專利名稱：：一種老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)組織進行快速繁殖的方法，具體為老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法。
背景技術：
：扦錘樹，英文名Weighttree,學名SinojackiaxylocarpaHu,隸屬安息香科秤錘樹屬，為我國北亞熱帶東部特有樹種。秤錘樹枝葉濃密，色澤蒼翠,初夏盛開白色小花，潔白可愛，秋季落葉后宿存的懸掛果實，宛如秤錘一樣，具有較高的觀賞價值。由于秤錘樹種子自然狀態(tài)繁殖極其困難，已被列為國家二級保護瀕危樹種。國內外學者對該樹種開展了一系列的研究工作，如花粉的形態(tài)研究、花粉的超低溫儲藏、植物地理分布、葉片脈序比較、生物學特性與種子繁殖、種子休眠與萌發(fā)，扦插、嫁接、組培快繁，以及分子手段探討其系統(tǒng)學位置等積累了不少資料。在現(xiàn)有繁殖技術中，組織培養(yǎng)的方法已有報道，但報道中研究對象為3-5年生的幼齡秤錘樹，采用原有方法對南京中山陵風景區(qū)明孝陵60年生的老齡大樹開展組織培養(yǎng)研究未能成功。原因是利用原有方法培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)外植體啟動培養(yǎng)困難、增殖系數(shù)低、不生根等問題，說明原方法進行老齡秤錘樹組織培養(yǎng)的主要技術環(huán)節(jié)有明顯缺陷。
發(fā)明內容為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種適合老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，提高培養(yǎng)的成活率。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，按下列步驟進行(1):外植體的接種采用經(jīng)選育的老齡秤錘樹腋芽莖段為外植體，經(jīng)70%酒精消毒50秒，再用0.1°/的升汞溶液(添加Tween-201-2滴/100毫升)消毒10-U分鐘，用無菌水沖洗3-5次，作為外植體進行培養(yǎng)；4(2):芽苗培養(yǎng)在超凈的工作臺上，無菌條件下，將外植體接種在經(jīng)消毒的含有啟動培養(yǎng)基的三角瓶中，先將其置于黑暗條件下10-15天后，再置于普通日光燈為光源、光照強度為1500-20001x下，每日照光15小時,溫度20-25。C、濕度為50°"0%，培養(yǎng)45天，分化長成試管芽苗，所述的啟動培養(yǎng)基由以下重量含量的原料組成每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)1,0-2.0毫克；6-節(jié)基嘌呤(BA)0.5-2.G毫克；oc-萘乙酸(NAA)0.01-0.2亳克；(3):增殖培養(yǎng)將上述(2)步中長成的芽苗，剪切，轉接于經(jīng)消毒的含有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，進行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，視繁殖生產需要達1500-2000瓶進入下一步，所述的增殖培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)1.5-2.5毫克；6-節(jié)基嘌呤l.0-2.O毫克；oc-萘乙酸(NAA)0.01-0.l亳克；檸檬酸(Citricacid)50-100亳克；(4):壯苗培養(yǎng)將(3)中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，接種于經(jīng)消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的三角瓶中，進行壯苗培養(yǎng)，35天后進入下一步。所述的壯苗培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)0.5-1.O毫克、6-節(jié)基嘌呤0.5-1.O亳克、oc-萘乙酸(NAA)0.05-0.2亳克檸檬酸(Citricacid)50-100毫克。5(5):生根培養(yǎng)將(4)步中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉片，接種于經(jīng)消毒的含有生根處理產生根原基培養(yǎng)的培養(yǎng)基的三角瓶中，進行生根培養(yǎng)7-10天。所述的生根處理產生根原基培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含a-萘乙酸(NAA)0.3-0.8亳克；吲哚乙酸(IAA)0.5-1.0毫克；檸檬酸(Citricacid)100-150毫克；(6)、移栽將(5)步生長的帶有根原基的無根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭黃心土=1:1(體積比)的基質中，澆透水，保持溫度25。C左右，相對濕度85%以上，遮光(前7天)70%,后逐漸見光，20天后生根成活，生根率達90。/。以上，45天左右，全光照。上述老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，所有培養(yǎng)基其PH值均調至5.8左右,所述的基本培養(yǎng)基配方見表l。表1每升基本培養(yǎng)基中含有物質種類和質量<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>啟動培養(yǎng)基每升基本培養(yǎng)基+ZT1.Omg+BA2.Omg+NAA0.Olmg;增殖培養(yǎng)基每升基本培養(yǎng)基+ZT1.5mg+BA2.Omg+NAA0.01mg+檸檬酸5Omg;壯苗培養(yǎng)每升基本培養(yǎng)基+ZT0.5rag+BA1.Omg+NAA0.05mg+檸檬酸5Omg;生根處理產生根原基培養(yǎng)每升基本培養(yǎng)基+NAA0.3mg+IAA1.Omg+檸檬酸100mg。將上述啟動培養(yǎng)基注入三角瓶中，經(jīng)高溫高壓消毒(120-125°C，l.lKg/cm2)20分鐘，待用。1、采用經(jīng)選育的60年生的老齡秤錘樹腋芽莖段為外植體，經(jīng)70%酒精消毒50秒，再用0.1。/。的升汞溶液消毒10-12分鐘(添加Tween201-2滴/100亳升)，用無菌水沖洗3-5次；2、在超凈的工作臺上，無菌條件下，將消毒的外植體接種在經(jīng)消毒的含有啟動培養(yǎng)基的三角瓶中，先將其置于黑暗條件下10-15天后，再置于普通日光燈為光源、光照強度為1500-20001x下，每日照光15小時，溫度20-25。C、濕度為50%-60%，培養(yǎng)45天，分化長成試管芽苗；3、將從步驟2中長成的芽苗，剪切，轉接于經(jīng)消毒的含有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，進行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，一個周期35天的繁殖倍數(shù)為4.5，生長高度達3.8cm,視繁殖生產需要達1500-2000瓶時進入下一步；4、將步驟3中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，接種于經(jīng)消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的三角瓶中，進行壯苗培養(yǎng)，35天后進入下一步；5、將步驟4中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉片，按步驟2接種于經(jīng)消毒的含有生根處理產生根原基培養(yǎng)的培養(yǎng)基的三角瓶中，進行生根培養(yǎng)7-10天；6、將步驟5中生長的帶有根原基的無根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭黃心土=1:1(體積比)的基質中，澆透水，保持溫度25。C左右，相對濕度85%以上，遮光(前7天)70%，后逐漸見光，20天后生根成活，生根率達93%,45天左右，全光照，可實現(xiàn)老齡秤錘樹的規(guī)?；a。實施例2本實施例按實施例1的步驟進行操作，只是培養(yǎng)基的重量配比和原料組分不同，本實施例所用的基本培養(yǎng)基配方如表3，培養(yǎng)后生根率為95%。表3每升基本培養(yǎng)基中含有物質種類和質量化學名稱中文名稱mg/LCa(N03)2.4H20硝酸鉤417,03硝酸銨300KN03硫酸鉀675MgS047H20硫酸鎂278KH2P04磷酸二氫鉀128CaCl2■2H20氯化鈣96MnS044H20硫酸錳22.5ZnS047H20硫酸鋅8.6H3B03硼酸6.2CuS045H20硫酸銅0.25Na2Mo042H20鉬酸鈉0.25FeS047H20硫酸亞鐵34.1Na廠EDTA乙二胺四乙酸鈉46.6thiamine.HC1(維生素)鹽酸硫胺素Bi1.0pyridoxin.HC1(維生素BJ鹽酸P比P多辛B60.5nicotinicacid(VitB5)煙酸VB50.5Glycine甘氨酸2.0myo—inositol肌醇100蔗糖20000卡拉膠6500啟動培養(yǎng)基每升基本培養(yǎng)基+ZT2.0mg+BA0.5mg+NAA0.2ng;增殖培養(yǎng)基每升基本培養(yǎng)基+ZT2.5mg+BA1.0mg+MA0,ltng十檸檬酸lOOmg;壯苗培養(yǎng)每升基本培養(yǎng)基+ZT1,0mg+BA0.5mg+NAA0.2mg+檸檬酸lOOmg;生根處理產生根原基培養(yǎng)每升基本培養(yǎng)基+NAA0.8mg+IAA0.5mg+檸檬酸150mg。以上已以較佳實施例公開了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采用等同替換或者等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內。10權利要求1.一種老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，其特征是按下列步驟進行(1)、采用經(jīng)選育的多年生老齡秤錘樹腋芽莖段為外植體，經(jīng)70％酒精消毒40-50秒，再用0.1％的升汞溶液滅菌10-12分鐘(添加吐溫201-2滴/100毫升)，用無菌水沖洗3-5次；(2)、在超凈的工作臺上，無菌條件下，將消毒的外植體接種在經(jīng)消毒的含有啟動培養(yǎng)基的三角瓶中，先將其置于黑暗條件下10-15天后，再置于普通日光燈為光源、光照強度為1500-20001x下，每日照光15小時，溫度20-25℃、濕度為50％-60％，培養(yǎng)45天，分化長成試管芽苗；所述的啟動培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)1.0-2.0毫克、6-芐基嘌呤(BA)0.5-2.0毫克和α-萘乙酸(NAA)0.01-0.2毫克；(3)、將從(2)步中長成的芽苗，剪切，轉接于經(jīng)消毒的含有增殖培養(yǎng)基的三角瓶中，進行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，視繁殖生產規(guī)模需要達1500-2000瓶進入下一步；所述的增殖培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)1.5-2.5毫克、6-芐基嘌呤1.0-2.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.01-0.1毫克和檸檬酸(Citricacid)50-100毫克；(4)、將(3)步中培養(yǎng)的試管芽苗，剪切，接種于經(jīng)消毒的含有壯苗培養(yǎng)基的三角瓶中，進行壯苗培養(yǎng)，35天后進入下一步；所述的壯苗培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含玉米素(ZT)0.5-1.0毫克、6-芐基嘌呤0.5-1.0毫克、α-萘乙酸(NAA)0.05-0.2毫克和檸檬酸(Citricacid)50-100毫克；(5)、將(4)步中的試管壯苗，去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉片，接種于經(jīng)消毒的含有生根處理產生根原基培養(yǎng)的培養(yǎng)基的三角瓶中，進行生根培養(yǎng)7-10天；所述的生根處理產生根原基培養(yǎng)基為每升基本培養(yǎng)基含α-萘乙酸(NAA)0.3-0.8毫克、吲哚乙酸0.5-1.0毫克和檸檬酸(Citricacid)100-150毫克；(6)、將(5)步中生長的帶有根原基的無根小苗，取出清洗，移栽到含有泥炭黃心土＝1∶1(體積比)的基質中，澆透水，保持溫度25℃左右，相對濕度85％以上，遮光(前7天)70％，后逐漸見光，20天后生根成活，生根率達90％以上，45天左右，全光照。2.根據(jù)權利要求l所述的老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，其特征是所述的基本培養(yǎng)基的配方為每升基本培養(yǎng)基中含有硝酸鉤371-417mg,硝酸銨268-300mg，硫酸鉀600-675mg，硫酸鎂248-278mg，磷酸二氫鉀115-128mg，氯化錦72-96mg，硫酸錳22.5mg，硫酸鋅8.6mg,硼酸6.2mg,硫酸銅0.25mg，鉬酸鈉O.25mg，硫酸亞鐵34.lmg，乙二胺四乙酸鈉46.6mg,維生素B丄Omg，維生素B60.5mg，VB50.5mg，甘氨酸2.0mg，肌醇100mg，蔗糖20000mg，卡拉膠650Qmg。全文摘要一種老齡秤錘樹的組織培養(yǎng)方法，采用多年生秤錘樹腋芽莖段為外植體，經(jīng)消毒滅菌后，接種于啟動培養(yǎng)基中，先置于黑暗條件下10-15天，再置于普通日光燈下，每日照光15小時，溫度20-25℃、濕度50％-60％，培養(yǎng)45天，分化長成試管芽苗；將長成的芽苗，剪切，轉接于經(jīng)消毒增殖培養(yǎng)基中，進行增殖培養(yǎng)，不斷增殖，將增殖的試管芽苗剪切后接種于經(jīng)消毒壯苗培養(yǎng)基中，進行壯苗培養(yǎng)，35天后去掉基部愈傷組織和部分葉片，留3-4片葉片，接種于經(jīng)消毒的生根處理產生根原基培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，進行生根培養(yǎng)7-10天，取出清洗，移栽到含有泥炭∶黃心土＝1∶1(體積比)的基質中，20天后生根成活，生根率達90％以上。文檔編號A01H4/00GK101455179SQ200910028720公開日2009年6月17日申請日期2009年1月6日優(yōu)先權日2009年1月6日發(fā)明者君何,劉訓金,史愛玲,宮慶華,波楊,竇全琴,蔣澤平,黃利斌申請人:中山陵園管理局