驟直至達(dá)到所需的油酸含量和/或亞油酸含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了就增加的油酸含量和減少的亞油酸含量篩選單個(gè)種子的方法，包括：確定所述種子發(fā)芽一部分的脂肪酸的油酸含量；或亞油酸含量；或油酸含量和亞油酸含量的一種或多種；將一種或多種含量與參照值比較；和推出種子中可能的相對(duì)油酸、亞油酸或油酸和亞油酸含量。在具體實(shí)施方案中，用于分析的植物部分可為葉、子葉、莖、葉柄、柄/蒂/莖(stalk)或任何其他組織或組織片段(如具有與種子組成表現(xiàn)出可靠關(guān)聯(lián)的組成的組織)的部分或全部。在一系列實(shí)施方案中，發(fā)芽的部分可為葉的一部分。在某些實(shí)施方案中，推出種子脂肪酸組成的步驟可包括假定在所述葉中給定酸水平的顯著變化反映了種子中該酸水平類似的相對(duì)變化。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過分析葉組織對(duì)于蕓薹屬植物篩選單個(gè)植物種系的方法，所述單個(gè)植物種系的種子具有包含按重量計(jì)至少70%油酸和按重量計(jì)少于3%亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量。此外，可通過氣液層析分析所述葉組織的脂肪酸組成，其中可通過如大量種子(bulk-seed)分析或半粒種子分析等方法來進(jìn)行脂肪酸的提取。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供蕓薹屬植物，其可為芥菜植物，包含前述來自芥菜種系的等位基因。在某些實(shí)施方案中，所述植物在fad2-a和fad3-a基因座可為純合的，表現(xiàn)為突變體等位基因。在一個(gè)其他實(shí)施方案中，所述芥菜植物、植物細(xì)胞或其部分含有具有來自本文中公開的前述序列的核酸序列的等位基因。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可涉及從所述低油酸/該亞麻酸芥菜(～45%油酸和～14%亞麻酸)通過檢查BJfad2b基因存在與否來區(qū)分出HOLL，本發(fā)明的雙低級(jí)芥菜(≥70%油酸和≤5%亞麻酸)(作為參考，參見Yao等的美國(guó)專利公開20030221217號(hào))。這種區(qū)分可涉及如本領(lǐng)域所知的確證BJfad2a基因?yàn)殡p低級(jí)芥菜種系中僅有的功能性油酸脂肪酸去飽和酶基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，芥菜種系含有fad2和fad3基因，如公開于國(guó)際公開號(hào)WO2006/0248611A1，例示于其所附的圖1和3以及SEQIDNO:7、9、12和13。所得的突變體等位基因編碼delta-12脂肪酸去飽和酶蛋白，其例示于所附的圖2以及SEQIDNO:8、10和11。在其他實(shí)施方案中，所述芥菜種系可在fad2-a和fad3-a基因座含有突變，且所得的突變體等位基因可在預(yù)測(cè)的BJFAD2-a和BJFAD3-a蛋白的序列中編碼一個(gè)或多個(gè)突變。適用于本發(fā)明的fad2a和fad3a突變基因及其所得蛋白的代表性實(shí)例包括但不限于：公開于國(guó)際公開WO2006/079567A3號(hào)(例如，圖1和2，以及SEQIDNO:3和4)；國(guó)際公開WO2005/107590A2號(hào)(例如SEQIDNO:1至12)；美國(guó)專利6,967,243B2號(hào)(例如圖2和3，以及SEQIDNO:11、12、15、16、17和18)；以及歐洲公開1862551A1號(hào)(例如圖1至10，以及SEQIDNO:22至33)中的那些。引物對(duì)FAD22F：CAATCCCTCGCTCTTTCTCCTACC例示于SEQIDNO:1，而FAD26R：CCTTTCTTGTCACCTTCCCTGTCC例示于SEQIDNO:2。fad31片段通過引物對(duì)BNFD31CF(GAGGCTTGGACGACCACTTG)(SEQ.ID.NO.3)和BNFD31CR(GACTGGACCAACGAGGAATG)(SEQ.ID.NO.4)擴(kuò)增。突變體特異性引物FAD2GM(CGCACCGTGATGGTTAACGGTTT)(SEQ.ID.NO.5)和FAD3cGM(ATAAATAATGTTGATCTACTTAT)(SEQ.ID.NO.6)設(shè)計(jì)用于使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)fad2和fad32的突變體HOLL等位基因的目的。與本發(fā)明序列的同源性可通過與適當(dāng)?shù)暮怂崽结橂s交，通過用合適的引物的PCR技術(shù)或通過任何其他常用技術(shù)來檢測(cè)。在具體的實(shí)施方案中，提供了核酸探針，其可包含與本發(fā)明的等位基因的部分同源的序列。其他實(shí)施方案可涉及使用合適的引物對(duì)以擴(kuò)增或檢測(cè)本發(fā)明序列例如與增加的油酸含量相關(guān)的序列的存在。下述術(shù)語(yǔ)用于描述兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多核苷酸之間的序列關(guān)系：(a)“參照序列”，(b)“比較窗(comparisonwindow)”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，和(e)“基本上相同”。如本文中使用的“參照序列”為用作序列比較基礎(chǔ)的限定序列。參照序列可為指定序列的子集或其整體；例如，全長(zhǎng)cDNA或基因序列的區(qū)段，或完整的cDNA或基因序列。如本文中使用的“比較窗”是指多核苷酸序列中連續(xù)和指定的區(qū)段，其中在比較窗中的多核苷酸序列與參照序列(其不包含添加或缺失)相比為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)可包含添加或缺失(即缺口)。通常，比較窗長(zhǎng)度為至少20個(gè)連續(xù)核苷酸，并任選地可為30、40、50、100個(gè)或更長(zhǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為了避免由于在多核苷酸序列中包含缺口而導(dǎo)致與參照序列的高度相似性，通常引入缺口罰分并將其從匹配數(shù)中減去。用于比較的序列比對(duì)方法在本領(lǐng)域是周知的。因此，任何兩個(gè)序列之間百分比同一性的確定可使用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。此類數(shù)學(xué)算法的非限定性實(shí)例是Myers和Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比對(duì)算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的檢索相似性方法(search-for-similarity-method)；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264的算法，按照Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877修改?？衫眠@些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)(implementation)以供比較序列以確定序列同一性。此類實(shí)現(xiàn)包括但不限于：PC/Gene程序(可從Intelligenetics,MountainView,Calif.獲得)中的CLUSTAL；WisconsinGeneticsSoftwarePackage,Version8(可從GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDrive,Madison,Wis.,USA獲得)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用這些程序的比對(duì)可使用缺省參數(shù)進(jìn)行。CLUSTAL程序充分描述于Higgins等(1988)Gene73:237-244(1988);Higgins等(1989)CABIOS5:151-153;Corpet等(1988)NucleicAcidsRes.16:10881-90;Huang等(1992)CABIOS8:155-65;以及Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988，見上)的算法。對(duì)于ALIGN程序，當(dāng)比較氨基酸序列時(shí)，可使用PAM120加權(quán)殘基表(weightresiduetable)，缺口長(zhǎng)度罰分為12，而缺口罰分為4。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990，見上)的算法。BLAST核苷酸檢索可使用BLASTN程序，得分(score)=100，詞長(zhǎng)(wordlength)=12來進(jìn)行，以獲得與編碼本發(fā)明蛋白的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白檢索可使用BLASTX程序，得分=50，詞長(zhǎng)=3來進(jìn)行，以獲得與本發(fā)明的蛋白或多肽同源的氨基酸序列。就比較而言，為了獲得有缺口的比對(duì)，可利用Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.25:3389所述的GappedBLAST(BLAST2.0中)?；蛘撸墒褂肞SI-BLAST(BLAST2.0中)進(jìn)行迭代檢索，其檢測(cè)分子之間的遠(yuǎn)緣關(guān)系。參見Altschul等(1997，見上)。當(dāng)利用BLAST、GappedBLAST、PSI-BLAST時(shí)，可使用相應(yīng)程序(例如，對(duì)于核苷酸序列為BLASTN，對(duì)于蛋白為BLASTX)的缺省參數(shù)。比對(duì)還可通過審視(inspection)人工進(jìn)行。比對(duì)還可使用SequencherTM軟件(來自GeneCodesCorporation,AnnArbor,MI)進(jìn)行以供鑒定比對(duì)序列之間的同源性和變化，如果其存在。如本文中使用的“序列同一性”或“同一性”在兩個(gè)核酸或多肽序列的情境中，是指兩個(gè)序列中的殘基當(dāng)在指定的比較窗中以最大程度對(duì)應(yīng)進(jìn)行比對(duì)時(shí)是相同的。當(dāng)使用序列同一性百分比指蛋白時(shí)，發(fā)現(xiàn)并不相同的殘基位置常常是由于保守氨基酸取代而不同的，其中氨基酸殘基取代其他具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基，并因此并不改變分子的功能性質(zhì)。當(dāng)序列不同在于保守取代時(shí)，可向上調(diào)整序列同一性百分比以就取代的保守性進(jìn)行校正。因此類保守取代而不同的序列稱為具有“序列相似性”或“相似性”。進(jìn)行該調(diào)整的手段對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。通常這涉及將保守取代評(píng)分為部分而非完全的錯(cuò)配，由此增加了序列同一性百分比。因此，例如，當(dāng)給予相同的氨基酸1分而給予非保守取代零分時(shí)，給予保守取代零至1之間的評(píng)分。保守取代的評(píng)分例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,Calif.)中實(shí)現(xiàn)來加以計(jì)算。如本文中使用的“序列同一性百分比”意指通過在比較窗中比較兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)的序列來確定的值，其中比較窗中多核苷酸序列的部分與參照序列(其并不包含添加或缺失)相比為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)可包含添加或缺失(即缺口)。百分比是通過確定兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)以得到匹配位置數(shù)，并將匹配位置數(shù)除以比較窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比來計(jì)算的。術(shù)語(yǔ)多核苷酸序列“基本上相同”意指包含使用一種上述比對(duì)程序使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)與參照序列相比具有至少70%序列同一性，優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%，且最優(yōu)選至少95%序列同一性的序列的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道，這些值可經(jīng)適當(dāng)調(diào)整并考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、開讀框定位等以確定由兩個(gè)核苷酸序列編碼的蛋白的相應(yīng)同一性。術(shù)語(yǔ)“基本上相同”在肽的情境下表明肽在所指明的比較窗中包含與參照序列具有至少70%序列同一性，優(yōu)選80%，更優(yōu)選85%，最優(yōu)選與參照序列至少90%或95%序列同一性的序列。優(yōu)選地，最佳比對(duì)是使用Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比對(duì)算法進(jìn)行的。兩個(gè)肽序列基本上相同的指標(biāo)是一個(gè)肽與針對(duì)第二肽所產(chǎn)生的抗體具有免疫反應(yīng)性。因此，例如當(dāng)兩個(gè)肽僅因保守取代而不同時(shí)，一個(gè)肽基本上與第二肽相同?！盎旧舷嗨频摹彪墓蚕砣缟纤镜男蛄?，不過不相同的殘基位置可因保守氨基酸變化而不同。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“Omega-9”對(duì)于來自雙低菜的油分布意指具有包含按重量計(jì)至少68.0%油酸和按重量計(jì)少于或等于4.0%亞麻酸的脂肪酸含量的非氫化油。對(duì)于雙低菜植物，術(shù)語(yǔ)“Omega-9”意指雙低菜植物產(chǎn)生具有包含按重量計(jì)至少68.0%油酸和按重量計(jì)少于4.0%亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量的種子。在選定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含完整的開讀框(ORF)和/或之前公開的突變體fad2和fad3基因5’上游區(qū)的分離的DNA序列。本發(fā)明相應(yīng)地還提供預(yù)想的突變體蛋白的多肽序列，包含來自之前所述的突變體等位基因的突變。已知膜結(jié)合的去飽和酶，如FAD2，具有保守的組氨酸盒。在這些組氨酸盒之外的氨基酸殘基的變化也可影響FAD2酶活性(等,MolecularBreeding4:543-550,1998)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，本文中所述的突變體等位基因可用于植物育種。具體而言，本發(fā)明的等位基因可用于培育高油酸蕓薹屬物種，如芥菜、歐洲油菜、蕪菁、黑芥和Brassicacarinata。本發(fā)明提供用于將突變體等位基因與可選序列(alternativesequence)區(qū)分的分子標(biāo)記。本發(fā)明由此提供用于涉及具有本發(fā)明等位基因的植物的遺傳雜交的分離和選擇分析的方法。本發(fā)明由此提供用于來源于涉及具有本發(fā)明等位基因的植物的遺傳雜交的后代的分離和選擇分析的方法。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于鑒定具有所需脂肪酸組成或所需基因組特征的蕓薹屬植物如芥菜植物的方法。本發(fā)明的方法可例如涉及在基因組中確定特定FAD2和/或FAD3等位基因，如本發(fā)明的等位基因或野生型J96D-4830/BJfad2a等位基因的存在。在具體實(shí)施方案中，本方法可包括鑒定與一種鑒定的等位基因相關(guān)的核酸多態(tài)性或與本發(fā)明的一種等位基因相關(guān)的抗原決定簇的存在。此種確定可例如用多種技術(shù)如相關(guān)DNA片段的PCR擴(kuò)增、DNA指紋法、RNA指紋法、凝膠印跡和RFLP分析、核酸酶保護(hù)測(cè)定、相關(guān)核酸片段的測(cè)序、(單克隆或多克隆)抗體的生成或適應(yīng)于區(qū)分由相關(guān)等位基因產(chǎn)生的蛋白與該蛋白的其他變體或野生型形式的其他方法來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供通過確定本發(fā)明突變體等位基因的存在用于鑒定芥菜植物的方法，所述芥菜植物的種子具有包含按重量計(jì)至少70%油酸的內(nèi)源脂肪酸含量。在一些選定的實(shí)施方案中，本發(fā)明突變體等位基因的具體單個(gè)堿基對(duì)變化可用于設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR引物，例如利用3’錯(cuò)配?？蛇M(jìn)行多種引物組合，如在3’端具有“G/C”(用于擴(kuò)增野生型等位基因)或在3’端具有“A/T”(用于擴(kuò)增突變體等位基因)的正向引物或反向引物。在其他選定的實(shí)施方案中，本發(fā)明突變體等位基因的特定單個(gè)堿基對(duì)變化可用于設(shè)計(jì)等位基因特異性PCR引物，例如利用3’錯(cuò)配?？蛇M(jìn)行多種引物組合，如在3’端具有“C/G”(用于擴(kuò)增野生型等位基因)或在3’端具有“T/A”(用于擴(kuò)增突變體等位基因)的正向引物或反向引物。對(duì)于等位基因特異性PCR實(shí)驗(yàn)方案的示例性總結(jié)，參見Myakishev等,2001,GenomeResearch11:163-169,or等,1999,MolecularBreeding4:543-550。在其他實(shí)施方案中，多種用于檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)的方法可用于鑒定本發(fā)明的等位基因。此類方法可例如，包括TaqMan測(cè)定法或MolecularBeacon測(cè)定法(Tapp等,BioTechniques28:732-738)、Invader測(cè)定法(Mein等,GenomeResearch10:330-343,2000)、GoldenGate測(cè)定法(www.illumina.com)或基于單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)的測(cè)定法(Orita等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:2766-2770,1989)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含編碼突變的FAD2和FAD3蛋白的fad2和fad3編碼序列的蕓薹屬植物。此類突變的FAD2/FAD3蛋白與野生型FAD2蛋白相比可僅含有一個(gè)氨基酸變化。在代表性實(shí)施方案中，多種芥菜種系含有之前所述的突變的FAD2蛋白，其由之前所述的等位基因所編碼。可選擇此類等位基因以有效賦予本發(fā)明植物增加的油酸含量和減少的亞麻酸含量。在具體實(shí)施方案中，所需的等位基因可通過育種技術(shù)引入植物。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的等位基因可通過分子生物學(xué)技術(shù)包括植物轉(zhuǎn)化引入植物。在此類實(shí)施方案中，本發(fā)明的植物可產(chǎn)生具有包含按重量計(jì)至少約70%油酸和按重量計(jì)少于約3%亞麻酸或任何如上所示的其他油酸和亞麻酸含量閾值的內(nèi)源脂肪酸含量的種子。本發(fā)明的植物還可含有按重量計(jì)約70%至約85%的油酸，約70%至約78%的油酸，和約0.1%至約3%的亞麻酸，其中所述油組成遺傳衍生自親本種系。本發(fā)明的植物還可具有按重量計(jì)少于7.1%至少于約6.2%的總脂肪酸含量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物產(chǎn)生包含至少約70%油酸和少于3%亞麻酸的內(nèi)源脂肪酸含量的種子，其中所述油組成遺傳衍生自親本種系。在選定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有下述內(nèi)源油含量的蕓薹屬種子，其可為芥菜種子，所述油含量具有一個(gè)或多個(gè)前述實(shí)施方案所示的脂肪酸組成，且其中對(duì)于內(nèi)源油含量的遺傳決定子(geneticdeterminant)來源于本發(fā)明的突變體等位基因。此類種子可例如通過對(duì)每個(gè)本發(fā)明的突變體等位基因種系進(jìn)行自花授粉來獲得?；蛘?，此類種子可例如通過將所述突變體等位基因種系與第二親本雜交之后進(jìn)行選擇來獲得，其中所述第二親本可為任何其他蕓薹屬種系如芥菜種系，其為雙低級(jí)芥菜或非雙低級(jí)芥菜，或任何其他蕓薹屬物種如歐洲油菜、蕪菁、黑芥和Brassicacarinata。這些育種技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供遺傳穩(wěn)定的蕓薹屬植物，如芥菜植物，其發(fā)育出具有前述一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中公開的組分的成熟種子。此類植物可來源于具有本發(fā)明的突變體等位基因的芥菜種系。此類植物的油組成可遺傳衍生自親本種系。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生遺傳穩(wěn)定的蕓薹屬植物如芥菜植物的方法，所述植物產(chǎn)生具有包含前述一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案所指定的組成的內(nèi)源脂肪酸含量的成熟種子。本發(fā)明的方法可涉及下述步驟：將來自歐洲油菜的Omega-9基因(例如fad2a和fad3a)與其他蕓薹屬植物如芥菜雜交，以形成F1后代。F1后代可例如通過可包括自花授粉或發(fā)育加倍單倍體植物的手段來繁殖。通過將突變體FAD2等位基因和突變體FAD3等位基因組合，具有雙重突變體等位基因(fad2和fad3)的植物可比任何單個(gè)突變體植物具有更好的油脂肪酸分布?？蓪?duì)所得的后代就遺傳穩(wěn)定的植物進(jìn)行選擇，所述植物生成具有前述一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案公開的組成的種子。此類種子可例如具有穩(wěn)定的脂肪酸分布，其在總的可提取油中包含約7.1%至約6.5%的總飽和物含量。在某些變體中，后代自身可產(chǎn)生具有如上所示其他實(shí)施方案的組成的植物或油。具有按重量計(jì)大于約70%的油酸含量和按重量計(jì)少于約3%的亞麻酸含量。在選定的實(shí)施方案中，在本發(fā)明植物如來源于本發(fā)明突變體等位基因的植物中油酸的增加可伴隨亞油酸和亞麻酸的相應(yīng)減少，而其他脂肪酸可實(shí)質(zhì)上保持不變。闡明此類特征的數(shù)據(jù)示于本文中的表1、6-10和12-14。原始芥菜背景脂肪酸數(shù)據(jù)示于表2，而BC2F2半粒種子選定種系的脂肪酸數(shù)據(jù)示于表7、8和10。表12闡明了BC3F31/2種子數(shù)據(jù)，其具有非常高油酸和低亞麻酸的脂肪酸分布，此外還顯示了非常低水平的亞油酸。表14闡明了表12中所示的種系(BC3F31/2種子選擇，長(zhǎng)大并自交，然后測(cè)試了15個(gè)種子批次(seedbulk))的BC3F4種子數(shù)據(jù)(FAME對(duì)于全種子)。這些結(jié)果確證了見于表12(BC3F3)的分布，并顯示該分布是穩(wěn)定的。在一個(gè)方面，本發(fā)明提供具有穩(wěn)定、可遺傳的高油酸和低亞麻酸表型的植物。舉例而言，由本發(fā)明突變體等位基因所得的高油酸和低亞麻酸表型經(jīng)過M2、M3和M4世代為遺傳上可遺傳的。在多個(gè)方面，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)植物基因組中可表達(dá)編碼序列的拷貝數(shù)?！翱杀磉_(dá)的”意指編碼序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)即序列表明該序列編碼活性蛋白。無論如何，可表達(dá)的編碼序列在特定細(xì)胞中可能無法作為活性蛋白表達(dá)。這種“基因沉默”可例如通過多種同源轉(zhuǎn)基因失活機(jī)制在體內(nèi)發(fā)生。同源轉(zhuǎn)基因失活描述于其中在有義方向插入了轉(zhuǎn)基因的植物中，發(fā)生意料之外的基因和轉(zhuǎn)基因均下調(diào)的結(jié)果(Napoli等,1990PlantCell2:279-289)。此種共抑制的準(zhǔn)確分子基礎(chǔ)是未知的，盡管對(duì)于同源基因序列的失活存在至少兩種推定的機(jī)理。已提出通過甲基化的轉(zhuǎn)錄失活為一種機(jī)理，其中復(fù)制的DNA區(qū)發(fā)出基因沉默的內(nèi)源機(jī)理的信號(hào)。還提出了轉(zhuǎn)錄后機(jī)理，其中認(rèn)為基因和轉(zhuǎn)基因兩者的合并表達(dá)水平產(chǎn)生高水平的轉(zhuǎn)錄物，其觸發(fā)兩個(gè)信使的閾值誘導(dǎo)的降解(vanBokland等,1994,PlantJ.6:861-877)。在本發(fā)明中，基因組中的可表達(dá)的編碼序列相應(yīng)地可不全在特定細(xì)胞中表達(dá)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供芥菜植物，其中相對(duì)于用于誘變實(shí)驗(yàn)的野生型芥菜改變了脂肪酸去飽和酶的活性，改變了油酸含量或改變了亞麻酸含量。脂肪酸去飽和酶(“FAD”)意指在脂肪酸生物合成中呈現(xiàn)引入雙鍵活性的蛋白。舉例而言，F(xiàn)AD2/FAD3酶可以以在從油酸至亞油酸的生物合成中引入第二雙鍵的活性為特征。改變的去飽和酶活性可包括去飽和酶活性與參照植物、細(xì)胞或樣品相比的增加、減少或消除。在其他方面，去飽和酶活性的減少可包括消除編碼去飽和酶的核酸序列如本發(fā)明的核酸序列的表達(dá)。在本文中消除表達(dá)意指由該核酸序列編碼的功能性氨基酸序列并不以可檢測(cè)的水平產(chǎn)生。去飽和酶活性的減少可包括消除編碼去飽和酶的核酸序列如本發(fā)明編碼FAD2酶或FAD3酶的序列的轉(zhuǎn)錄。在本文中消除轉(zhuǎn)錄意指由所述核酸序列編碼的mRNA序列并不以可檢測(cè)的水平轉(zhuǎn)錄。去飽和酶活性的減少還可包括從編碼去飽和酶的核酸序列產(chǎn)生截短的氨基酸序列。在本文中產(chǎn)生截短的氨基酸序列意指由所述核酸序列編碼的氨基酸序列失去由野生型核酸序列編碼的功能性氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。此外，去飽和酶活性的減少可包括產(chǎn)生變體去飽和酶氨基酸序列。在本文中產(chǎn)生變體氨基酸序列意指所述氨基酸序列具有一個(gè)或多個(gè)與野生型核酸序列編碼的氨基酸序列不同的氨基酸。如本文中更加詳細(xì)地討論，本發(fā)明公開了本發(fā)明的突變體種系產(chǎn)生與野生型種系J96D-4830相比具有變體氨基酸的FAD2和FAD3酶。可將多種類型的突變?nèi)缫拼a突變、取代和缺失引入核酸序列用于減少去飽和酶活性的目的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供新穎的FAD2/FAD3多肽序列，其可根據(jù)本發(fā)明其他實(shí)施方案加以修飾。在本領(lǐng)域公知可在多肽結(jié)構(gòu)中進(jìn)行一些修飾和變化而基本上不改變?cè)撾牡纳飳W(xué)功能以獲得生物學(xué)上等同的多肽。如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“保守氨基酸取代”指在肽的給定位置用一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)，其中可進(jìn)行所述取代而無顯著的功能喪失或取得，以獲得生物學(xué)上等同的多肽。在進(jìn)行此類變化時(shí)，類似氨基酸殘基的取代可基于側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性例如其大小、電荷、疏水性、親水性等來進(jìn)行，且此類取代可通過常規(guī)測(cè)試測(cè)定其對(duì)肽功能的作用。相反，如本文中使用的術(shù)語(yǔ)“非保守氨基酸取代”指在肽中給定位置用一個(gè)氨基酸取代另一個(gè)，其中所述取代導(dǎo)致肽功能的顯著喪失或取得，以獲得并生物學(xué)上不等同的多肽。在一些實(shí)施方案中，保守氨基酸取代可在用一個(gè)氨基酸殘基取代另一個(gè)具有類似親水性值(hydrophilicityvalue)(例如，在正負(fù)2.0范圍內(nèi)的值)的氨基酸殘基時(shí)發(fā)生，其中對(duì)氨基酸殘基給定下述親水性值(詳見美國(guó)專利4,554,101號(hào))：Arg(+3.0)；Lys(+3.0)；Asp(+3.0)；Glu(+3.0)；Ser(+0.3)；Asn(+0.2)；Gln(+0.2)；Gly(0)；Pro(-0.5)；Thr(-0.4)；Ala(-0.5)；His(-0.5)；Cys(-1.0)；Met(-1.3)；Val(-1.5)；Leu(-1.8)；Ile(-1.8)；Tyr(-2.3)；Phe(-2.5)；和Trp(-3.4)。非保守氨基酸取代可在殘基的親水性值顯著不同，例如相差超過2.0時(shí)發(fā)生。在其他實(shí)施方案中，保守氨基酸取代可在用一個(gè)氨基酸殘基取代另一個(gè)具有類似親水性指數(shù)(hydrophathicindex)(例如，在正負(fù)2.0范圍內(nèi)的值)的氨基酸殘基時(shí)發(fā)生。在此類實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)氨基酸殘基可基于其疏水性和電荷特征給定親水性指數(shù)，如下所述：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；Trp(-0.9)；Tyr(-1.3)；Pro(-1.6)；His(-3.2)；Glu(-3.5)；Gin(-3.5)；Asp(-3.5)；Asn(-3.5)；Lys(-3.9)；和Arg(-4.5)。非保守氨基酸取代可在殘基的親水性指數(shù)顯著不同，例如相差超過2.0時(shí)發(fā)生。舉例而言，據(jù)此，針對(duì)在對(duì)應(yīng)于BJfad2-a中的氨基酸105的位置的野生型His(-3.2)進(jìn)行的下述氨基酸取代會(huì)是非保守取代：Ile(+4.5)；Val(+4.2)；Leu(+3.8)；Phe(+2.8)；Cys(+2.5)；Met(+1.9)；Ala(+1.8)；Gly(-0.4)；Thr(-0.7)；Ser(-0.8)；和Trp(-0.9)。在其他實(shí)施方案中，保守氨基酸取代可在用一個(gè)氨基酸殘基取代另一個(gè)相同類型的氨基酸殘基時(shí)發(fā)生，其中氨基酸分為非極性、酸性、堿性和中性類型，如下所述：非極性：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met；酸性：Asp、Glu；堿性：Lys、Arg、His；中性：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、GIn、Tyr。非保守氨基酸取代可在殘基并不落在相同類型中時(shí)發(fā)生，如用堿性氨基酸取代中性或非極性氨基酸。本發(fā)明還包括從本文中所述的芥菜植物的種子獲得的粕，其中此種粕可為壓碎的種子、壓濾餅(經(jīng)擠壓排出油，但未經(jīng)溶劑或其他化學(xué)提取的種子)、白色薄片(經(jīng)壓碎，并經(jīng)溶劑如己烷提取以去除更多油的種子)，或來自常規(guī)壓碎和溶劑提取方法的粕的形式。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，對(duì)芥菜種子進(jìn)行例如WO2008024840A2、WO03/053157、美國(guó)專利5,844,086號(hào)；WO97/27761；美國(guó)專利申請(qǐng)2005/0031767號(hào)，或J.Caviedes,“AqueousProcessingOfRapeseed(Canola),”ThesisForDegreeOfMasterOfAppliedScience,UniversityOfToronto1996,pages1-147中所述類型的水處理。本發(fā)明的油還可用于非烹調(diào)或膳食方法和組合物。這些用途中的一些可為工業(yè)的、化妝品的或醫(yī)藥的。本發(fā)明的油還可用于本發(fā)明的油適合的任何應(yīng)用。一般而言，本發(fā)明的油可用于在多種應(yīng)用如潤(rùn)滑劑、潤(rùn)滑劑添加劑、金屬加工液、液壓液和耐火液壓液中替代例如礦物油、酯、脂肪酸或動(dòng)物脂肪。本發(fā)明的油還可用作原料用于產(chǎn)生修飾油的方法。用于修飾本發(fā)明的油的技術(shù)的實(shí)例包括分餾、氫化、改變油的油酸或亞麻酸含量，以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修飾技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的油用于產(chǎn)生酯交換油、產(chǎn)生三硬脂酸甘油酯或用于電解質(zhì)液體組合物，該組合物可包含于電氣設(shè)備中。本發(fā)明油的工業(yè)用途的實(shí)例包括潤(rùn)滑組合物的組成部分(美國(guó)專利6,689,722號(hào)；亦參見WO2004/0009789A1)；燃料例如生物柴油(美國(guó)專利6,887,283號(hào)；亦參見WO2009/038108A1)；復(fù)印裝置的記錄材料(美國(guó)專利6,310,002號(hào))；粗油模擬物組合物(美國(guó)專利7,528,097號(hào))；混凝土的密封組合物(sealingcomposition)(美國(guó)專利5,647,899號(hào))；可加工的涂層劑(curablecoatingagnet)(美國(guó)專利7,384,989號(hào))；工業(yè)煎炸油；清潔配制劑(WO2007/104102A1；亦參見WO2009/007166A1)；和焊液中的溶劑(WO2009/069600A1)。本發(fā)明的油還可用于工業(yè)方法，例如，產(chǎn)生生物塑料(美國(guó)專利7,538,236號(hào))；和通過反向乳液聚合產(chǎn)生聚丙烯酰胺(美國(guó)專利6,686,417號(hào))。本發(fā)明油的化妝品用途的實(shí)例包括用作化妝品組合物中的潤(rùn)膚劑(emollient)；作為凡士林(petroleumjelly)的替代物(美國(guó)專利5,976,560號(hào))；作為肥皂的組成部分，或作為原料用于產(chǎn)生肥皂的方法(WO97/26318；美國(guó)專利5,750,481號(hào)；WO2009/078857A1)；作為口腔處理溶液的組成部分(WO00/62748A1)；作為衰老處理組合物的組成部分(WO91/11169)；和作為皮膚或毛發(fā)氣溶膠泡沫制備物的組成部分(美國(guó)專利6,045,779號(hào))。此外，本發(fā)明的油可用于醫(yī)療用途。舉例而言，本發(fā)明的油可用于針對(duì)感染的保護(hù)屏障(Barclay和Vega,“Sunfloweroilmayhelpreducenosocomialinfectionsinpreterminfants.”MedscapeMedicalNews<http://cme.medscape.com/viewarticle/501077>,2009年9月8日訪問)；而具有高量Omega-9脂肪酸的油可用于增強(qiáng)移植物的存活(美國(guó)專利6,210,700號(hào))。應(yīng)理解的是，前述為本發(fā)明的油適用的非烹調(diào)用途的非限定性實(shí)例。如前所述，本發(fā)明的油和修飾油可用于在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有用途中替代例如礦物油、酯、脂肪酸或動(dòng)物脂肪。應(yīng)理解的是，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修飾和替代。其某些具體實(shí)施方案描述了一般方法，并由下述實(shí)施例進(jìn)一步解釋。本發(fā)明當(dāng)然適用于所有雙低級(jí)芥菜物種以及所有非雙低級(jí)芥菜物種。本發(fā)明還可適用于所有其他蕓薹屬物種，包括芥菜、黑芥和Brassicacarinata以產(chǎn)生基本上相似的結(jié)果。還應(yīng)理解的是，下述實(shí)施例并不旨在將本發(fā)明限定于公開的具體形式，而是說本發(fā)明應(yīng)涵蓋落在本發(fā)明范圍之內(nèi)的所有修飾、等同和替代物。實(shí)施例實(shí)施例1回交參照?qǐng)D1，為了完全回收芥菜的遺傳背景的高油酸-低亞麻酸選擇個(gè)體和芥菜親本(Zem1、Zem2和ZESkorospelka)之間的一個(gè)或多個(gè)回交(BC3和BC4)。在回交程序中僅使用零芥酸的芥菜種系，因?yàn)檫@將允許fad2和fad3突變體等位基因與FAE基因在非競(jìng)爭(zhēng)性情況下的完全表達(dá)。在每次進(jìn)一步的回交(例如BC3、BC4)和后續(xù)的自花授粉(例如BC3F2、BC4F2)之后，首先對(duì)后代種子就fad2a和fad3a基因的存在進(jìn)行組織篩選(使用本文中更加詳述的標(biāo)記)，然后繼續(xù)生長(zhǎng)至開花以用于后續(xù)的回交。對(duì)從選定種系收獲的種子進(jìn)行使用半粒種子的油分布分析，非破壞性單個(gè)全種子的NIR分析，或單個(gè)種子的NIR分析(FTNIR)。之后，將含有增加的油酸水平和減少的亞麻酸水平的樣品植于土壤中并生長(zhǎng)至成熟。從這些植物產(chǎn)生了自交種子，并對(duì)大量種子分析代表高油酸和低亞麻酸的油分布。鑒定了具有范圍在67-80%內(nèi)的油酸和少于5%的亞麻酸的選擇個(gè)體。將這些選擇個(gè)體彼此互交以產(chǎn)生所需的脂肪酸分布。分離了來自葉組織的基因組DNA，并就已知賦予種子油中高油酸和低亞麻酸表型的對(duì)于fad2a和fad3a基因特異性的突變的存在進(jìn)行篩選。植物的表型(葉的形狀和紋理(texture))近似芥菜親本。植物還在與親本芥菜類似的田間條件(fieldcondition)下呈現(xiàn)裂果抗性(podshatteringresistance)和干旱耐受性。特異于CC基因組和不需要的AA基因組區(qū)的SSR標(biāo)記不再出現(xiàn)于芥菜x歐洲油菜與芥菜回交的后代中。將從芥菜和Omega-9歐洲油菜種系收集的葉組織凍干以供遺傳指紋法。在使用多種植物生成F1個(gè)體的情況下，還收集了來自全部祖先的組織以覆蓋可能在后續(xù)世代中觀察到的等位基因。如果未收集親本組織，則實(shí)施另一個(gè)選項(xiàng)，其中收集來自每個(gè)親本種子批次(來源)的六個(gè)植物的隨機(jī)樣品。從每個(gè)種系最多六個(gè)個(gè)體分離DNA，并將來自每個(gè)個(gè)體的相等等分試樣匯集以構(gòu)成用于遺傳指紋法的親本對(duì)照。用于回交程序的所有Omega-9歐洲油菜種系的遺傳指紋之前已經(jīng)確立，并代表在這些種系中從所有A基因組和C基因組連鎖群收集的數(shù)據(jù)。為了進(jìn)一步改進(jìn)結(jié)果的詮釋和可靠性，收集了葉組織并分離DNA，且還對(duì)蕪菁、黑芥和甘藍(lán)登錄項(xiàng)(accession)制備了DNA樣品池(samplepool)用于推定地鑒定分別對(duì)應(yīng)于A、B和C基因組的等位基因的目的。用一組SSR標(biāo)記篩選芥菜、歐洲油菜、蕪菁、黑芥和甘藍(lán)池。除了對(duì)所觀察的DNA片段收集信息之外，記錄了對(duì)于無效等位基因(nullallele)的信息。收集的基因分型信息儲(chǔ)存于GeneflowTM基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)選定的芥菜和歐洲油菜種系有信息意義(informative)的SSR標(biāo)記的鑒定使用GeneflowTM基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)的多態(tài)性報(bào)道功能來達(dá)成。標(biāo)記協(xié)助選擇以減少特異于歐洲油菜的基因組區(qū)是在回交世代中通過用經(jīng)由親本篩選鑒定的多態(tài)性SSR標(biāo)記篩選回交種群來進(jìn)行的。除了多態(tài)性共顯性標(biāo)記之外，還將對(duì)于芥菜種系評(píng)分為無效的標(biāo)記用于標(biāo)記協(xié)助選擇所需的A和B基因組區(qū)。用于推進(jìn)(advancement)的植物的選擇是通過育種和實(shí)驗(yàn)室焦點(diǎn)使用表型和基因型觀察來進(jìn)行的。將基于標(biāo)記分布不具有Omega-9歐洲油菜CC基因組以及不需要的AA基因組區(qū)段的后代植物選用于推進(jìn)至下一步驟。實(shí)施例2開發(fā)芥菜特異性標(biāo)記開發(fā)了可檢測(cè)與FAD2b相關(guān)的BB基因組DNA和其他可從黑芥和芥菜(代表BB基因組)獲得的序列的存在性的DNA標(biāo)記。為了標(biāo)記開發(fā)，開發(fā)了加倍單倍體定位種群(doublehaploidmappingpopulation)。此外，從已知的B基因組序列開發(fā)了DNA(SSR和SNP)標(biāo)記。這些標(biāo)記能夠確證轉(zhuǎn)變種系中芥菜背景的回收程度?？偣?931個(gè)歐洲油菜SSR標(biāo)記，主要含有二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基序，可用于親本篩選。目前正將這些標(biāo)記對(duì)一組屬于芥菜(Zem1、Zem2和ZESkorospelka種系)、Omega-9歐洲油菜、蕪菁、黑芥和甘藍(lán)的蕓薹屬種系進(jìn)行篩選。該篩選提供了兩類信息。第一，因?yàn)檫@些SSR標(biāo)記是從歐洲油菜基因組開發(fā)的，該篩選提供了關(guān)于其在其他基因組中的效用的信息，并允許鑒定特異性對(duì)應(yīng)于AA、BB或CC基因組的等位基因。第二，該篩選允許鑒定核心組的標(biāo)記以供用于芥菜定位和性狀滲入(traitintrogression)。除了上述提及的標(biāo)記之外，就可用于芥菜的SSR標(biāo)記檢索了公共數(shù)據(jù)庫(kù)。鑒定了總計(jì)438個(gè)公開的SSR，其中101個(gè)來自歐洲油菜(AACC基因組)，113個(gè)來自黑芥(BB基因組)，95個(gè)來自甘藍(lán)(CC基因組)且129個(gè)來自蕪菁(AA基因組)。在這些中，鑒定了113個(gè)來自黑芥的SSR，129個(gè)來自蕪菁的SSR和一些來自歐洲油菜的SSR潛在地可用于芥菜。將來自我們目前收集的選擇性標(biāo)記，以及從已知的B基因組序列開發(fā)的SSR和SNP標(biāo)記，用于在回交育種中確證芥菜背景的存在。從親本篩選鑒定的有信息意義的標(biāo)記也用于構(gòu)建芥菜連鎖圖，以及芥菜和歐洲油菜之間的比較圖以鑒定共享的標(biāo)記基因座。在芥菜中定位滲入的fad2a和fad3a基因座以提供證據(jù)表明其已經(jīng)成功地滲入芥菜的AA基因組。通過使用這些芥菜特異性標(biāo)記，鑒定了固有的突變體fad2a、fad2b、fad3a和fad3b序列以在具有改進(jìn)的脂肪酸分布的選定種系中定位fad2和fad3變異。表3顯示了七個(gè)(7)芥菜和三個(gè)(3)Omega-9歐洲油菜近交系之間的種間雜交結(jié)果。表4顯示了芥菜/Omega-9歐洲油菜(F1種間雜種)FAD標(biāo)記篩選結(jié)果。表5顯示了芥菜//芥菜/Omega-9歐洲油菜(BC1)GOI篩選結(jié)果。表6顯示了芥菜*2//芥菜/Omega-9歐洲油菜(BC2F1)GOI篩選結(jié)果。實(shí)施例3B基因組的回收和確定如前所述，使用選用于BB基因組的標(biāo)記篩選了呈現(xiàn)高油酸和低亞麻酸的種子油分布的自花授粉和加倍單倍體植物。確證BB基因組存在于轉(zhuǎn)變的種系中。這些突變體芥菜種系還在選用于歐洲油菜的陽(yáng)性C基因組標(biāo)記數(shù)上顯示出減少(或完全缺乏)。這些分布通過本領(lǐng)域已知的其他回交和自交技術(shù)進(jìn)一步增強(qiáng)，其改進(jìn)了該種系的農(nóng)藝性，例如減少生產(chǎn)延遲(yielddrag)、減少裂果、改變多種生長(zhǎng)區(qū)的成熟性、增加應(yīng)激耐受性、增加疾病抗性等。使用了三種不同的方法用于在呈現(xiàn)所需種子油分布的歐洲油菜和芥菜種間雜交的自花授粉和DH后代中確定B基因組。A)分子標(biāo)記鑒定了能夠檢測(cè)歐洲油菜和芥菜種系之間的遺傳多態(tài)性的分子標(biāo)記。篩選了總計(jì)1931個(gè)歐洲油菜SSR標(biāo)記以鑒定可區(qū)分芥菜基因組與歐洲油菜的核心組SSR。此外，如實(shí)施例2所述，檢索了公共數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定其他用于親本篩選的標(biāo)記。因此，就其區(qū)分芥菜與歐洲油菜的能力調(diào)查了超過2300個(gè)SSR標(biāo)記。將來自該篩選的一組標(biāo)記用于確定芥菜基因組在后代中的富集或歐洲油菜基因組的減少或缺乏。另一標(biāo)記系統(tǒng)包括使用SNP標(biāo)記。通過聚生(consortium)開發(fā)了超過3000個(gè)SNP。生成了兩個(gè)高通量Illumina測(cè)定法(即，兩個(gè)1536路SNPOPA(OligoPoolAll))。將這兩個(gè)OPA(總計(jì)3072個(gè)SNP測(cè)定)在由所有三個(gè)四倍體歐洲油菜、芥菜和B.carinata以及蕓薹屬“TriangleofU”(1935)的所有三個(gè)二倍體祖先-黑芥、甘藍(lán)和蕪菁的種系組成的親本組中進(jìn)行篩選。鑒定了一組可毫無疑義地在后代中跟蹤芥菜片段的SNP。具體而言這些可在后代中確證B基因組存在的SNP包含于該組中。因此，通過使用大量有信息意義的SSR和SNP用于篩選后代植物，鑒定了那些具有高百分比B基因組的植物。在表征自花授粉和DH后代之后，針對(duì)歐洲油菜和芥菜連鎖圖通過使用分離后代構(gòu)建比較圖確認(rèn)了標(biāo)記基因座的圖譜位置(mappingposition)。該比較圖允許在種間交配之后鑒定潛在的標(biāo)記基因座重排、添加或缺失。B)熒光原位雜交使用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)確定后代中B基因組的存在和富集。將后代植物用于標(biāo)記分析并用于細(xì)胞學(xué)研究，如鑒定染色體數(shù)、非整倍性的發(fā)生和用于確定目標(biāo)的基因組區(qū)段。FISH是有力的工具，其可進(jìn)一步加強(qiáng)通過分子標(biāo)記獲得的信息。為此目的，將可毫無疑義地確定B基因組存在的候選SSR和SNP標(biāo)記序列用于抽取(pullout)大BAC克隆，然后將其用作鑒定為具有高百分比B基因組的候選后代植物的中期擴(kuò)散(metaphasespread)的探針。還使用計(jì)算方法鑒定了BAC序列，前提是所述BAC序列可從數(shù)據(jù)庫(kù)得到。如果確然如此，在計(jì)算機(jī)中鑒定的BAC可從相應(yīng)的來源獲得并用于FISH實(shí)驗(yàn)。C)基因組原位雜交基因組原位雜交(GISH)技術(shù)用于當(dāng)候選后代植物的染色體可用全核BB基因組DNA探測(cè)并使用總芥菜DNA作為競(jìng)爭(zhēng)性未標(biāo)記探針時(shí)。對(duì)芥菜中BB基因組染色體的強(qiáng)雜交表明后代中BB基因組的存在。將具有所需種子油分布和歸于芥菜的等位基因的樣品用于回交和另外的自花授粉。在分離群中，使用MAS以在最多數(shù)量的可能的多態(tài)性基因座回收優(yōu)秀的基因型，同時(shí)維持所需的表型。對(duì)回交后代用SSR或SSP標(biāo)記進(jìn)行基因分型，著重于避免選擇呈現(xiàn)與歐洲油菜相關(guān)的A和C基因組的等位基因。當(dāng)需要大量基因座以獲得所需表型時(shí)，該過程是有效的。實(shí)施例4對(duì)油分布的進(jìn)一步修飾和測(cè)試油分布對(duì)油種子的進(jìn)一步改進(jìn)是通過組合公開于公開號(hào)US2008/0168587的B基因組fad2、fad3突變或在黑芥或在芥菜種子中新產(chǎn)生的突變來達(dá)成的。在一個(gè)實(shí)例中，雜交是在多個(gè)種系之間進(jìn)行的，鑒定了選擇個(gè)體，并通過組合這些選擇個(gè)體產(chǎn)生了具有類似農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的其他穩(wěn)定的高油酸和低亞麻酸選擇個(gè)體。其他潛在的獲得和/或鑒定其他來源的突變體fad2b和/或fad3b基因的方式包括，例如：通過已知的種質(zhì)，通過快中子/EMS突變體，通過RNAi的應(yīng)用，通過鋅指介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)的調(diào)控?？赏ㄟ^任何上述方法減少或消除fad2b和fad3b酶的表達(dá)水平。一旦獲得/鑒定了基因，將突變體FAD基因通過下述步驟轉(zhuǎn)移入芥菜植物：(a)將DAS’芥菜種系與具有突變體fad2b基因和/或fad3b基因的第二黑芥、B.carinata或芥菜植物雜交；(b)使用分子標(biāo)記跟蹤fad2b基因和/或fad3b基因的滲入；(c)從步驟(a)的雜交獲得種子；(d)分析種子的FAP，然后從種子選擇個(gè)體培養(yǎng)可育的植物；(e)從步驟(d)的自花授粉植物獲得后代種子；(f)在不同環(huán)境下對(duì)后代進(jìn)行溫室和田間測(cè)試；和(g)在后代中鑒定那些具有<3%的亞麻酸值和約68%至約80%之間的油酸值的種子。FAD2B和FAD3B酶的下調(diào)是通過在天然序列內(nèi)的編碼區(qū)或調(diào)節(jié)域的缺失、插入誘變來達(dá)成的。實(shí)施例5雜種芥菜種子油分布HOLL油分布表現(xiàn)在通過產(chǎn)生含有細(xì)胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)(參見例如Ogura，歐洲油菜CMS126-1)及其相應(yīng)的育性恢復(fù)背景的HOLL親本種系而產(chǎn)生的雜種中。實(shí)施例6將農(nóng)藝學(xué)、除草劑和殺蟲劑性狀引入HOLL芥菜(HOLLJuncea)除草劑抗性性狀(咪唑啉酮抗性)：歐洲油菜(BASF)中的咪唑啉酮抗性性狀包含位于LG01(AA基因組，距草甘膦抗性插入位點(diǎn)大約20cM)的PM2突變位點(diǎn)和位于LG11(CC基因組)的PM1突變位點(diǎn)。認(rèn)為ahas3對(duì)應(yīng)于AA基因組，而AHAS1對(duì)應(yīng)于CC基因組。Swanson等(Theor.ApplGenet.78:525-530,1989)表明ahas3基因本身即提供了對(duì)咪唑啉酮除草劑的耐受性。存在兩種另外的位于AA基因組上的AHAS基因：ahas2和ahas4。如果針對(duì)咪唑啉酮除草劑的抗性需要兩種ahas基因，則可鑒定位于BB基因組上的AHAS基因以供誘變。已發(fā)現(xiàn)在芥菜中，僅PM2無法獲得充分的抗性。因此，在芥菜中開發(fā)了兩種或更多種基因以提供充分的咪唑啉酮抗性。將Omega-9IMI歐洲油菜與芥菜雜交。種植了可育的種子，并將種間雜交的后代用咪唑啉酮除草劑噴灑以測(cè)定抗性。使用Invader測(cè)定的PM2的存在確證了PM2突變的存在。測(cè)定PM1突變以確定配對(duì)的BB基因組和CC基因組染色體導(dǎo)致PM1從歐洲油菜CC基因組遺傳轉(zhuǎn)移至芥菜的B基因組。如果AHAS3基因中的突變單獨(dú)提供了對(duì)咪唑啉酮除草劑的抗性，則將含有PM2的Omega-9歐洲油菜種系用于與芥菜種系雜交以消除將歐洲油菜種質(zhì)重新引入完成的HOLL芥菜種系的需要。對(duì)咪唑啉酮抗性芥菜的標(biāo)記協(xié)助選擇與BB基因組的回收和確定同時(shí)發(fā)生。一旦開發(fā)了HOLL芥菜咪唑啉酮抗性種系，將其用于后續(xù)將性狀滲入其他芥菜栽培種。將新的除草劑性狀滲入HOLL芥菜：對(duì)草甘膦抗性芥菜的開發(fā)是通過將藉由應(yīng)用鋅指技術(shù)將TIPS突變引入芥菜來達(dá)成的。在歐洲油菜中鑒定了五個(gè)共生同源基因(paralog)，其中的一個(gè)或兩個(gè)為最高表達(dá)形式的EPSPS基因。發(fā)現(xiàn)能夠得到草甘膦抗性表型的修飾的epsps基因存在于A基因組上，并雜交至Omega-9芥菜中以產(chǎn)生草甘膦抗性O(shè)mega-9芥菜。種植了分離的后代(T1S1、F2或BC1)。收集葉樣品以供DNA分離。對(duì)樣品噴灑除草劑選擇性標(biāo)記，然后用基因特異性標(biāo)記進(jìn)行接合性測(cè)試。通過從抗性和易感植物的隨機(jī)樣品匯集DNA以包含抗性和易感類型形成了大量分離子分析(BSA)池。對(duì)R和S池，以及優(yōu)異的栽培種和轉(zhuǎn)化的供體栽培種，使用SSR或SNP標(biāo)記進(jìn)行基因分型以鑒定推定的插入染色體。對(duì)具有偏斜的部分(skewedbulk)的染色體進(jìn)行選擇性基因分型以鑒定基因插入位點(diǎn)。使用標(biāo)記協(xié)助滲入以將目標(biāo)基因滲入所需的HOLL芥菜。本發(fā)明的其他實(shí)施方案隨著使分離和表征編碼特定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因成為可能的分子生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)，植物生物學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家對(duì)以下方面形成了強(qiáng)烈的興趣，即工程化改造植物的基因組以使其含有和表達(dá)外來的或者額外的基因，或表達(dá)修飾形式的天然基因(可能由不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng))，以便以特定的方式改變植物的性狀。此類外來的額外的和/或經(jīng)修飾的基因在本文中統(tǒng)稱為“轉(zhuǎn)基因”。在過去20年中，已經(jīng)對(duì)幾種作物開發(fā)了幾種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化和粒子轟擊。對(duì)于具體的蕓薹屬轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方案，參見對(duì)專利的參照(1993年2月23日授予Moloney等的美國(guó)專利5,188,958號(hào)；2000年4月18日授予Chen等的美國(guó)專利6,051,756號(hào)；2001年10月2日授予Tulsieram等的美國(guó)專利6,297,056號(hào))。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及要求保護(hù)的品種或種系的經(jīng)轉(zhuǎn)化形式。植物轉(zhuǎn)化涉及構(gòu)建會(huì)在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。此類載體包含DNA，該DNA包含在調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)控制下的或者與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操作連接的基因。表達(dá)載體可以含有一種或多種此類可操作連接的基因/調(diào)控元件組合。載體可以是質(zhì)粒形式，而且可以單獨(dú)或者與其他質(zhì)粒組合使用，以如下文所描述的那樣使用轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的蕓薹屬植物，從而將轉(zhuǎn)基因摻入蕓薹屬植物的遺傳物質(zhì)中。供蕓薹屬轉(zhuǎn)化用的表達(dá)載體：標(biāo)記基因表達(dá)載體包括至少一種與調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)可操作連接的遺傳標(biāo)記，其容許通過負(fù)選擇，即抑制不含該選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞生長(zhǎng)，或者通過正向選擇，即篩選由該遺傳標(biāo)記編碼的產(chǎn)物，回收含有所述標(biāo)記的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。許多通常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，包括例如編碼在代謝上使可以作為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)劑解毒的酶的基因，或者編碼對(duì)抑制劑不敏感的改變了的靶物的基因。幾種正向選擇方法也是本領(lǐng)域中已知的。一種通常用于植物轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記基因是新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(nptII)基因，其當(dāng)在植物調(diào)節(jié)信號(hào)控制下時(shí)，賦予對(duì)卡那霉素的抗性(Fraley等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,80:4803,1983)。另一種常用的選擇標(biāo)記基因是潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，其賦予對(duì)抗生素潮霉素的抗性(VandenElzen等,PlantMol.Biol.,5:299,1985)。賦予對(duì)抗生素的抗性的細(xì)菌來源的其他選擇標(biāo)記基因包括慶大霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和氨基糖苷-3’-腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶(adenyltransferase)，博來霉素抗性決定子(Hayford等,PlantPhysiol.86:1216,1988；Jones等,Mol.Gen.Genet.,210:86,1987；Svab等,PlantMol.Biol.14:197,1990；Hille等,PlantMol.Biol.7:171,1986)。其他選擇標(biāo)記基因賦予對(duì)除草劑如草甘膦、草銨膦(glufosinate)、2,4-D或溴苯腈(bromoxynil)的抗性(Comai等,Nature317:741-744,1985)；Lira等,WO2008/070845；Wright等,WO2005/107437和WO2007/053482；Gordon-Kamm等,PlantCell2:603-618,1990；和Stalker等,Science242:419-423,1988)。其他用于植物轉(zhuǎn)化的非細(xì)菌來源的選擇標(biāo)記基因包括例如小鼠二氫葉酸還原酶、植物5-烯醇丙酮酰莽草酸(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶(Eichholtz等,SomaticCellMol.Genet.13:67,1987；Shah等,Science233:478,1986)；Charest等,PlantCellRep.8:643,1990)。已利用編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因作為用于原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的標(biāo)記(Chalfie等,Science263:802,1994)。GFP和GFP的突變體可用作選擇性標(biāo)記。啟動(dòng)子：表達(dá)載體中包含的基因必須由包含調(diào)節(jié)元件(例如啟動(dòng)子)的核苷酸序列驅(qū)動(dòng)。數(shù)種類型的啟動(dòng)子現(xiàn)在是轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中公知的，可以單獨(dú)使用或者與啟動(dòng)子聯(lián)合使用的其他調(diào)節(jié)元件也是如此。如本文中所使用的，“啟動(dòng)子”包括提及在轉(zhuǎn)錄原始的上游的DNA區(qū)域，其涉及識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶和其他蛋白質(zhì)以起始轉(zhuǎn)錄?！爸参飭?dòng)子”是能夠在植物細(xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的例子包括優(yōu)先在某些組織如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子稱為“組織優(yōu)選性的”。僅在某些組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為“組織特異性的”?！凹?xì)胞類型”特異性啟動(dòng)子主要在一種或多種器官中的某些細(xì)胞類型(例如根或葉中的維管細(xì)胞)中驅(qū)動(dòng)表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是在環(huán)境控制下的啟動(dòng)子。可招致誘導(dǎo)型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的例子包括缺氧條件或光的存在。組織特異性的、組織優(yōu)選性的、細(xì)胞類型特異性的、和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成“非組成型”啟動(dòng)子類?！敖M成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下有活性的啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，將誘導(dǎo)型啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列與用于在蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接。通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)誘導(dǎo)劑而升高?？梢栽诒景l(fā)明中使用任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。參見Ward等,PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括但不限于：響應(yīng)銅的ACEI系統(tǒng)的啟動(dòng)子(Mett等,PNAS90:4567-4571,1993)；響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的玉米的In2基因(Hershey等,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)；和Gatz等,Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994))或來自Tn10的Tet阻抑物(Gatz等,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991))。特別優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是響應(yīng)植物正常不響應(yīng)的誘導(dǎo)劑的啟動(dòng)子。例示性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是來自類固醇激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性受糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(Schena等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:0421,1991)。組成型啟動(dòng)子：將組成型啟動(dòng)子與用于在蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接，或者將組成型啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與用于在蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接。可以在本發(fā)明中利用許多不同的組成型啟動(dòng)子。例示性的組成型啟動(dòng)子包括但不限于：來自植物病毒的啟動(dòng)子，如來自CaMV的35S啟動(dòng)子(Odell等,Nature313:810-812,1985)和來自如稻肌動(dòng)蛋白等基因的啟動(dòng)子(McElroy等,PlantCell2:163-171,1990)；來自泛素的啟動(dòng)子(Christensen等,PlantMol.Biol.12:619-632,1989；Christensen等,PlantMol.Biol.18:675-689,1992)；來自pEMU的啟動(dòng)子(Last等,Theor.Appl.Genet.81:581-588,1991)；來自MAS的啟動(dòng)子(Velten等,EMBOJ.3:2723-2730,1984)；來自玉米H3組蛋白的啟動(dòng)子(Lepetit等,Mol.Gen.Genetics231:276-285,1992；Atanassova等,PlantJournal2(3):291-300,1992)。ALS啟動(dòng)子，即歐洲油菜ALS3結(jié)構(gòu)基因5’的Xba1/NcoI片段(或與該Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)代表一種特別有用的組成型啟動(dòng)子。參見PCT申請(qǐng)WO96/30530。組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子：將組織特異性啟動(dòng)子與用于在蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接。任選地，將組織特異性啟動(dòng)子與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述編碼信號(hào)序列的核苷酸序列與用于在蕓薹屬中表達(dá)的基因可操作連接。用與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的感興趣基因轉(zhuǎn)化的植物排他地或優(yōu)先地在特定組織中生成轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物?？梢栽诒景l(fā)明中利用任何組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子。例示性組織特異性或組織優(yōu)選性啟動(dòng)子包括但不限于：根優(yōu)選性啟動(dòng)子，如來自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子(Murai等,Science23:476-482(1983)，和Sengupta-Gopalan等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-3324(1985))；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如來自cab或核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(rubisco)的啟動(dòng)子(Simpson等,EMBOJ.4(11):2723-2729(1985)，和Timko等,Nature318:579-582(1985))；花藥特異性啟動(dòng)子，如來自LAT52的啟動(dòng)子(Twell等,Mol.Gen.Genetics217:240-245(1989))；花粉特異性啟動(dòng)子，如來自Zm13的啟動(dòng)子(Guerrero等,Mol.Gen.Genetics244:161-168(1993))或小孢子優(yōu)選性啟動(dòng)子，如來自apg的啟動(dòng)子(Twell等,Sex.PlantReprod.6:217-224(1993))。通過將編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接至編碼感興趣蛋白質(zhì)的基因的5’和/或3’區(qū)域的手段來實(shí)現(xiàn)由轉(zhuǎn)基因生成的蛋白質(zhì)向亞細(xì)胞區(qū)室如葉綠體、液泡、過氧化物酶體、乙醛酸循環(huán)體、細(xì)胞壁或線粒體的轉(zhuǎn)運(yùn)或者分泌入質(zhì)外體中?？梢栽诘鞍踪|(zhì)合成和加工過程中測(cè)定在結(jié)構(gòu)基因的5’和/或3’端的靶向序列，其中編碼的蛋白質(zhì)最后被區(qū)室化(compartmentalized)。信號(hào)序列的存在將多肽引導(dǎo)至胞內(nèi)細(xì)胞器或亞細(xì)胞區(qū)室，或者分泌至質(zhì)外體。許多信號(hào)序列是本領(lǐng)域中已知的。參見例如Becker等,PlantMol.Biol.20:49(1992)；C.Knox等,PlantMol.Biol.9:3-17(1987)；Lerner等,PlantPhysiol.91:124-129(1989)；Fontes等,PlantCell3:483-496(1991)；Matsuoka等,Proc.NatlAcad.Sci.88:834(1991)；Gould等,J.Cell.Biol.108:1657(1989)；Creissen等,PlantJ.2:129(1991)；Kalderon等,Cell39:499-509(1984)；Steifel等,PlantCell2:785-793(1990)。通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)(它們是本領(lǐng)域中充分了解的)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī)方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來蛋白質(zhì)。可以通過由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所討論的已知方法來實(shí)現(xiàn)從植物生物量的蛋白質(zhì)提取。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，為商業(yè)生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)提供的轉(zhuǎn)基因植物是蕓薹屬植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，感興趣的生物量是種子。對(duì)于相對(duì)少量的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以主要經(jīng)由常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合DNA分子的近似染色體位置)來產(chǎn)生遺傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法，參見Glick和Thompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton269:284(1993)。關(guān)于染色體位置的圖譜信息對(duì)于主題轉(zhuǎn)基因植物的專有權(quán)保護(hù)是有用的。如果進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其他種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是否與主題植物具有共同來源(parentage)。圖譜比較會(huì)牽涉雜交、RFLP、PCR、SSR和測(cè)序，它們都是常規(guī)技術(shù)。用于蕓薹屬轉(zhuǎn)化的方法：已經(jīng)開發(fā)了許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括生物學(xué)和物理植物轉(zhuǎn)化方案。參見例如Miki等,“ProceduresforIntroducingForeignDNAintoPlants”于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson編(CRCPress,Inc.,BocaRaton,1993)第67頁(yè)-第88頁(yè)。另外，可獲得用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化及植物再生的表達(dá)載體和體外培養(yǎng)方法。參見例如Gruber等,“VectorsforPlantTransformation”于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,B.R.Glick和J.E.Thompson編(CRCPress,Inc.,BocaRaton,1993)第89頁(yè)-第119頁(yè)。土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化：用于將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的一種方法是基于土壤桿菌屬的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。參見例如Horsch等,Science227:1229(1985)。根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)是在遺傳上轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌(A.tumefaciens)的Ti質(zhì)粒和發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)的Ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因。參見例如C.I.Kado,Crit.Rev.PlantSci.10:1(1991)。適用于本發(fā)明目的的土壤桿菌載體系統(tǒng)和土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法的描述由Bhalla和Singh,NatureProtocols3(2):181-9(2008),Cardoza和Stewart,MethodsMolBiol.343:257-66(2006),Gruber等，見上文，Miki等，見上文，及Moloney等,PlantCellReports8:238(1989)提供。還可參見1996年10月8日授予的美國(guó)專利5,563,055(Townsend和Thomas)號(hào)。直接基因轉(zhuǎn)移：已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種植物轉(zhuǎn)化方法(統(tǒng)稱為直接基因轉(zhuǎn)移)作為土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的備選。植物轉(zhuǎn)化普遍可適用的方法是微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中在測(cè)量為1至4μm的微粒的表面上攜帶DNA。用生物射彈裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中，所述生物射彈裝置將微粒加速到300至600m/s的速度，其足以穿透植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。Sanford等,Part.Sci.Technol.5:27(1987)，J.C.Sanford,TrendsBiotech.6:299(1988)，Klein等,Bio/Technology6:559-563(1988)；J.C.Sanford,Physiol.Plant7:206(1990)，Klein等,Biotechnology10:268(1992)。還可參見1991年5月14日授予的美國(guó)專利5,015,580號(hào)(Christou等)；1994年6月21日授予的美國(guó)專利號(hào)5,322,783(Tomes等)。另一種用于將DNA物理投遞至植物的方法是對(duì)靶細(xì)胞的超聲處理。Zhang等,Bio/Technology9:996(1991)?；蛘撸呀?jīng)使用脂質(zhì)體和原生質(zhì)球融合來將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中。Deshayes等,EMBOJ.4:2731(1985)，Christou等,ProcNatl.Acad.Sci.U.S.A.84:3962(1987)。還已經(jīng)報(bào)道了使用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或多-L-鳥氨酸來將DNA直接攝取到原生質(zhì)體中。Hain等,Mol.Gen.Genet.199:161(1985)，和Draper等,PlantCellPhysiol.23:451(1982)。還已經(jīng)描述了原生質(zhì)體和全細(xì)胞和組織的電穿孔。Donn等,于AbstractsofVIIthInternationalCongressonPlantCellandTissueCultureIAPTC,A2-38,第53頁(yè)(1990)；D’Halluin等,PlantCell4:1495-1505(1992)，和Spencer等,PlantMol.Biol.24:51-61(1994)。轉(zhuǎn)化蕓薹屬靶標(biāo)組織后，上述選擇性標(biāo)記基因的表達(dá)容許使用本領(lǐng)域中現(xiàn)在公知的再生和選擇方法來優(yōu)先選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和/或植物。前述轉(zhuǎn)化方法通常會(huì)用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因品種。然后可以將轉(zhuǎn)基因品種與另一(非轉(zhuǎn)化的或經(jīng)轉(zhuǎn)化的)品種雜交，以產(chǎn)生新轉(zhuǎn)基因品種?；蛘?，可以使用植物育種領(lǐng)域中公知的傳統(tǒng)回交技術(shù)將已經(jīng)使用前述轉(zhuǎn)化技術(shù)工程化改造入特定的蕓薹屬種系中的遺傳性狀移入另一栽培種中。例如，可以使用回交方法來將工程化改造的性狀從公共的、非良種品種移入良種品種中，或者從在其基因組中含有外來基因的品種移入不含所述基因的一種或多種品種中。如本文中所使用的，“雜交”可以指簡(jiǎn)單的XxY雜交，或回交過程，這取決于上下文。蕓薹屬的組織培養(yǎng)：可以通過自花授粉或者通過組織培養(yǎng)和再生來進(jìn)行蕓薹屬種系的進(jìn)一步產(chǎn)生。蕓薹屬的各種組織的組織培養(yǎng)和自其再生植物是已知的。例如，通過組織培養(yǎng)繁殖蕓薹屬栽培種記載于下述任一，但不僅限于下述任一：Chuong等,“ASimpleCultureMethodforBrassicaHypocotylProtoplasts,”PlantCellReports4:4-6(1985);T.L.Barsby等,“ARapidandEfficientAlternativeProcedurefortheRegenerationofPlantsfromHypocotylProtoplastsofBrassicanapus,”PlantCellReports(Spring,1996);K.Kartha等,“InvitroPlantFormationfromStemExplantsofRape,”Physiol.Plant,31:217-220(1974);S.Narasimhulu等,“SpeciesSpecificShootRegenerationResponseofCotyledonaryExplantsofBrassicas,”PlantCellReports(Spring1988);E.Swanson,“MicrosporeCultureinBrassica,”MethodsinMolecularBiology,Vol.6,Chapter17,p.159(1990)。因此，本發(fā)明的另一方面是提供如下的細(xì)胞，其在生長(zhǎng)和分化時(shí)產(chǎn)生具有本發(fā)明芥菜種系生理和形態(tài)特征的蕓薹屬植物。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“組織培養(yǎng)物”指包含相同或不同類型的分離的細(xì)胞的組合物，或者組織成植物部分的此類細(xì)胞的集合。組織培養(yǎng)物的示例性類型為能產(chǎn)生組織培養(yǎng)物且在植物或植物部分中完整的原生質(zhì)體、愈傷組織、植物塊(plantclump)和植物細(xì)胞，如胚、花粉、花、種子、長(zhǎng)角果、葉、莖、根、根尖、花藥、雌蕊等。用于制備和維持植物組織培養(yǎng)物的手段是本領(lǐng)域中公知的。舉例而言，已經(jīng)使用構(gòu)成器官的組織培養(yǎng)物來產(chǎn)生再生植物。美國(guó)專利號(hào)5,959,185、5,973,234和5,977,445描述了某些技術(shù)。本發(fā)明還涉及用于通過將第一親本蕓薹屬植物與第二親本蕓薹屬植物雜交來產(chǎn)生蕓薹屬植物的方法，其中所述第一或第二親本蕓薹屬植物為包含至少一個(gè)突變的FAD基因(即FAD2和/或FAD3)的蕓薹屬植物。因此，任何此類使用本發(fā)明芥菜種系的方法為本發(fā)明的一部分：自交、回交、雜種產(chǎn)生、與種群雜交等。外來蛋白質(zhì)基因和農(nóng)藝學(xué)基因通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，可以以商業(yè)量生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)。如此，用于選擇和繁殖經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)(它們是本領(lǐng)域中充分了解的)產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)基因植物，它們以常規(guī)方式收獲，然后可以從感興趣的組織或總生物量提取外來蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^由例如Heney和Orr,Anal.Biochem.114:92-6(1981)所討論的已知方法來實(shí)現(xiàn)從植物生物量的蛋白質(zhì)提取。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，為商業(yè)生產(chǎn)外來蛋白質(zhì)提供的轉(zhuǎn)基因植物是雙低植物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)生物量是種子。對(duì)于相對(duì)少量的顯示較高表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物，可以主要經(jīng)由常規(guī)的RFLP、PCR和SSR分析(其鑒定整合的DNA分子的近似染色體位置)來產(chǎn)生遺傳圖譜。關(guān)于這方面的例示性方法，參見Glick和Thompson,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,CRCPress,BocaRaton269:284(1993)。關(guān)于染色體位置的圖譜信息對(duì)于主題轉(zhuǎn)基因植物的專有權(quán)保護(hù)是有用的。如果進(jìn)行未經(jīng)授權(quán)的繁殖和與其它種質(zhì)進(jìn)行雜交，則可以將整合區(qū)域的圖譜與可疑植物的類似圖譜進(jìn)行比較以確定后者是否與主題植物具有共同來源。圖譜比較會(huì)牽涉雜交、RFLP、PCR、SSR和測(cè)序，其均為常規(guī)技術(shù)。同樣地，可以通過本發(fā)明的手段在經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物中表達(dá)農(nóng)藝學(xué)基因。更具體地，可以對(duì)植物進(jìn)行遺傳工程化改造以表達(dá)多種有農(nóng)藝學(xué)興趣的表型。可以在這方面使用的例示性基因包括但不限于下文進(jìn)行歸類的基因：1.賦予對(duì)害蟲或疾病的抗性并編碼下列各項(xiàng)的基因：A.植物疾病抗性基因。植物防御常常由植物中的疾病抗性基因(R)產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)無毒性(Avr)基因產(chǎn)物之間的特異性相互作用激活?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對(duì)特定病原體株有抗性的植物。參見例如Jones等,Science266:789(1994)(克隆對(duì)黃枝孢霉(Cladosporiumfulvum)有抗性的番茄Cf-9基因)；Martin等,Science262:1432(1993)(對(duì)丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)有抗性的番茄Pto基因編碼蛋白質(zhì)激酶)；Mindrinos等,Cell78:1089(1994)(對(duì)丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)有抗性的擬南芥(Arabidopsis)RSP2基因)。B.賦予對(duì)害蟲如大豆胞囊線蟲的抗性的基因。參見例如PCT申請(qǐng)WO96/30517；PCT申請(qǐng)WO93/19181。C.蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)蛋白、其衍生物或以之為模型的合成多肽。參見例如Geiser等,Gene48:109(1986)，其披露了Btδ-內(nèi)毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA分子可以購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Manassas，Va.，例如以ATCC保藏號(hào)40098、67136、31995和31998購(gòu)得。D.凝集素。參見例如VanDamme等,PlantMolec.Biol.24:25(1994)的公開內(nèi)容，其披露了數(shù)種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列。E.維生素結(jié)合蛋白如抗生物素蛋白。參見PCT申請(qǐng)US93/06487。該申請(qǐng)教導(dǎo)了抗生物素蛋白和抗生物素蛋白同源物作為針對(duì)蟲害的殺幼蟲劑的用途。F.酶抑制劑，例如蛋白酶或蛋白水解酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。參見例如Abe等,J.Biol.Chem.262:16793(1987)(稻半胱氨酸蛋白水解酶抑制劑的核苷酸序列)；Huub等,PlantMolec.Biol.21:985(1993)(編碼煙草蛋白水解酶抑制劑I的cDNA的核苷酸序列)；Sumitani等,Biosci.Biotech.Biochem.57:1243(1993)(硝孢鏈霉菌(Streptomycesnitrosporeus)α-淀粉酶抑制劑的核苷酸序列)；和美國(guó)專利號(hào)5,494,813(Hepher和Atkinson，1996年2月27日授權(quán))。G.昆蟲特異性激素或信息素，如蛻皮類固醇或保幼激素、其變體、基于其的模擬物、或其拮抗劑或激動(dòng)劑。參見例如Hammock等,Nature344:458(1990)披露的克隆的保幼激素酯酶(即一種保幼激素滅活劑)的桿狀病毒表達(dá)的內(nèi)容。H.昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)后破壞受到影響的害蟲的生理學(xué)。例如，參見Regan,J.Biol.Chem.269:9(1994)(表達(dá)克隆產(chǎn)生編碼昆蟲利尿激素受體的DNA)；和Pratt等,Biochem.Biophys.Res.Comm.163:1243(1989)(在太平洋折翅蠊(Diplopterapuntata)中鑒定出allostatin)的公開內(nèi)容。還可參見Tomalski等的美國(guó)專利號(hào)5,266,317，其披露了編碼昆蟲特異性、麻痹性神經(jīng)毒素的基因。I.在自然界由蛇、黃蜂(wasp)等生成的昆蟲特異性毒液。例如參見Pang等,Gene116:165(1992)，是關(guān)于編碼蝎昆蟲毒性肽的基因在植物中的異源表達(dá)的公開內(nèi)容。J.負(fù)責(zé)超積累單萜、倍半萜、類固醇、異羥肟酸、類苯丙烷衍生物(phenylpropanoidderivative)或另一具有殺昆蟲活性的非蛋白質(zhì)分子的酶。K.牽涉對(duì)生物學(xué)活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、環(huán)化酶、轉(zhuǎn)氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、彈性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的還是合成的)。參見以Scott等名義的PCT申請(qǐng)WO93/02197，其披露了callase基因的核苷酸序列。含有幾丁質(zhì)酶編碼序列的DNA分子可以例如從ATCC以保藏號(hào)39637和67152獲得。還可參見Kramer等,InsectBiochem.Molec.Biol.23:691(1993)(其教導(dǎo)了編碼煙草天蛾幾丁質(zhì)酶的cDNA的核苷酸序列)和Kawalleck等,PlantMolec.Biol.21:673(1993)(其提供了歐芹ubi4-2多聚泛素基因的核苷酸序列)。L.刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。例如參見Botella等,PlantMolec.Biol.24:757(1994)(關(guān)于綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)和Griess等,PlantPhysiol.104:1467(1994)(其提供了玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列)的公開內(nèi)容。M.疏水矩肽(hydrophobicmomentpeptide)。參見PCT申請(qǐng)WO95/16776(抑制真菌植物病原體的鱟抗菌肽(Tachyplesin)的肽衍生物的公開內(nèi)容)和PCT申請(qǐng)WO95/18855(教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽)。N.膜通透酶、通道形成劑或通道阻斷劑。例如參見Jaynes等,PlantSci.89:43(1993)公開的天蠶抗菌肽-β(cecropin-β)，溶胞肽類似物(lyticpeptideanalog)的異源表達(dá)使轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì)青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。O.病毒侵入蛋白或自其衍生的復(fù)合毒素。例如，病毒外殼蛋白在經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞中的積累賦予對(duì)由衍生出該外殼蛋白基因的病毒及相關(guān)病毒招致的病毒感染和/或疾病形成的抗性。參見Beachy等,Ann.Rev.Phytopathol.28:451(1990)。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予了針對(duì)苜?；ㄈ~病毒、黃瓜花葉病毒、煙草線條病毒、馬鈴薯X病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕刻病毒、煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的外殼蛋白介導(dǎo)的抗性。同上。P.昆蟲特異性抗體或自其衍生的免疫毒素。如此，靶向昆蟲腸中的重要代謝功能的抗體會(huì)使受影響的酶失活，這殺死昆蟲。參見Taylor等,摘要號(hào)497,SeventhInt’lSymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions(Edinburgh,Scotland)(1994)(經(jīng)由生成單鏈抗體片段進(jìn)行的轉(zhuǎn)基因煙草中的酶促失活)。Q.病毒特異性抗體。參見例如Tavladoraki等,Nature366:469(1993)，其顯示了表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物受到保護(hù)免于病毒攻擊。R.在自然界由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白(developmental-arrestiveprotein)。如此，真菌內(nèi)α-l,4-D-多聚半乳糖醛酸酶(α-1,4-D-polygalacturonase)通過溶解植物細(xì)胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(homo--α-1,4-D-galacturonase)來促進(jìn)真菌定殖(colonization)和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放。參見Lamb等,Bio/Technology10:1436(1992)。編碼豆內(nèi)多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征由Toubart等,PlantJ.2:367(1992)描述。S.在自然界由植物生成的發(fā)育阻滯蛋白。例如Logemann等,Bio/Technology10:305(1992)顯示了表達(dá)大麥核糖體失活基因的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)真菌疾病具有升高的抗性。2.賦予對(duì)除草劑的抗性的基因：A.抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑，如咪唑啉酮或磺酰脲。在這類中的例示性基因編碼突變的ALS和AHAS酶，如分別由例如Lee等,EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theor.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。B.草甘膦(其抗性分別由例如突變體3-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPs)基因(通過引入重組核酸和/或天然EPSPs基因多種形式的體內(nèi)誘變)，aroA基因和草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶(GAT)基因賦予)，其他膦?；衔锶绮蒌@膦(來自鏈霉屬菌種包括吸水鏈霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridichromogenes)的phosphinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)基因)，以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和環(huán)異己酮(cyclohexone)(ACC酶抑制劑編碼基因)，參見，例如授予Shah等的美國(guó)專利4,940,835號(hào)和授予Barry等的美國(guó)專利6,248,876，其公開了可賦予植物草甘膦抗性的各種形式EPSPs的核苷酸序列。編碼突變體aroA基因的DNA分子可以以ATCC登錄號(hào)39256獲得，且該突變基因的核苷酸序列公開于授予Comai的美國(guó)專利4,769,061號(hào)。Kumada等的歐洲專利申請(qǐng)0333033號(hào)，和授予Goodman等的美國(guó)專利4,975,374號(hào)，公開了賦予針對(duì)除草劑如L-phosphinothricin的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列提供于Leemans等的歐洲申請(qǐng)0242246號(hào)，DeGreef等,Bio/Technology7:61(1989)描述了表達(dá)編碼PAT活性的嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生。賦予針對(duì)苯氧基丙酸和環(huán)異己酮類如稀禾定(sethoxydim)和氟吡禾靈(haloxyfop)抗性的基因的實(shí)例為如Marshall等,Theor.Appl.Genet.83:435(1992)所述的Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能夠賦予草甘膦抗性的GAT基因描述于Castle等的WO2005012515。賦予對(duì)2,4-D、fop和吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑抗性的基因描述于WO2005107437和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào)11/587,893，兩者均轉(zhuǎn)讓予DowAgroSciencesLLC。C.抑制光合作用的除草劑，如三嗪(psbA和gs+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等,PlantCell3:169(1991)描述了用編碼突變的psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣滴蟲(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列披露于Stalker的美國(guó)專利4,810,648號(hào)，并且含有這些基因的DNA分子可以以ATCC保藏號(hào)53435、67441、和67442獲得。編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)由Hayes等,Biochem.J.285:173(1992)描述。3.賦予或促成如下增值(value-added)性狀的基因，如：A.經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以提高植物的硬脂酸含量。參見Knultzon等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:2624(1992)。B.降低的肌醇六磷酸鹽含量—1)肌醇六磷酸酶編碼基因的導(dǎo)入會(huì)增強(qiáng)肌醇六磷酸鹽的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多游離的磷酸根。例如，參見VanHartingsveldt等,Gene127:87(1993)，關(guān)于黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開內(nèi)容。2)可以導(dǎo)入的降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。例如在玉米中，這可以如下實(shí)現(xiàn)，即克隆與單一等位基因有關(guān)的DNA，然后再次導(dǎo)入，所述單一等位基因負(fù)責(zé)特征為低水平肌醇六磷酸的玉米突變體。參見Raboy等,Maydica35:383(1990)。C.例如通過用編碼改變淀粉分支樣式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物來實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。參見Shiroza等,J.Bacteriol.170:810(1988)(鏈球菌(Streptococcus)突變體果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等,Mol.Gen.Genet.20:220(1985)(枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因的核苷酸序列)；Pen等,Bio/Technology10:292(1992)(表達(dá)地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifonnis)α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成)；Elliot等,PlantMolec.Biol.21:515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)；Sogaard等,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)；和Fisher等,PlantPhysiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。盡管本發(fā)明的多種實(shí)施方案公開于本文中，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識(shí)在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行許多適應(yīng)和修飾。此類修飾包括用本發(fā)明任何方面已知等同物替換以基本上相同的方式取得相同的結(jié)果。數(shù)值范圍包含定義范圍的數(shù)值。本發(fā)明包括基本上在上文中描述并參照實(shí)施例和附圖的所有實(shí)施方案和變化。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3