專利名稱：棉花類固醇5α-還原酶基因的用途及含有其的表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及棉花類固醇5a-還原酶基 因的用途，含有該基因的編碼蛋白質(zhì)及植物表達(dá)載體；本發(fā)明還涉及制備含上 述基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
植物特別是農(nóng)作物和林木的根系是它們從土壤中吸收水分和無(wú)機(jī)鹽養(yǎng)分 的主要器官，同時(shí)也是植物固著的主要器官，因此，植物根系發(fā)育對(duì)植物地上 部分的生長(zhǎng)和農(nóng)作物的產(chǎn)量起著至關(guān)重要的作用。各種植物的根形態(tài)有所不 同，但根的基本功能相同。根由主根、側(cè)根或不定根組成。主根是由種子根(胚 根)發(fā)育成的，與莖相連，向下生長(zhǎng)。從主根向四周生出的根稱為側(cè)根，側(cè)根 還可以再生出側(cè)根。從莖或葉上直接長(zhǎng)出的根，稱為不定根。 一株植物的所有 根總起來(lái)叫根系，根系可分為直根系(如雙子葉植物的根)和須根系(如單子 葉植物的根)兩大類。根吸收水分和無(wú)機(jī)鹽的主要部位是根毛，根毛是根尖表 皮細(xì)胞向外突出的毛狀物。數(shù)量很多，集生于根尖的根毛區(qū)。根毛的壽命很短， 約1周左右即行萎蔫脫落。隨著根尖的生長(zhǎng)，在新的部位又生出新的根毛。
植物根系的發(fā)育同樣也受植物激素的調(diào)控，研究歷史比較長(zhǎng)的植物激素如 生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、脫落酸等對(duì)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育的作用已經(jīng)有比較深入的 研究。油菜素類固醇物質(zhì)(Brassinosteroids， BRs)是一類新型的植物激素， 研究歷史較短。但由于其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，研究者在多個(gè) 方面進(jìn)行廣泛的研究。許多研究結(jié)果都證實(shí)外施BL (Brassinolide， 一種生物 活性最高的BRs)能夠促進(jìn)植物根系發(fā)育(Bmssinosteroids interact with auxin to promote lateral root development in arabidopsis. Plant Physiology, 2004, 134)。但 這些報(bào)道都是外源施用BL的結(jié)果，利用植物基因工程技術(shù)，獲得超量表達(dá)或 抑制BRs生物合成酶基因的轉(zhuǎn)基因材料，以此研究某種具體BRs與某個(gè)具體 的合成酶基因?qū)χ参锔瞪L(zhǎng)發(fā)育的影響還少有報(bào)道。DET2 (de-etiolated2，擬南芥類固醇5a-還原酶)是BRs生物合成途徑中 催化較早反應(yīng)的酶，催化菜油甾醇轉(zhuǎn)化成菜油甾烷醇(The Ambidopsis de-etiolated2 mutant is blocked early in brassinosteroid biosynthesis. Plant Cell, 1997,9)。后來(lái)詳細(xì)的研究表明DET2催化該轉(zhuǎn)化過(guò)程中(24R) -24-甲基-膽甾 基-4-烯-3-酮到(24R)-24-甲基-5a-膽甾烷-3-酮的5a還原反應(yīng)(Arabidopsis det2 is defective in the conversion of (24R)-24-methylcholest-4-en-3-one to (24R)-24-methyl-5alpha-cholestan-3-one in brassinosteroid biosynthesis. Plant Physiology, 1999， 120)。隨后研究結(jié)果表明，DET2催化的反應(yīng)是BRs生物合 成途徑中主要的限速步驟。超量表達(dá)Z)五n的轉(zhuǎn)基因擬南芥在光下生長(zhǎng)明顯比 野生型株型要大，生物生長(zhǎng)量比野生型增大100%-150%;而轉(zhuǎn)D五J2反義基 因的擬南芥植株得到了一系列表現(xiàn)型，株高從類似的極度矮化型到正常 株高的野生型(Brassinosteroid actions in plants. Journal of Experimental Botany, 1999,50)，說(shuō)明擬南芥類固醇5a-還原酶基因的表達(dá)水平與植物的生長(zhǎng)發(fā)育有 密切關(guān)系。
為了研究類固醇5cc-還原酶基因在棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，通過(guò)篩選 與擬南芥類固醇5a-還原酶(DET2)同源的棉花EST序列，并對(duì)候選EST序 列進(jìn)行拼接和克隆測(cè)序，獲得一段序列后，再進(jìn)行3'-^0￡得到棉花類固醇501-還原酶基因的全序列，最后從棉花纖維中克隆棉花類固醇5a-還原酶基因(下 稱GM)五T2基因)。利用體外還原系統(tǒng)證明了 GW)五77具有類固醇5a-還原酶 活性，進(jìn)而構(gòu)建超量表達(dá)和反義抑制G/lC^72基因的植物表達(dá)載體并進(jìn)行棉 花的遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果證明在棉花中抑制GW)5J2的表達(dá)使轉(zhuǎn)基因棉花的生長(zhǎng) 受到強(qiáng)烈的抑制，纖維細(xì)胞的起始數(shù)量減少，纖維的伸長(zhǎng)受到抑制，難以得到 成熟的種子和纖維；相反，在纖維中適當(dāng)提高GM)E"的表達(dá)，可以促進(jìn)纖 維的起始和伸長(zhǎng)，說(shuō)明G/lD五T2基因在棉花纖維生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用 (G7 D五27, a steroid 5a-reductase, plays an important role in cotton fiber cell initiation and elongation. Plant Journal, 2007， 51)。
到目前為止，擬南芥、番茄、豌豆、牽牛和棉花中的類固醇5a-還原酶基 因已被克隆和鑒定，但DET2對(duì)根系生長(zhǎng)的影響的報(bào)道還沒(méi)有見到。

發(fā)明內(nèi)容
4本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供棉花類固醇5ct-還原酶基因 (Gossypiumhirsutum steroid 5a-reductase)的用途，即在促進(jìn)植物根系發(fā)育中
的應(yīng)用。
本發(fā)明另一目的在于提供含有該G/^E72基因的植物表達(dá)載體。 本發(fā)明又一目的在于提供制備基于本發(fā)明植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物的 方法。
根據(jù)本發(fā)明的一方面，所述的編碼棉花類固醇5a-還原酶基因具 有如下核苷酸序列
1) 如SEQIDNO. l所示的核苷酸序列；或者
2) 與SEQIDNO. 1的核苷酸序列具有80%以上，優(yōu)選90%以上同源性， 且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸。
由上述G/lD￡77基因編碼的蛋白質(zhì)，具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸殘 基序列或?qū)EQ ID NO.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取 代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0.2的氨基酸殘基序列相同生物活性的由 該序列衍生的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供的植物表達(dá)載體至少包含編碼棉花類固醇 5a-還原酶GhDET2的核苷酸和啟動(dòng)子序列，所述植物表達(dá)載體通過(guò)將編碼棉 花類固醇5a-還原酶基因G/lD五"、啟動(dòng)子序列與表達(dá)載體可操作地連接而構(gòu) 建。為了篩選和表達(dá)的需要，還可選地在表達(dá)載體中包含篩選基因序列、報(bào)告 基因序列以及其他的為基因工程操作的需要而插入的各種內(nèi)切酶位點(diǎn)，篩選基 因和報(bào)告基因可以從本領(lǐng)域常用的基因序列中選擇，優(yōu)選地，本發(fā)明的植物表 達(dá)具有如圖l所示的結(jié)構(gòu)。
用于構(gòu)建本發(fā)明植物表達(dá)載體的啟動(dòng)子優(yōu)選為組成型啟動(dòng)子或組織特異 性啟動(dòng)子，例如，根特異型啟動(dòng)子，更優(yōu)選的是來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物 組成型啟動(dòng)子CaMV35S。通常，將G/lD五72基因構(gòu)建在CaMV35S的下游。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，首先構(gòu)建含有CaMV35S啟動(dòng)子序列的 表達(dá)載體pBI121-35S-NOS雙元質(zhì)粒載體，然后將G7^Z)^"基因正向插入植物 表達(dá)載體中，用CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)，構(gòu)建了含有GW)￡72基因的植物 表達(dá)載體pBI121-35S-GM^72-NOS，其具有如圖4所示的結(jié)構(gòu)，該表達(dá)載體 同時(shí)包含了報(bào)告基因GUS序列，篩選基因序列(卡拉霉素抗性)和用于基因操作的各內(nèi)切酶位點(diǎn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，上述報(bào)告基因、篩選基 因和各基因操作序列均是可替換的，本發(fā)明并不對(duì)此進(jìn)行限制。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種轉(zhuǎn)化體，利用電擊法或凍融法等方法處 理，將本發(fā)明的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主而獲得轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體可用于轉(zhuǎn)化植 物獲得轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的宿主為農(nóng)桿菌菌株。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，提供制備含有G/zZ)五72基因的轉(zhuǎn)基因植物的方 法。將本發(fā)明的G/lOKT2基因與啟動(dòng)子構(gòu)建植物表達(dá)載體，將所述植物表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化宿主獲得含G力"f72基因的轉(zhuǎn)化體，用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn) 基因植物。
本發(fā)明提供了 基因的新用途，成功地構(gòu)建了包含G/lD五"基因
和啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，并以該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植物，在轉(zhuǎn)基 因植物中G/lD￡77基因被超量表達(dá)。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草表型變異的分析，發(fā) 現(xiàn)超量表達(dá)基因能夠促進(jìn)主根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，側(cè)根的發(fā)生和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)， 以及不定根的生長(zhǎng)和根毛的生長(zhǎng)。因此G/lD五77基因?qū)φ麄€(gè)植物根系生長(zhǎng)具 有促進(jìn)作用；同時(shí)，該基因的超量表達(dá)也能增加轉(zhuǎn)基因煙草的生物生長(zhǎng)量和果 實(shí)種子產(chǎn)量，這對(duì)于培養(yǎng)優(yōu)良的作物品種具有重要的理論和實(shí)際意義。


圖l:含(^/)￡"基因的植物表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖，其中
35S，代表CaMV35S啟動(dòng)子；G/lD五72:代表G/lD￡72基因cDNA ; term, 代表終止子；LB，代表T-DNA左邊界；RB，代表T-DNA右邊界。
圖2: pBI121-35S-NOS雙元質(zhì)粒載體的構(gòu)建流程圖，其中
NPTII，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；GUS， p-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S， 來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成型啟動(dòng)子；Nosterm， Nos終止子；LB， T-DNA左邊界；RB， T-DNA右邊界。
圖3:組成型啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控下的棉花類固醇5a-還原酶基因 (^"￡72表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖
Amp，氨芐青霉素抗性基因；NPTII，新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；GUS， (3-葡萄糖酸苷酶基因；CaMV35S，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的植物組成性啟動(dòng)子； Nosterm， Nos終止子；LB， T-DNA左邊界；RB， T-DNA右邊界。用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的骨架載體為pBI121基礎(chǔ)上改造的pBI121-35S-NOS載體，具有 CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控下的GUS基因，便于在植物遺傳轉(zhuǎn)化的過(guò)程中對(duì)轉(zhuǎn)化 子進(jìn)行GUS染色的篩選。
圖4:本發(fā)明優(yōu)選的植物表達(dá)載體P6-G/LDE72結(jié)構(gòu)圖5: GM)￡72基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的RT-PCR分析
以野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片為材料，提取總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn) 錄合成單鏈cDNA，然后用GAZ^T2的特異引物D6P1和D6P2 (SEQ ID NO.3 和SEQIDN0.4)進(jìn)行擴(kuò)增(圖5上)。為確定各樣品單鏈cDNA合成的質(zhì)量 和濃度，以煙草的Ubiquitin特異引物Ubi-up和Ubi-down (SEQ ID N0.9和 SEQIDNO.10)進(jìn)行擴(kuò)增(圖5中)。為排除轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的污染， 直接以總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增(圖5下)。WT，野生型煙草；f/S/， Ubiquitin; 1、 2、 3、 4分別為轉(zhuǎn)基因煙草的2#、 13#、 18#和19#植株。
圖6:轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的主根生長(zhǎng)
A，野生型煙草種子播種后4天的主根生長(zhǎng)情況。B，轉(zhuǎn)基因煙草(TOD2) 種子播種后4天的主根生長(zhǎng)情況。C，野生型煙草種子播種后6天的主根生長(zhǎng) 情況。D，轉(zhuǎn)基因煙草(TOD2)種子播種后6天的主根生長(zhǎng)情況。E，轉(zhuǎn)基因 煙草(TOD2)和野生型煙草在沙中生長(zhǎng)30天的主根長(zhǎng)度。F，轉(zhuǎn)基因煙草種 子和野生型煙草種子播種后6天時(shí)的主根長(zhǎng)度。WT，野生型煙草；TOD2 TOD19,超量表達(dá)^力1^72基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系2#至19#。 G，轉(zhuǎn)基因煙草 (TOD2)與野生型煙草主根的生長(zhǎng)速度。WT，野生型煙草；TOD2，超量表 達(dá)G/lD￡72基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系2弁。
圖7:轉(zhuǎn)基因煙草的側(cè)根發(fā)育
A，播種后10天的野生型煙草根系，標(biāo)尺長(zhǎng)lcm。
B，播種后IO天的轉(zhuǎn)基因煙草根系，標(biāo)尺長(zhǎng)lcm。
圖中箭頭表示主根上側(cè)根的發(fā)生部位。
圖8:轉(zhuǎn)基因煙草的根毛發(fā)育
A，萌發(fā)的野生型煙草種子(浸種60小時(shí))；B，萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因(TOD2) 煙草種子(浸種60小時(shí))；C，野生型煙草的根毛(播種后10天)；D F，不 同轉(zhuǎn)基因煙草株系的根毛(播種后10天)。
圖9:轉(zhuǎn)基因煙草不定根的生長(zhǎng)取轉(zhuǎn)基因煙草T,代無(wú)菌苗和野生型煙草無(wú)菌苗的莖段，在MS培養(yǎng)基中 進(jìn)行生根，生長(zhǎng)20天后統(tǒng)計(jì)不定根的數(shù)量和長(zhǎng)度。A和B，轉(zhuǎn)基因煙草(TOD2) 和野生型煙草莖段上不定根的生長(zhǎng)情況；C，不定根的平均長(zhǎng)度；D，每個(gè)莖 段上不定根的平均數(shù)量
圖10:轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的株高和葉片比較
A，本明煙草植株進(jìn)入成熟期后，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的植株形態(tài)和 株高。TOD,超量表達(dá)G/lD五"基因的轉(zhuǎn)基因煙草；WT，野生型煙草。B， 轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的同位成熟葉片。TOD，超量表達(dá)( M)五72基因的 轉(zhuǎn)基因煙草的葉片；WT，野生型煙草的葉片。
圖ll:轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的花、果實(shí)和種子 A，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草花和果實(shí)發(fā)育過(guò)程的外觀形態(tài)。WT，野生型煙 草；TOD:超量表達(dá)WZ^r2的轉(zhuǎn)基因煙草。B，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的 果實(shí)發(fā)育(剝離了花器官的其余部分)。WT，野生型煙草；TOD，超量表達(dá) G/lD￡72的轉(zhuǎn)基因煙草。C，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的種子大小，標(biāo)尺長(zhǎng)lcm。 WT，野生型煙草；TOD，超量表達(dá)G力Z^72的轉(zhuǎn)基因煙草。D，轉(zhuǎn)基因本明 煙草和野生型本明煙草種子的千粒重。WT，野生型本明煙草種子；TOD1 TOD19，超量表達(dá)G/ld五r2基因的轉(zhuǎn)基因株系1 19。 E，相對(duì)于野生型本明 煙草種子的重量，轉(zhuǎn)基因本明煙草種子重量的增加比率。WT，野生型本明煙 草種子；TODl TOD19，超量表達(dá)G/ld五"基因的轉(zhuǎn)基因株系1 19，種子 重量單位為克。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但以下說(shuō)明并不對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行限定，任何對(duì)本發(fā)明的變形和改變，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬 于本發(fā)明所附權(quán)利要求所定義的范圍。
本發(fā)明實(shí)例中的試劑藥品未做具體說(shuō)明的均為普通市售，材料方法未做 具體說(shuō)明的均參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Sambrook和Russell, 2001)。
在本發(fā)明的下述實(shí)例中，所用的棉花實(shí)驗(yàn)材料為徐州142 (Gossypium hirsutum cv Xuzhoul42 )，所用的煙草實(shí)驗(yàn)材料為本明煙(Nicotiana benthamiana)實(shí)施例一G/^五72基因序列的克隆
1. 棉花RNA的提取
選取約3 g新鮮棉花材料，在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末，裝入50 mL離心 管，加入15mL65。C預(yù)熱的RNA提取液(2。/。CTAB (W/V)， 2% PVP (W/V)， 100醒ol/LTris-HCl (pH8.0)， 0.5g/L Spermidine, 2，0mol/L NaCl， 2%巰基乙 醇(V/V，使用前加入))，顛倒混勻。65'C水浴3 10min，期間混勻2~3次。 氯仿:異戊醇(24:1)抽提2次(10,000 r/min，室溫，5 min)。取上清，加入 1/4體積10mol/LLiCl溶液，《C放置6h，以氯仿:異戊醇(25:24:1)各抽提1 次(10,000 r/min，室溫，5 min)。加2倍體積的無(wú)水乙醇，在-70。C冰箱沉淀 30min以上。12,000 r/min， 4。C離心20min，棄上清。沉淀用200 |uL的DEPC 處理水溶解。酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)、氯仿:異戊醇(24:1)各抽 提1次(10,000 r/min，室溫，5 min)。力B 1/10體積3 mol/L NaAc溶液和2.5 倍體積的無(wú)水乙醇，在-7(TC冰箱沉淀30min以上。12,000 r/min， 4"C離心20 min，棄上清。沉淀用70%的酒精漂洗一次，風(fēng)干。加200 的DEPC處理 水溶解。用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量。
2. cDNA合成和G/lD￡77基因cDNA序列的PCR擴(kuò)增
根據(jù)EST整合序列分析，在推測(cè)的起始密碼子上游序列設(shè)計(jì)引物D6P1 (SEQIDN0.3)，用3'-RACE的方法擴(kuò)增棉花類固醇5a-還原酶基因的cDNA 序列。操作步驟按3'-RACE試劑盒(TaKaRa)說(shuō)明書進(jìn)行。具體方法如下
(1) cDNA—鏈合成
取約lO(ig總RNA到DEPC-處理的擴(kuò)增管中，65。C水浴10min使RNA變 性后，立即冰浴3min。然后向擴(kuò)增管中依次加入2pL 10xRNAreaction buffer, 4 25醒ol/L MgC12， 2|iL 10匪ol/L dNTPs， 5 U AMV RTase， 0.5 |tiL RNase inhibitor (20U)禾卩l(xiāng)^L 2.5|Limol/L Oligo-dT 3' site adaptor,加入DEPC處理的水 至終體積20pL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的保溫程序?yàn)?0°C， lOmin; 50°C， 45min; 95°C， 5min; 5°C， 5min。程序結(jié)束后， 一鏈產(chǎn)物于-20'C凍存。
(2) 擴(kuò)增
25 |iL的cDNA擴(kuò)增體系含2.5 lOxEx PCR buffer (Mg2+ free), 2|uL 2.5 mmol/LdNTPs, 2jil 25mmol/L MgCl2， lpL特異引物D6P1 (5jdmol/L)， lpL 3'-site引物(5pmol/L)， 0.2jiL Ex Taq DNA聚合酶，l|uL cDNA—鏈產(chǎn)物。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C， 5min; 94。C， 30sec， 56。C， 30sec， 72°C， lmin， 30個(gè)循 環(huán)；72。C延伸10min。
3.cDNA片段回收，連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。
(1) 電泳
將cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離。
(2) 回收
使用回收試劑盒回收步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，回收片段在瓊脂糖凝 膠上電泳定量。
(3) 克隆和測(cè)序
回收的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳定量。按試劑盒說(shuō)明書，通過(guò)回收片段與克 隆載體的連接、連接產(chǎn)物的大腸桿菌轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性菌落的培養(yǎng)和質(zhì)粒酶切驗(yàn)證， 將回收片段克隆到pUCm-T (上海Sangon)載體上。序列測(cè)定由上海博亞公 司完成。
回收的片段與pUCm-T (上海生工)載體建立如下連接體系 10xT4 DNA連接緩沖液 1 pL
載體DNA片段 1 外源連接產(chǎn)物DNA片段 1
T4 DNA連接酶_1 nL
用雙蒸水補(bǔ)足體積至10 pL的連接體系
載體DNA片段與外源連接產(chǎn)物DNA片段摩爾比為1:3， 16'C連接12h。 之后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。實(shí)施例二pBI121-35S-NOS雙元質(zhì)粒載體的構(gòu)建
pBI121雙元質(zhì)粒是一種商品化的植物表達(dá)載體，本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買保存。在 T-DNA區(qū)域的左右邊界內(nèi)有一套Nos啟動(dòng)子控制NPTII基因的植物表達(dá)元件 和一套CaMV 35S啟動(dòng)子控制GUS基因的植物表達(dá)元件。為了表達(dá)目標(biāo)基因， 我們?cè)谠撡|(zhì)粒載體中添加了一套由CaMV 35S啟動(dòng)子控制目標(biāo)基因的植物表 達(dá)元件。該植物表達(dá)載體可實(shí)現(xiàn)Kan (卡拉霉素抗性)和GUS活性的雙標(biāo)記 篩選。在多克隆位點(diǎn)(Multiple cloning site， MCS)插入外源基因，可以實(shí)現(xiàn) 外源基因的超量表達(dá)(圖2)。
首先，為了獲得CaMV 35S啟動(dòng)子片段，依據(jù)pBI121雙元質(zhì)粒上的CaMV35S啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)帶有5amHI和Smal酶切位點(diǎn)的引物p6-l和p6-2 (p6-l 的序列見SEQ ID N0.5， p6-2的序列見SEQ ID N0.6)，以pBI121雙元質(zhì)粒 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，用^wzHI和Swal雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒，通 過(guò)回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證獲得插入CaMV35S啟動(dòng)子片段的中間載體。然后 根據(jù)pBI121雙元質(zhì)粒上Nos終止子的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物獲得Nos終止子片段 (引物p6-3序列見SEQIDN0.7，引物p6-4序列見SEQ ID N0.8)，該片段的 一端帶有XbaI、 BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)，另一端帶有BglII酶切位點(diǎn)。通過(guò) 回收、連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證獲得了含有CaMV35S啟動(dòng)子的pBI121-35S-NOS植 物表達(dá)載體的骨架(圖2)。
實(shí)施例三超量表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草遺傳轉(zhuǎn)化
1. 超量表達(dá)載體的構(gòu)建
pUC-G力Z^T2載體是在克隆G/lD￡77基因時(shí)構(gòu)建，其上的G/ Z)五T7片段 已測(cè)序。pBluescript-SK為商業(yè)化載體，由本實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買保存，本實(shí)驗(yàn)中用于 目的片段轉(zhuǎn)換方向或借用新的酶切位點(diǎn)。植物表達(dá)載體的骨架 pBI121-35S-NOS按照實(shí)施例二方法為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。
為了在轉(zhuǎn)基因植物中超量表達(dá)基因，需要將G/^￡72基因正向 插入植物表達(dá)載體中，并用適當(dāng)?shù)膯?dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。為此我們根據(jù) pUC-GAZ)￡72載體上的酶切位點(diǎn)和G/^￡72的插入方向以及植物表達(dá)載體 (pBI121-35S-NOS)上的多克隆位點(diǎn)和CaMV 35S啟動(dòng)子的方向，設(shè)計(jì)了如 圖3所示的載體構(gòu)建路線。根據(jù)這個(gè)植物表達(dá)載體構(gòu)建路線，構(gòu)建了超量表達(dá) (^D五T2基因的植物表達(dá)載體pBI121-35S-G/lD五:T2-NOS，載體結(jié)構(gòu)如圖4。
2. 煙草遺傳轉(zhuǎn)化
(1 )用電激法將構(gòu)建的植物表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404和煙草遺 傳轉(zhuǎn)化。
參考Bio-RAD MicroPulser用戶說(shuō)明書，將上述載體通過(guò)電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入 農(nóng)桿菌LBA4404。
上述的植物表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤感染的方法導(dǎo)入煙草。具體方法 如下
煙草種子用1%的次氯酸鈉消毒后，在MSB固體培養(yǎng)基上萌發(fā)，培養(yǎng)條 件為25°C、 16hr光照/8hr黑暗的光周期。約一個(gè)月后生長(zhǎng)健壯的無(wú)菌苗即可用作轉(zhuǎn)化外植體。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法含植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株接種于液體
YEB， 28°C 200rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜，從己搖好的菌液中重新吸取l~2ml于 20 25ml液體YEB中再次活化。待菌液搖至OD600約為0.8時(shí)，取出用YEB 稀釋到0.05 0.2備用。
將無(wú)菌苗健壯葉片，切成約0.5cmx0.5cm大小葉盤，放入OD600值為 0.05~0.2的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕振蕩侵染5min后，立刻傾去菌液，將外植體 接入表面鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上，24。C暗培養(yǎng)3d。
共培養(yǎng)完成后，外植體接入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，每2 3w繼代一 次。出現(xiàn)再生綠芽后，將其切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。
當(dāng)抗性苗的根生長(zhǎng)到2 3cm長(zhǎng)時(shí)，洗凈根部的瓊脂，水培煉苗2 3d，移 栽到營(yíng)養(yǎng)缽，于自然條件下生長(zhǎng)。
表l:根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化用培養(yǎng)基
培養(yǎng)基名稱成分
基本培養(yǎng)基MSB (MS無(wú)機(jī)+Bs有機(jī)+7g /L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH5.8)
預(yù)培養(yǎng)基MSB+2.0 mg/L2,4-D
共培養(yǎng)培養(yǎng)基MSB+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA
篩選培養(yǎng)基MSB+2,0 mg/L 6-BA+0,1 mg/L NAA +500 mg/L Cef+ 100 mg/L Kan
生根培養(yǎng)基MSB+300 mg/L Cef+150 mg/L Kan
MS: Murashige&Skoog， 1%2
B5: Gamborg， 1986
(2)轉(zhuǎn)化植株的鑒定
組織化學(xué)鑒定轉(zhuǎn)化植株在生根培養(yǎng)基上生根并長(zhǎng)到2 3cm時(shí)，將幼苗 從培養(yǎng)瓶中取出洗凈，轉(zhuǎn)入三角瓶上水培煉苗2~3d。同時(shí)，取一小塊葉片和 一小段根進(jìn)行GUS染色。GUS陽(yáng)性的植株直接移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。
PCR鑒定待煙草植株移栽成活并生長(zhǎng)到一定大小，取0.5g葉片提取煙 草基因組DNA，以GhDET2的引物D6P1和D6P2 (SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4)進(jìn)行擴(kuò)增。25 |iL的擴(kuò)增體系含2.5 |uL 10x PCR buffer, 2 |iL2.5mmol/L dNTPs， 1.5 nL 25薩ol/L MgC12，各1 jiL弓l物D6P1和D6P2 (5 pmol/L)， 1U Taq DNA聚合酶，1 (iL煙草基因組DNA(50ng)。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C， 5 min; 94°C，30 sec， 56°C， 30 see, 72°C， 60 sec， 25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。用P6-GhDET2 載體質(zhì)粒作陽(yáng)性對(duì)照，以水和野生型煙草基因組DNA作陰性對(duì)照。實(shí)施例四檢測(cè)GhDET2基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平
用半定量RT-PCR方法分析轉(zhuǎn)基因植株中目的基因的表達(dá)。GM)五n基因 用引物D6P1和D6P2 (SEQIDN0.3和SEQIDN0.4)擴(kuò)增，25 |uL的擴(kuò)增體 系含2.5 pL 10x PCR buffer, 2 (iL 2.5腿ol/L dNTPs， 1.5 [iL 25腿ol/L MgC12， 各1 fiL引物D6P1和D6P2 (5 pmol/L)， 1U Taq DNA聚合酶，1 |uL cDNA —鏈 合成產(chǎn)物。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C， 5 min; 94。C， 30sec， 56°C， 30sec， 72°C， 60 sec， 20~25個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。用Ubiquitin基因做內(nèi)標(biāo)，引物為 Ubi-up禾卩Ubi-down 。
為了確定基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況，我們提取轉(zhuǎn)基因煙 草和野生型煙草葉片的總RNA。以這些總RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，煙草Ubiquitin特異引物Ubi-up和Ubi-down的擴(kuò)增產(chǎn)物顯示各 樣品的總RNA量以及單鏈cDNA合成的質(zhì)量和濃度相似。G/lC^T2的特異引 物D6P1和D6P2在轉(zhuǎn)基因煙草中擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小一致的特異帶，而野 生型煙草中沒(méi)有任何擴(kuò)增產(chǎn)物。為了排除總RNA中可能有基因組DNA的污 染，同時(shí)以總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物中沒(méi)有任何特異帶(圖5)，說(shuō) 明G/lD五"基因已在檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)，不同植株之間在表達(dá)量上有 一定差異。
實(shí)施例五轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草根系生長(zhǎng)發(fā)育的比較 1.轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草T1代幼苗主根生長(zhǎng)的比較 為研究基因?qū)Ω蛋l(fā)育的影響，轉(zhuǎn)基因煙草TO代種子經(jīng)滅菌后 播種在垂直平板上，定時(shí)主根長(zhǎng)度。具體的操作如下
(1) 煙草種子滅菌與漂洗 將轉(zhuǎn)基因煙草To代種子和野生型煙草的種子在iy。的次氯酸鈉水溶液中浸
泡8分鐘，其間不停地?fù)u晃以使種子表面與消毒液充分接觸。然后倒掉消毒液， 加入適量的無(wú)菌水清洗4次，每次3-5分鐘。
(2) 準(zhǔn)備平板
配制瓊脂濃度為0.8%的1/2MSB培養(yǎng)基，高溫滅菌后在無(wú)菌條件下分裝 在直徑為12cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿盛50ml培養(yǎng)基。冷卻凝固待用。(3) 播種和培養(yǎng)
在每個(gè)培養(yǎng)皿的背面中部用筆劃一條直線，以使煙草種子排列整齊，最后
用封口膜(Parafilm)將培養(yǎng)皿封住以免培養(yǎng)基中的水分散失。播種后的培養(yǎng) 皿垂直放在固定的支架中，并使所劃直線保持水平。所有培養(yǎng)皿都放在培養(yǎng)室 培養(yǎng)(28°C，光照條件)。
(4) 生長(zhǎng)狀態(tài)觀測(cè)
播種后，每天觀測(cè)種子萌發(fā)、根和下胚軸的生長(zhǎng)。大約播種6天后，煙草 幼苗的根和下胚軸已經(jīng)生長(zhǎng)到一定長(zhǎng)度，用直尺第一次測(cè)量根和下胚軸的長(zhǎng) 度。同時(shí)在根尖和子葉著生部位的相應(yīng)位置用記號(hào)筆做上記號(hào)，然后每隔24 小時(shí)測(cè)量根和下胚軸的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度。最后統(tǒng)計(jì)分析轉(zhuǎn)GAD五72基因的煙草和野 生型煙草幼苗在相同條件下，主根和下胚軸的長(zhǎng)度差異和生長(zhǎng)速率差異。實(shí)施例六轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)和沙培實(shí)驗(yàn)
用垂直平板法萌發(fā)煙草種子雖然有利于直接觀測(cè)根的生長(zhǎng)過(guò)程，但由于垂 直平板空間和培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)的限制以及微生物污染的因素，無(wú)法對(duì)根的伸長(zhǎng)情況 進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的比較。為了在更長(zhǎng)的時(shí)間檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草根的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，本實(shí)驗(yàn) 采用了沙培法。并在種子催芽階段觀測(cè)了轉(zhuǎn)基因煙草種子的萌發(fā)情況。具體操 作步驟如下
(1) 種子催芽和萌發(fā)率檢測(cè) 將適量的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草種子用水浸泡催芽，轉(zhuǎn)基因煙草種子浸
泡在含100 mg/L kanamycin的水中，野生型煙草的種子浸泡在不含kanamycin 的水中，在植物組培室搖床上以100rpm的速度搖晃2d。在這過(guò)程中，用大口 吸管隨機(jī)抽取一定數(shù)量的種子，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。
(2) 準(zhǔn)備沙培基質(zhì)
用自來(lái)水清洗干凈沙中的泥漿，然后在底部有孔的培養(yǎng)缽中裝入相同高度 的河沙， 一次試驗(yàn)的所有培養(yǎng)缽放在一個(gè)能盛水的淺盤中。并加水讓缽中的河 沙濕透。
(3) 播種和培養(yǎng)
將露白的煙草種子播在每一缽的河沙表面。在溫室中培養(yǎng)，其間每隔5天 加水一次，水不能直接澆在培養(yǎng)缽中的河沙上，只能加在底盤中。
(4) 取根和測(cè)量煙草幼苗培養(yǎng)30d后，將培養(yǎng)缽放在大體積水中，輕搖缽體，讓河沙軟化
松散，然后將煙草幼苗完整取出。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和野生型煙草選取有代表性
的10株幼苗測(cè)量其根長(zhǎng)和下胚軸長(zhǎng)度(圖6-圖8)。實(shí)施例七Tl代轉(zhuǎn)基因煙草不定根生長(zhǎng)變異分析
為了檢測(cè)轉(zhuǎn)化基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草不定根生長(zhǎng)的影響，用消毒后的TO代種 子在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗莖段進(jìn)行生根實(shí)驗(yàn)，觀測(cè)不定根的 生長(zhǎng)變異情況。具體的操作如下
(1) 轉(zhuǎn)基因煙草種子滅菌和清洗
將^G/lD五"基因的煙草TO代種子和野生型煙草的種子在1% (V/V)的 次氯酸鈉水溶液中浸泡8min，其間不停地?fù)u晃以使種子表面與消毒液充分接 觸。然后倒掉消毒液，加入適量的無(wú)菌水清洗4次，每次3 5min。
(2) 播種
將滅菌的轉(zhuǎn)基因煙草種子均勻地放在含50mg/L kanamycin的1/2 MSB培 養(yǎng)基上，野生型煙草的種子播在不含kanamydn的1/2MSB培養(yǎng)基上。然后放 置在培養(yǎng)室中，使種子發(fā)芽。
(3) 切取煙草幼苗莖段生根 切取生長(zhǎng)30d天的無(wú)菌煙草幼苗莖段，插在1/2MS培養(yǎng)基上，觀察不定
根的發(fā)生和生長(zhǎng)情況。待野生型煙草莖段的不定根生長(zhǎng)到一定程度時(shí)，將苗取 出，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因煙草莖段和野生型煙草莖段上不定根的數(shù)量，并測(cè)量長(zhǎng)度大于 5mm的不定根長(zhǎng)度(圖9)。
實(shí)施例八轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草株高和葉片的比較
超量表達(dá)G/lD五"基因的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草同時(shí)種植在培養(yǎng)缽中， 經(jīng)過(guò)正常的栽培管理，植株進(jìn)入成熟期后，觀測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草的生 長(zhǎng)狀況(圖10)。
實(shí)施例九轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草果實(shí)和種子發(fā)育的比較
超量表達(dá)(^2)￡77基因能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。為了弄清 G7^五T2對(duì)煙草生殖器官發(fā)育的影響，我們觀測(cè)了超量表達(dá)基因的轉(zhuǎn) 基因煙草的花器官形態(tài)、果實(shí)和種子大小(圖ll)。
15SEQUENCE LISTING
<110> 西南大學(xué)
〈120〉棉花類固醇5 a -還原酶基因的用途及含有其的表達(dá)載體
<130> 09P103582
<160〉 10
<170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 899
<212> 隱
<213> Gossypium hirsutum
<220>
<221> misc—feature
<222> 0) —(899)
<223>棉誌^固醇5ci-還原酶基因的核苷酸序列
〈400〉 1
tccgatcagaccctttttcactactgcctcctcactctttacat朋ttgc60
tttaccMcatggatcagcctttacttcctccaagccccttatggcaagcgicaaccgccc120
tggttggggtcctaccatctctccacctttggcttggttcctcatggaaagtcccaccct180
ctggctcactttcttcctctttccctccggccaacatttctacaaccctaaatcattcct240
tctcatctcgccctttctctttcactacttcaaccgcactgtcctttaccctcttcggct300
cgccaggaac3cc3cccaaaccaggggttttccagtgagtgtagcttttatggcgttcgg360
gtttaatcttttgaacggttatttgcaagccaggtgggtgtcgcactataaggsctacta420
tgaaaatgaggagctgttttggtggaggtttcttgctggattgctaatttUgtagttgg480tatgtgggtg犯tgttsgggctgataaagtgttggtgggactgaagaaacaaggtgatgg540
tggatataagatcccaagaggagggctgUtgsgttggtgagttgccccaactattttgg600
ggagattatggagtggtttgggtgggcggtgatg織tggtcttgggtgggttttggctt660
ctttctctacacttgtgccaacttgatgcctagagctcgtgccacccgcctttggtattt720
ggagaagttcaaggacgattgtgatcccattcatatattg780
3dg3tttgatatttgtgtttascccacat3tgattgattcggtgatcaagttgtatcttt840
ttaatggtttaaatcagatttcttttctgt899
<210〉 2
<211〉 258
<212> PRT
<213〉 人工序列
<220〉
〈221〉 MISC_FEATURE <222> (1).. (258)
<223>棉花類固醇5a-還原酶基因GhDET2編碼的蛋白質(zhì)序列 <400> 2
Met Ala Ser Asp Gin Thr Leu Phe His Tyr Cys Leu Leu Thr Leu Tyr 15 10 15
lie lie Ala Leu Pro Thr Trp lie Ser Leu Tyr Phe Leu Gin Ala Pro 20 25 30Tyr Gly Lys His Asn Arg Pro Gly Trp Gly Pro Thr lie Ser Pro Pro
35 40
45
Leu Ala Trp Phe Leu Met Glu Ser Pro Thr Leu Trp Leu Thr Phe Phe
50 55
60
Leu Phe Pro Ser Gly Gin His Phe Tyr Asn Pro Lys Ser Phe Leu Leu
65 70
75
80
lie Ser Pro Phe Leu Phe His Tyr Phe Asn Arg Thr Val Leu Tyr Pro 85 90 95
Leu Arg Leu Ala Arg Asn Thr Thr Gin Thr Arg Gly Phe Pro Val Ser 100 105 110
Val Ala Phe Met Ala Phe Gly Phe Asn Leu Leu Asn Gly Tyr Leu Gin
115 120
125
Ala Arg Trp Val Ser His Tyr Lys Asp Tyr Tyr Glu Asn Glu Glu Leu
130 135
140
Phe Trp Trp Arg Phe Leu Ala Gly Leu Leu lie Phe Val Val Gly Met
145 150
155
L60
Trp Val Asn Val Arg Ala Asp Lys Val Leu Val Gly Leu Lys Lys Gin 165 170 175
Glv Asp Gly Gly Tyr Lys lie Pro Arg Gly Gly Leu Phe Glu Leu Val 180 185 190
Ser Cys Pro Asn Tyr Phe Gly Glu lie Met Glu Trp Phe Gly Trp Ala
195 200
205
Val Met Thr Trp Ser Trp Val Gly Phe Gly Phe Phe Leu Tyr Thr Cys
210 215
220
Ala Asn Leu Met Pro Arg Ala Arg Ala Thr Arg Leu Trp Tyi' Leu Glu
225 230
235
240
Lys Phe Lys Asp Asp Tyr Pro Lys Asp Arg Lys Ala Val lie Pro Phe ' 245 250 ' 255
lie Tyr
<210〉 3
<211> 21
<212> ■ 〈213〉人工序列
<220〉
〈221> misc—feature <222〉 (1)..(21)
<223〉擴(kuò)增GhDET2基因的特異引物D6Pl <400> 3
gaaaatggcc tccgatcaga c
21<210〉 4
<211> 20
<212> DNA
〈213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature <222> (l)..咖
〈223>擴(kuò)增GhDET2基因的特異引物D6P2 <400〉 4
caccgaatca atcatattgg 20
<210> 5
<211> 27
<212〉 DNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> misc—feature <222> (1)..(27)
〈223〉擴(kuò)增CaMV 35S啟動(dòng)子的特異引物p6-l (帶有BamHI酶切位點(diǎn)) <400> 5
ggatccgatt acgccaagct tgcatgc 27
〈210〉 6
<211〉 27
<212〉 DNA
〈213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc.—feature <222〉 (1).. (27)
〈223〉擴(kuò)增CaMV 35S啟動(dòng)子的特異引物p6-2 (帶有SmaI酶切位點(diǎn)) <400〉 6
cccgggtcaa actctagagt cccccgt 27
<210〉 <211〉 〈212〉 <213>
<220> <221> 〈222〉 <223〉
<400〉
39 陽(yáng)
人工序列
misc—feature (l).r(39)
擴(kuò)增Nos終止子的特異引物p6-3 (帶有XbaI、 BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)) 7
tctagaggat ccggtaccga cgagttcttc tgagatcgt 39
〈210〉 8
<211> 27
<212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<221〉 misc_feature <222〉 (1)..(27)
〈223〉擴(kuò)增Nos終止子的特異引物p6-3 (帶有BglII酶切位點(diǎn)) <400> 8
agatctcccg atctagtaac atagatg 27<formula>formula see original document page 19</formula>
權(quán)利要求
1、棉花類固醇5α-還原酶基因GhDET2在促進(jìn)植物根系發(fā)育中的應(yīng)用，其中所述棉花類固醇5α-還原酶基因GhDET2具有下述核苷酸序列1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或2)與SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
2、權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述棉花類固醇5a-還原酶基因G/lD￡72 具有與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
3、棉花類固醇5(x-還原酶基因G/LD五72在農(nóng)作物育種或林木育種中的應(yīng)用， 其中所述棉花類固醇5a-還原酶基因G/lD￡72具有下述核苷酸序列1) 如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；或2) 與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有80%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
4、權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述棉花類固醇5a-還原酶基因G/lD五" 具有與SEQ ID NO. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的核苷酸序列。
5、 含有棉花類固醇5a-還原酶基因G/LD5"和組成型或組織特異性啟動(dòng)子 的植物表達(dá)載體。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其具有如圖l所示的結(jié)構(gòu)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體，其具有如圖4所示的結(jié)構(gòu)。
8、 一種轉(zhuǎn)化體，以權(quán)利要求5所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主獲得。
9、 一種含有棉花類固醇5a-還原酶基因G/lD五72的轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包含下述步驟1) 將基因GAZ^"與組成型或組織特異性啟動(dòng)子可操作地連接；2) 構(gòu)建含有基因與組成型啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子的植物 表達(dá)載體；3) 用所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，獲得轉(zhuǎn)化體；4) 用所述轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及棉花類固醇5α-還原酶基因GhDET2在促進(jìn)植物根系發(fā)育中的用途。通過(guò)在植物中的表達(dá)GhDET2基因，促進(jìn)了轉(zhuǎn)基因植物胚根的伸長(zhǎng)，側(cè)根的發(fā)生和伸長(zhǎng)，以及根毛的生長(zhǎng)；促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物莖段不定根的生長(zhǎng)；同時(shí)也促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高了轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)量和種子大小?？捎糜谵r(nóng)作物育種和林木育種，增加轉(zhuǎn)基因植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，提高植物的生物產(chǎn)量和種子產(chǎn)量。本發(fā)明還提供包含基因GhDET2的植物表達(dá)載體以及制備含有該基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101503703SQ20091010583
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者磊 侯, 明 羅, 肖月華, 胡明瑜, 炎 裴 申請(qǐng)人:西南大學(xué)