一種柿樹組織培養(yǎng)培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)基，尤其涉及一種柿樹組織培養(yǎng)培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 柿子是柿樹科漿果類溫帶落葉果樹，原產(chǎn)我國，在我國已有一千多年的種植歷史。 目前我國種植面積最大，而且柿果產(chǎn)量最多。柿子柔嫩多汁、甘甜爽口、營養(yǎng)豐富。有甜柿 和澀柿兩種，澀柿不可直接食用，需要經(jīng)過脫澀處理，甜柿可以鮮食。柿子的營養(yǎng)成分十分 豐富，含有豐富的蔗糖、葡萄糖、果糖、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素 C、瓜氨酸、碘、鈣、磷、鐵。 新鮮柿子含碘很高，能夠防治地方性甲狀腺腫大。柿子性味性寒，味甘澀，歸經(jīng)肺經(jīng)，有潤 肺生津，清熱止血，澀腸健脾，解酒降壓等功效。柿子含有大量的單寧。單寧又叫鞣酸，是 一種多酚的聚合物，是一種由兒茶酚等聚合而成多酚聚合物，含有許多鄰位的酚羥基，因而 有許多功能。Seguin于1796年定義了一個專門術(shù)語Tannin (單寧）來表示植物水浸提物 中能使生皮轉(zhuǎn)化為革的化學成分。后來通過研宄逐漸認識到，植物浸提物中能產(chǎn)生鞣制作 用的是一系列多酷類化合物，其有效成分的分子量在500-3000之間。單寧又稱親酸，淡黃 色至淺棕色無晶粉末，屬于多元苯酚的復雜化合物。將植物單寧又改稱為植物多酚（plant polyphonies)，即存在于柿果使其呈濕味的酷類物質(zhì)稱為柿單寧（kaki tannin)。柿單寧具 有防曬保濕、抗皺美容、防腐殺菌、預防心血管疾病、吸附金屬離子以及和蛋白質(zhì)相互作用 等諸多功能。
[0003] 目前柿樹繁殖育苗主要采用以下幾種方法：（1)分株繁殖：3-4月挖取母株支根上 萌發(fā)的幼株進行移植，此時幼株葉片尚未展開，但長有須根，挖取時要保證幼株有約IOcm 長的支根和較完整的須根；（2)分根繁殖：春季氣溫回升時，在支根上出現(xiàn)許多突起的白色 不定芽，把這種支根挖出，按長l〇-15cm切成根段，斜插或平埋于沙床中，淋水保濕，半個月 后根段即可長成幼株；（3)種子繁殖：果實成熟呈橙紅色或紅色時采收，取出種子用沙覆蓋 保存，或播入苗床，行距20cm，株距5-7cm，播后除草。種子長出2片葉后，移入營養(yǎng)袋育苗， 營養(yǎng)土用腐熟的農(nóng)家肥與泥土、草皮灰混合而成，苗期淋水和施濃度稍淡的肥料；(4)無性 繁殖：主要是用長穗一莖帶兩節(jié)間一葉長約8-lOcm，土壤選用石灰消毒，再鋪心土、用生根 劑浸泡的育苗方法。
[0004] 目前采用繁殖育苗方法有一定的效果，但是成活率等不穩(wěn)定，這就大大制約了柿 樹的繁殖，成為加快開發(fā)利用柿子的瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種柿樹組織培養(yǎng)培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基 包括繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，其中：
[0006] 每升（L)繼代培養(yǎng)基的組分及各組分的含量如下：
[0007] (1)大量元素：硝酸鉀1260mg/L、硝酸銨1320mg/L、二水氯化鈣440mg/L、七水硫酸 鎂370mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L、七水硫酸亞鐵27. 8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L ;
[0008] (2)微量元素：四水硫酸錳22. 3mg/L、七水硫酸鋅8. 6mg/L、硼酸6. 2mg/L、二水鉬 酸鈉0· 25mg/L、碘化鉀(λ 83mg/L、五水硫酸銅(λ 025mg/L、六水氯化鈷(λ 025mg/L ;
[0009] (3)有機物：肌醇l〇〇mg/L、甘氨酸2. Omg/L、鹽酸吡哆醇（VB6) 0· 5mg/L、煙酸 0· 5mg/L、鹽酸硫胺素（VB1)O. lmg/L、半胱氨酸 15mg/L ;
[0010] (4)植物生長調(diào)節(jié)劑：6-芐基腺嘌呤0· 3-1. Omg/L、萘乙酸0· 1-0. 2mg/L、龍眼汁 0. 3-〇. 5mg/L ；
[0011] 余量為蒸餾水；
[0012] 每升（L)生根培養(yǎng)基的組分及各組分的含量如下：
[0013] (1)大量元素：硝酸鉀475mg/L、硝酸銨412. 5mg/L、二水氯化鈣110mg/L、七水硫 酸鎂92. 5mg/L、磷酸二氫鉀42. 5mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L、七水硫酸亞鐵27. 8mg/ L ；
[0014] (2)微量元素：四水硫酸錳22. 3mg/L、七水硫酸鋅8. 6mg/L、硼酸6. 2mg/L、二水鉬 酸鈉0· 25mg/L、碘化鉀(λ 83mg/L、五水硫酸銅(λ 025mg/L、六水氯化鈷(λ 025mg/L ;
[0015] (3)有機物：肌醇100mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、鹽酸吡哆醇（VB6) 0· 5mg/L、煙酸 0· 5mg/L、鹽酸硫胺素（VB1)O. Img/ ;
[0016] (4)植物生長調(diào)節(jié)劑：ABT6號0· 4-0. 6mg/L、吲哚乙酸0· 1-0. 3mg/L、龍眼汁 0. 3-〇. 5mg/L ；
[0017] 余量為蒸餾水。
[0018] 本發(fā)明所述龍眼汁為新鮮龍眼去除枝葉、病蟲果、爛果、腐果、未成熟果，清洗、去 除果皮果核，果肉壓榨，得到的果汁，滅菌得到。
[0019] 本發(fā)明柿樹組織培養(yǎng)基中的繼代、生根培養(yǎng)基的配制方法為：
[0020] 1母液的配制與保存
[0021] 1. 1為便于取樣，宜先配制各種母液，分為大量元素母液、微量元素母液、有機物母 液和各種植物生長調(diào)節(jié)劑母液。蔗糖、瓊脂不宜配成母液，需要時直接稱樣；
[0022] 1. 2大量元素母液濃度成100倍溶液，有機物、微量元素母液配成200倍溶液，植物 生長調(diào)節(jié)試劑母液的濃度配成lmg/ml ;
[0023] 1. 3母液選用無菌的蒸餾水、去離子水或超純水配制，大量生產(chǎn)時用煮沸過的水；
[0024] 1.4配制大量元素母液時，每個組分應(yīng)單獨溶解，后按氮、鈣、鎂、磷的順序逐個混 合，否則容易引起沉淀；
[0025] 1. 5微量元素、有機物、植物生長調(diào)節(jié)劑母液應(yīng)用棕色瓶裝好并置于冰箱中保存；
[0026] 1. 6母液配制后應(yīng)及時使用，貯存時間不宜超過1個月；
[0027] 1. 7發(fā)現(xiàn)母液有沉淀，或有微生物生長，或有藻類生長，應(yīng)廢棄不用。
[0028] 2培養(yǎng)基的配制
[0029] 2. 1依照培養(yǎng)基配方，按比例量取各種母液；
[0030] 2. 2在定量容器內(nèi)放入準備配制培養(yǎng)基總量的約1/2以上的純凈水，并加入適量 的糖，然后邊攪拌邊逐一加入所需量的母液；
[0031] 2. 3瓊脂可加熱熔化后加入，如有攪拌設(shè)備時也可直接加入瓊脂粉，然后用純凈水 補足所需配制培養(yǎng)基的總量，攪拌均勻即可；
[0032] 2. 4培養(yǎng)基中的糖，在大量組培苗生產(chǎn)中，一般可用市售白糖，但最好是用蔗糖而 不要用甜菜糖；
[0033] 2. 5用1.0摩爾/升的鹽酸或1.0摩爾/升的氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值至5.8 ;
[0034] 2. 6配制好的培養(yǎng)基要盡快分裝到培養(yǎng)容器中，以免培養(yǎng)基凝固或變稠而難以分 裝；
[0035] 2. 7分裝培養(yǎng)基時應(yīng)注意避免培養(yǎng)基粘在瓶口上，如果粘有培養(yǎng)基，在蓋瓶蓋或瓶 塞前必須用干凈紗布擦凈瓶口。
[0036] 3培養(yǎng)基消毒滅菌
[0037] 3. 1將分裝好的培養(yǎng)基裝于高壓滅菌鍋內(nèi)消毒；
[0038] 3. 2加熱初期，當消毒鍋消毒室的氣壓達0. 05Mpa時，打開冷凝閥，排盡消毒室內(nèi) 冷空氣；
[0039] 3. 3當消毒室內(nèi)氣壓達到0. llMpa、溫度達121°C時，開始計時，保持溫度與壓力消 毒15-20分鐘；
[0040] 3. 4關(guān)閉加熱電源開關(guān)，按慢排氣方式排放熱氣，待消毒室內(nèi)的氣壓降至大氣壓時 打開消毒鍋蓋或門，取出培養(yǎng)基；
[0041] 3. 5培養(yǎng)基應(yīng)置于空氣少流動和少灰塵的干凈環(huán)境冷卻，否則在降溫進氣過程中 導致霉菌孢子進入培養(yǎng)器皿，產(chǎn)生霉菌污染。
[0042] 4培養(yǎng)基儲藏
[0043] 4. 1培養(yǎng)基應(yīng)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用；
[0044] 4. 2可在空氣干凈且不流動的環(huán)境短時間儲藏培養(yǎng)基，但儲藏超過1個月的培養(yǎng) 基應(yīng)廢棄不用。
[0045] 本發(fā)明柿樹組織培養(yǎng)的方法為：
[0046] 1.無菌芽的獲取
[0047] 柿樹果實為肉質(zhì)果，7-8月份成熟，當果實由青色轉(zhuǎn)為黃色帶紅，果肉變軟時采摘， 將果實揉搓，用清水洗凈后得種子，并將其及時置于陰涼處晾干，剝?nèi)ネ鈿?。在超凈臺上用 75%酒精浸泡消毒10s，無菌水漂洗2-3次，再用0. 1 %升汞溶液消毒15min，無菌水漂洗5 次。將經(jīng)消毒處理的種子接種在誘導培養(yǎng)基上進行初始培養(yǎng)，誘導種子發(fā)芽以獲取無菌材 料。外植體初次培養(yǎng)時，需全暗培養(yǎng)10天左右，再放到弱光下進行培養(yǎng)，大約經(jīng)過20天左 右的種子開始萌芽，然后再移至見光的地方培養(yǎng)。
[0048] 2.芽的增殖培養(yǎng)
[0049] 將誘導獲得的無菌芽接種至繼代培養(yǎng)基上進行芽的繼代增殖，一般40天繼代 一次，繼代材料均放在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度為（25±2) °C，光照12h. cf1，光照度 20001x〇
[0050] 3.生根的誘導
[0051] 芽條長至約2-3cm時，將較健壯的芽苗由叢生芽上單個切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上誘 導生根，其余芽苗轉(zhuǎn)至繼代培養(yǎng)基上繼續(xù)進行增殖培養(yǎng)。生根培養(yǎng)需要在弱光下培養(yǎng)15天 左右，此時小苗的基部形成白色突起，并逐漸伸長，20天后可形成明顯根系，逐漸長成完整 的小植株，此時期宜逐步增加光照使小苗變得粗壯。
[0052] 4.生根苗的移栽
[0053] 待生根小苗充分木質(zhì)化，葉片舒展，葉色濃綠，莖軸伸長，苗高約3_4cm時即可進 行大棚移栽。移栽時先取出小苗，洗凈基部的培養(yǎng)基后，移栽于經(jīng)0. 1%高錳酸鉀消毒過用 營養(yǎng)袋裝好的育苗基質(zhì)上，移栽后澆透定根水，保持一定的溫度和濕度，并要定期進行噴藥 進行防病處理。
[0054] 與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0055] 1、增殖和生根培養(yǎng)通過添加合適量的龍眼汁，能促進甜茶不定芽的生長，繁