一種防風(fēng)的組織培養(yǎng)快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)中植物組織培養(yǎng)的方法，具體地說(shuō)，涉及一種防風(fēng)的組織培養(yǎng)快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]培Saposhnikovia di vari ca ta)為傘形科藥用植物，其干燥根入藥，含有多種生物化學(xué)成分，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗病毒等作用。傳統(tǒng)的防風(fēng)獲取方法是采挖野生植物資源，由于盲目挖掘，不僅使野生資源日益減少而且嚴(yán)重破壞了自然界的生態(tài)平衡。此外，栽培品種的種性退化，產(chǎn)量和品質(zhì)下降，不能適應(yīng)規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要。
[0003]目前關(guān)于防風(fēng)的研究主要集中在植物資源、化學(xué)成分分析、生藥鑒定、藥理作用和臨床應(yīng)用等方面，這些研究為以防風(fēng)為基源制劑的臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)技術(shù)為防風(fēng)的規(guī)模化生產(chǎn)開(kāi)辟了新的途徑。至今為止，尚未見(jiàn)有關(guān)防風(fēng)離體再生體系的所道，這嚴(yán)重影響了防風(fēng)種苗繁殖的發(fā)展。因此，非常有必要建立系統(tǒng)的防風(fēng)離體快繁體系，為防風(fēng)種苗工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種防風(fēng)的組織培養(yǎng)快繁方法，本發(fā)明以種子為外植體，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過(guò)程實(shí)現(xiàn)了防風(fēng)的組織培養(yǎng)快速繁殖，從而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明的一種防風(fēng)的組織培養(yǎng)快繁方法，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的防風(fēng)種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來(lái)水中沖洗10?30min后置于清水中浸泡8?12h,再轉(zhuǎn)入50?120mg/mL的赤霉素溶液中浸泡10?15h，然后在超凈工作臺(tái)中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無(wú)菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無(wú)菌水沖洗3?5次后用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0006](2)愈傷組織誘導(dǎo):用無(wú)菌解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后的種子上割I(lǐng)?3刀造成傷口后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后在25?28°C條件下進(jìn)行全暗培養(yǎng)直至形成愈傷組織。
[0007](3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長(zhǎng)至20?30天后，將長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?3天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)，20天左右轉(zhuǎn)接一次。
[0008](4)不定芽誘導(dǎo):將培養(yǎng)至15?20天的長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)2?5天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至形成不定芽。
[0009](5)生根培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2.5?3.5cm高時(shí)，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在25?28°C條件下全暗培養(yǎng)I?4天，然后置于每天光照12?16小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000?30001x，培養(yǎng)溫度為25?28°C的條件下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出根。
[0010](6)試管苗移栽:當(dāng)小苗長(zhǎng)出的新根系長(zhǎng)達(dá)2?3.5cm,并且長(zhǎng)出側(cè)根，苗聞5cm以上時(shí)，將培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質(zhì)中并定植于大田中。
[0011]上述步驟(2)所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+ I?5mg/L 2，4-D+ 0.5?2mg/L 6-BA+0.1 ?lmg/L KT+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為
5.4 ?5.8。
[0012]上述步驟(3)所述的增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5?3.0mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(4)所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.1?0.5mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(5)所述的生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.05?0.5mg/L 6-BA+0.1?1.0mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:以防風(fēng)種子為外植體建立了防風(fēng)離體快繁體系，以適應(yīng)規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的需要。本發(fā)明以種子為外植體，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)、根苗誘導(dǎo)以及試管苗馴化移栽等過(guò)程實(shí)現(xiàn)了防風(fēng)的組織培養(yǎng)快速繁殖，為防風(fēng)種苗工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0017]實(shí)施例1:
(I)外植體的處理:選取當(dāng)年收飽滿的防風(fēng)種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來(lái)水中沖洗1min后置于清水中浸泡8h,再轉(zhuǎn)入80mg/mL的赤霉素溶液中浸泡1h,然后在超凈工作臺(tái)中以75%乙醇溶液浸泡10s，無(wú)菌水沖洗3次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min,無(wú)菌水沖洗3次后用無(wú)菌濾紙吸干表面的水分后備用。
[0018](2)愈傷組織誘導(dǎo):用無(wú)菌解剖刀在經(jīng)步驟(I)處理后的種子上割I(lǐng)刀造成傷口后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種后在28°C條件下進(jìn)行全暗培養(yǎng)25天即可形成愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)96.8%。所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+ 3mg/L 2, 4-D+ 0.5mg/L6-BA+ 0.3mg/L KT+3.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.08% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0019](3)增殖培養(yǎng):愈傷組織生長(zhǎng)至23天后，將長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)2天，然后置于每天光照13小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)，23天轉(zhuǎn)接一次，愈傷組織生長(zhǎng)迅速，呈黃綠色，質(zhì)地緊密，愈傷增殖倍數(shù)達(dá)5.8。所述增殖培養(yǎng)基為MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.1%活性炭，pH值為5.8。
[0020](4)不定芽誘導(dǎo):將培養(yǎng)至15天的長(zhǎng)勢(shì)良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)3天，然后置于每天光照12小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001χ，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)15天后愈傷組織逐漸變綠，并形成很多突起，進(jìn)而形成多芽體，分化率高達(dá)86.3%。所述的分化培養(yǎng)基為:MS+0.3mg/L NAA+1.5mg/L6-BA+2.5%蔗糖+0.5%瓊脂+0.1%活性炭，pH值為5.8。
[0021](5)生根培養(yǎng):當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至2.5?3.5cm高時(shí)，將叢生苗切割成單苗接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，接種后先在28°C條件下全暗培養(yǎng)2天，然后置于每天光照14小時(shí)，光照強(qiáng)度為20001x，培養(yǎng)溫度為28°C的條件下培養(yǎng)15天后開(kāi)始生根，生根率達(dá)88.4%，