專利名稱：蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生防制劑領(lǐng)域，具體涉及一種蠟樣芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用。
背景技術(shù)：
目前，資源和生態(tài)問題己成為世界各國尤其是中國這樣一個農(nóng)業(yè)大國可 持續(xù)發(fā)展的最主要瓶頸。在農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展中，化肥、農(nóng)藥的過量和不當使用 以及產(chǎn)品本身結(jié)構(gòu)造成的污染正成為農(nóng)業(yè)環(huán)境污染中的一個突出問題，不僅 對農(nóng)村及城鎮(zhèn)生態(tài)環(huán)境影響巨大，而且嚴重威脅著人類的食物安全和健康。
在當前社會形勢下，化肥、農(nóng)藥不可能也不應該從市場上消失，從長遠 發(fā)展來看，抓緊益生菌的研發(fā)工作拔劍弩張。能夠取代化肥和農(nóng)藥的微生物 肥料劑既包括直接提供養(yǎng)分的傳統(tǒng)肥料范疇，又包括促生、拮抗病原微生物、 提高植物抵御不良環(huán)境和減少化肥農(nóng)藥使用量等效應的范疇，對促進作物增 產(chǎn)、作物生物災害預防、生態(tài)可持續(xù)控制、無污染無公害的綠色食品生產(chǎn)及 農(nóng)民負擔的減輕有著不可估量的應用價值。在這一大背景下，研發(fā)高效、環(huán) 保的生防制劑對我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。
很多蠟樣芽孢桿菌是一些谷類作物、蔬菜及樹木的內(nèi)生菌，能在植物活 體內(nèi)定植，對寄主植物不產(chǎn)生任何危害并與其建立和諧關(guān)系，促進植物生長、 減少病害蟲害，提高植物抵御不良環(huán)境的能力并減少化肥使用量。除了抑菌 和促進植物生長外，部分蠟樣芽孢桿菌還具有抑菌殺蟲作用。這些有益菌常 被制成制劑應用于農(nóng)業(yè)，目前生產(chǎn)上使用的增產(chǎn)菌株83-10、 A-47、 M22等 均為蠟樣芽孢桿菌。CN 1417325A提供一種蠟狀芽孢桿菌B.C.98-I ^J—^f中及 以該菌株制備微生物殺菌劑的生產(chǎn)方法，該菌株對黃瓜、青椒等蔬菜枯萎病 有抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蠟樣芽孢桿菌Bac///w cerewCMCC63305在農(nóng) 業(yè)領(lǐng)域，特別是提高種子發(fā)芽率、促進農(nóng)作物生長及抑制病原菌方面的應用。 本發(fā)明的目的可以通過以下措施達到
蠟樣芽孢桿菌萬acz7/w cew^CMCC63305在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用，特別是在 農(nóng)作物的促生或抑菌方面的應用，如提高種子發(fā)芽率方面、在促進農(nóng)作物生 長方面以及在抑制病原菌方面。
蠟樣芽孢桿菌萬a"7/w cew^CMCC63305菌株的培養(yǎng)方法，包括菌種活 化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)步驟。
菌種活化時的培養(yǎng)基為(g/L):牛肉膏4.0 6.0，蛋白胨7.0 1L0，瓊脂 10~30， NaCl 4.5~5.5， pH 6.0-9.0，其余為H20;進一步優(yōu)選為牛肉膏4.5~5.5, 蛋白胨9.0 11.0，瓊脂10 30，NaC14.5 5.5, pH6.0~9.0，其余為H20， 121 °C 滅菌。菌種活化時，將菌種接入有菌種活化培養(yǎng)基的平板中，30 40 'C培養(yǎng) 24 h。
種子培養(yǎng)時的培養(yǎng)基為(g/L):牛肉膏4.0-6.0，蛋白胨7.0-11.0， NaCl 4.5~5.5， pH 6.0-9.0，其余為H20。種子培養(yǎng)采用一般的工藝條件，而實驗 室的小試方法為于平板取一環(huán)單菌落，接入裝有100mL培養(yǎng)基的500mL 三角瓶中，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以150~200r/min， 30-40 。C培養(yǎng)24h。
發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源選自葡萄糖、淀粉或玉米淀粉中的一種或幾種；氮 源選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏或尿素中的一種或幾種；無機鹽選自NaCl、 MnS04 H20 、 KH2P04或MgS04 7H20中的一種或幾種。發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu) 選為(g/L):牛肉膏4.0~6.0，蛋白胨7.0~11.0， NaC14.5~5.5，葡萄糖5~20， MnS04 H20 0.8 1.5， KH2P04 1.5~2.5， MgS04 7H2〇0.4 0.6, pH 6,0~9.0，
其余為H20。發(fā)酵培養(yǎng)采用常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，實驗室的小試方法為:以
10%接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中， 在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以150-200 r/min， 30 40'C培養(yǎng)24 h。
Sac/〃w cewwsCMCC63305菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基于30~40 °C、 170 r/min下培養(yǎng)24 h后即為菌株代謝液。取一定量發(fā)酵液于10 000 r/min下離心10 min， 棄上清夜，取菌泥，用無菌水即可制成108cfij/mL的菌懸液。本發(fā)明中可以 采用l: 100~1: 1000倍稀釋(105~106cfb/mL)的菌株代謝液或菌懸液。菌 株在培養(yǎng)過程中還可加入某些保護劑以提高發(fā)酵的效率。
5ac〃/ws cwe^CMCC63305菌株在農(nóng)作物(如油料作物，谷類作物，塊 莖作物，果菜類作物，葉菜類作物等)方面，集促生、抑菌等性能于一體。 5ac///w cew^CMCC63305菌液可提高種子的萌發(fā)率，并可促進根生長；用 菌懸液和代謝液浸種(24 h)、灌根或噴灑葉面可以促進農(nóng)作物的生長，如提 高大豆、油菜、玉米、小麥、水稻、蘿卜、甘薯、馬鈴薯、黃瓜、南瓜、冬 瓜、番茄、菠菜、白菜等作物的株高、干鮮重等；該菌對病原菌，如蔬菜灰 霉病、小麥紋枯病、水稻稻瘟病和小麥赤霉病等植物病害具有顯著的防治作 用。該菌集促生和抑菌等性能于一體。
具體實施例方式
菌株的培養(yǎng)
種子活化將^"7/w cere^CMCC63305菌種接入有①號培養(yǎng)基的平板 中，37 'C培養(yǎng)24h。種子培養(yǎng)于平板取一環(huán)單菌落，接入裝有100mL② 號培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以170r/min，37 °C 培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)以10%接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有100mL③號培養(yǎng) 基的500mL三角瓶中，在迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜中以170r/min， 37 。C培養(yǎng) 24 h。
其中，①號培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏4.0 6.0，蛋白胨7.(M1.0，瓊脂10~30， NaC14.5 5.5，其余為H20， pH 6.0-9.0， 121 "C滅菌。②號培養(yǎng)基(g/L): 牛肉膏4.0-6.0，蛋白胨7.0~11.0， NaC14.5~5.5，其余為H20， pH 6.0-9.0， 121 。C滅菌。③號培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏4.0 6.0，蛋白胨7.0 11.0，NaC14.5 5.5， 葡萄糖5~20， MnSO4'H2O0.8 1.5， KH2P04 1.5~2.5， MgS04.7H20 0.4 0.6， 其余為H20， pH 6.0-9.0， 121 。C滅菌。實施例1: Sa"7/us cewusCMCC63305菌株平皿促種子發(fā)芽實驗
將濾紙墊于培養(yǎng)皿中，經(jīng)12rC濕熱滅菌20min，即得到無菌濾紙平皿。 5ac/〃w ce^^CMCC63305菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基于37 。C 、 170 r/min下培養(yǎng)24 h 后即得到菌株代謝液，用無菌水稀釋至濃度為108 cfti/mL。挑選顆粒飽和、 大小一致的小麥種子，用P/。次氯酸鈉表面消毒10min，然后用無菌水沖去麥 粒表面殘留的次氯酸鈉并吹干表面的水分。用濃度為10Scfli/mL的代謝液和 在此基礎上稀釋的梯度稀釋液(1: 10~1: 10000) (104~107cfli/mL)浸種24 h，以無菌水和未接菌株的培養(yǎng)液作為對照。把小麥種子沿培養(yǎng)皿周圍整齊的 播種到培養(yǎng)皿中(每皿33粒，每個處理重復3次)，播種時使種子胚一律朝向 同一方向，加蓋后，將培養(yǎng)置于恒溫培養(yǎng)箱，定時觀察種子萌發(fā)情況，培養(yǎng) 66h后測量根長、芽長及發(fā)芽率。結(jié)果表明，1: 100~1: 1000倍稀釋(105 106 cfWmL)的菌液可將種子的萌發(fā)率提高6% 11%，并可顯著促進根生長，增 幅達7% 11%。
表1菌株對小麥種子發(fā)芽的影響處理20小時萌芽率/%66小時發(fā)芽率/%根長/cm芽長/cm根/芽
108cfu/mL56852.711.651.64
1:1076863.121.891.65
1:10084883.681.971.87
1:20086883.701.941,91
1:50089893.712.011.85
1:100085893.691.941.90
1:1000084903,702.051,80
無菌水78873.352,011.67
培養(yǎng)液76883.342.081.61
按上述方法，采用濃度為1()Scfli/mL的菌株代謝液分別對大豆、水稻、 蘿卜、黃瓜和菠菜進行促種子發(fā)芽實驗，結(jié)果表明，可分別將種子的萌發(fā)率提高5%~7%、 9°/。 12%、 6% 8%、 6%~9%、 4%~6%。
實施例2 : S""7/wjcewwCMCC63305菌株對農(nóng)作物促生作用的田間試驗
5ac/〃w cwewCMCC63305菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基于37 °C、 170 r/min下培 養(yǎng)24 h后即為菌株代謝液。取一定量發(fā)酵液于10 000 r/min下離心10 min， 棄上清夜，取菌泥，用無菌水即可制成1()ScfU/mL的菌懸液。田間實驗共設 6個不同的處理(編號l， 2， 3， 4， 6， 7) l個對照(編號5)，如表1所示。
表2田間實驗設計
編號 處理方式
5CK
1代謝液浸種(24小時)
2代謝液浸種(24小時)+灌根(2葉一-心)
6代謝液浸種(24小時)+灌根(2葉—'心)+噴灑葉面(3葉一心)
4菌懸液浸種(24小時)
菌懸液浸種(24小時)+灌根(2葉一.心)
7菌懸液浸種(24小時)+灌根(2葉一'心)+噴灑葉面(3葉一心)
每小區(qū)長7m，寬3m， 2次重復。用常規(guī)的栽培方式進行肥水管理。40 d后，采樣測量株高、干鮮重，每個小區(qū)采樣50株。^a"7/uy cem^CMCC63305 的6個處理都能增加小麥植株干重和鮮重，與對照相比，鮮重增加了 9%~13%，干重增加了9% 13%。 5ac〃/wcem^CMCC63305處理后，小麥株 高除編號2與編號6處理與對照相當外，其他幾個處理的小麥株高與對照相 比都略有增加，增加幅度為2%~6%。經(jīng)過Sac/〃w "re^CMCC63305的處 理過的小麥都較對照明顯健壯。
按上述方法處理玉米和油菜，都較對照明顯健壯，其鮮重和干重的增加 均在7% 16°/。以內(nèi)；將上述方法的時間改為20d后，處理冬瓜和白菜，也都 較對照明顯健壯，其鮮重和干重的增加均在5% 11%以內(nèi)。實施例3 : 5""7/"^"^^:]\40:63305菌株對農(nóng)作物苗的促生作用
菌懸液的制備同實施示例2;用菌懸液將清水浸泡和催芽的種子進行拌 種，播種于裝有無菌的營養(yǎng)土的花盆中。以清水浸泡未拌種處理的種子作對 照。每處理6盆，重復3次。每盆播種5粒，置于培養(yǎng)室中，光暗時間12h/12h 條件下培養(yǎng)，出苗后每盆留苗4株。待苗的第一片真葉展開后，統(tǒng)計苗成活
率、株咼、株重o
經(jīng)拌種處理的黃瓜苗的苗成活率、平均株高、株重都顯著高于清水處理
的黃瓜苗，說明^cf〃w cem^CMCC63305對黃瓜苗的生長具有促進作用； 經(jīng)拌種處理的黃瓜苗長勢良好，苗整齊粗壯，而對照組同等條件下的黃瓜苗 矮小，整體長勢較差。經(jīng)計算，黃瓜的植株干重增加了 12.5%,根重增加了 10.2%。
采用相同的方法處理南瓜、菠菜、蘿卜、番茄和白菜，其整體長勢都優(yōu) 于對照組。
實施例4: Sac///^ cwe^CMCC63305菌株對病原菌的平板抑制作用
對照試劑多菌靈用0.02mol/L的稀HCl溶解，配制成母液，再根據(jù)劑量 加入到培養(yǎng)基中，搖勻，制成含藥平板；腐霉利原藥用丙酮溶解后配制成1000 "g/mL的母液，根據(jù)劑量加入到培養(yǎng)基中，搖勻，制成含藥平板。含蠟樣芽 孢桿菌培養(yǎng)基的配制把蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液按1 : 100的比例加入冷卻至 40 'C左右的培養(yǎng)基中，搖動后倒入9cm的培養(yǎng)皿中，冷凝后備用。
分別在上述3種培養(yǎng)皿中央接種直徑0.5 cm病原菌的菌碟，菌絲朝下。 25X:培養(yǎng)至空白對照菌落布滿培養(yǎng)皿2/3以上時，測量各處理的菌落直徑。 每個菌落按十字交叉法測量3次，以其平均數(shù)代表菌落的大小。計算藥劑對 菌體生長的抑制率。
空白菌落直徑一處理菌落直徑 菌絲生長抑制率％= - xioo
空白菌落直徑一菌餅直徑
以多菌靈和腐霉利作為空白對照，進行5ac/〃w cerewCMCC63305對不同病原菌的平板抑制實驗。未離心的^2c/〃w cem^CMCC63305代謝液對小 麥紋枯病有很好的抑制效果，在106cfo/mL劑量下對小麥紋枯病的菌絲生長 抑制率達86%，略低于多菌靈藥劑的殺菌效果。離心的Sa"7/w c^wCMCC63305對蔬菜灰霉病的抑制率為51%,接近對照藥劑腐霉利的抑 制率51.53%，未離心的Sac/〃w cem^CMCC63305對蔬菜灰霉病的抑制率為 64%,高于照藥劑腐霉利的抑制率52%。
結(jié)論3""7/^"^^0^(^:63305同時具有促生和抑菌功能，該菌的多種 功效決定了其推廣具有廣泛性，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。
權(quán)利要求
1、蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于蠟樣芽孢桿菌5a"7/wcem^CMCC63305在提高種子發(fā)芽率方面的應用。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于蠟樣芽孢桿菌^C7'〃Wcew^CMCC63305在促進農(nóng)作物生長方面的應用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于蠟樣芽孢桿菌萬""7/wcem^CMCC63305在抑制病原菌方面的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusCMCC63305在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應用，特別是在農(nóng)作物的促生及抑菌方面的應用，如提高種子發(fā)芽率方面、在促進農(nóng)作物生長方面以及在抑制病原菌方面。Bacillus cereusCMCC63305同時具有促生和抑菌功能，該菌的多種功效決定了其推廣具有廣泛性，符合生態(tài)農(nóng)業(yè)的要求。
文檔編號A01N63/02GK101473853SQ200910028320
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日
發(fā)明者輝 于, 李棟蕓, 楊文革, 飛 沈, 珺 管, 胡永紅 申請人:南京工業(yè)大學