專利名稱：將外源基因?qū)腱`長類動(dòng)物的早期胚胎的方法和包含該方法的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因靈長類動(dòng)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以用作人類疾病模型動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因非人靈長類動(dòng)物的生產(chǎn)，以及 涉及用于將基因?qū)腱`長類動(dòng)物的早期胚胎的方法。
背景技術(shù)：
已經(jīng)利用小鼠或大鼠生產(chǎn)了各種人類疾病模型動(dòng)物。通過遺傳操作，例如，將 涉及人類疾病的基因?qū)敕侨藙?dòng)物中、敲除與涉及人類疾病的基因同源的基因，等等， 來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可以用作人類疾病模型動(dòng)物。然而，難以根據(jù) 這些動(dòng)物獲得的結(jié)果來估計(jì)臨床應(yīng)用對(duì)人類的適當(dāng)性，因?yàn)樵谛∈蠡虼笫笈c人類之間存 在著解剖學(xué)的、生理學(xué)的和遺傳學(xué)的差異。因此，進(jìn)化上與人類緊密相關(guān)的靈長類作為 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的使用受到期望。轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物的生產(chǎn)需要將外源基因，例如，涉及人類疾病的基因?qū)敕侨?動(dòng)物早期胚胎中。為此的常規(guī)方法是DNA顯微注射、利用病毒例如慢病毒作為載體的 方法，等等。然而，顯微注射存在胚胎損傷顯著，以及基因轉(zhuǎn)移效率降低的問題(參 見Hammer，R.E.et al.Nature 315，680-3(1985))。必需使用許多卵細(xì)胞來補(bǔ)償這樣的 低效性。然而，在靈長類、家畜等的情況中，由于倫理的和經(jīng)濟(jì)的原因而難以準(zhǔn)備許 多卵細(xì)胞。因此，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法已經(jīng)對(duì)家畜進(jìn)行(參見Chan，A.W.et al.，Proc Natl Acad Sci U.S.A.95, 14028-33(1998) ； Hofmann, A.et al.EMBO Rep 4， 1054-60(2003)；禾Π Hofmann，A.et al.Biol Reprod 71, 405-9(2004))。利用逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體的這些方法存在導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因在動(dòng)物體中被抑制的問題(參見Chan，A.W.et al., Science 291, 309-12(2001))。為了補(bǔ)救基因抑制的這種難題，慢病毒載體被用于牛和豬 (參見 Hofmann，A.et al.EMBO Rep 4, 1054-60(2003)；禾Π Hofmann，A.et al.Biol Reprod 71， 405-9(2004))ο對(duì)于靈長類，已經(jīng)利用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒嘗試了轉(zhuǎn)基因恒河猴(Macaca mulatta)的生產(chǎn)(參見 Chan，A.W.et al., Science 291，309-12 (2001)；和 Wolfgang， M.J.et al.Proc Natl Acad Sci U.S.A.98，10728-32 (2001))。然而，即使在使用慢病毒的情 況中，在胎盤中雖觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)，但是在嬰兒中卻從未被觀察到(參見Wolfgang， M.J.et al.Proc Natl Acad Sci U.S.A.98, 10728-32 (2001))。還報(bào)道 了導(dǎo)入 了人類亨廷頓 (Huntington)基因的恒河猴的生產(chǎn)(參見 S.H.Yang et al.，Nature, vol.453, No.7197, 921-(2008))，但是其中既沒有觀察到存活的嬰兒中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)也沒有觀察到導(dǎo) 入的轉(zhuǎn)基因的種系傳播。恒河猴和食蟹猴(Macaca fascicularis)通常被用作實(shí)驗(yàn)的非人靈 長類。然而，這些猴子存在難以獲得幼雛期動(dòng)物用于模型動(dòng)物生產(chǎn)的問題，因?yàn)檫@些靈 長類的低繁殖率，而要花費(fèi)約3年來獲得下一代動(dòng)物，并且每例僅可獲得約10只動(dòng)物作 為下一代動(dòng)物。如上所述，使用某些哺乳動(dòng)物例如靈長類，沒有實(shí)現(xiàn)基因?qū)肱咛サ母咝省?br> 使用某些動(dòng)物，例如小鼠，可以利用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。然而，還未使用 ES細(xì)胞生產(chǎn)出外源轉(zhuǎn)基因被傳播到種系的轉(zhuǎn)基因靈長類動(dòng)物。例如，本發(fā)明人成功生產(chǎn) 了狨猴ES細(xì)胞(參見國際專利公開W02006/029093小冊(cè)子)，但是未能通過利用ES細(xì) 胞的技術(shù)生產(chǎn)發(fā)生種系傳播的轉(zhuǎn)基因靈長類。同時(shí)，稱為透明帶下授精(subzonal insemination)的技術(shù)已經(jīng)被用作人工授精技 術(shù)(參見日本專利公開(kokai)No.H10-185919A(1998))。這種技術(shù)通過將精子注射到圍 卵腔中加速了受精，所述圍卵腔是卵黃膜和透明帶之間的間隙。在這種情況下，例如， 卵細(xì)胞經(jīng)蔗糖溶液預(yù)先處理以擴(kuò)張圍卵腔。這是用于人工地使具有受損的穿透清亮區(qū)能 力的精子進(jìn)入卵的技術(shù)。對(duì)于人工授精，目標(biāo)是使得單個(gè)精子進(jìn)入單個(gè)卵細(xì)胞，但是大 量DNA向一個(gè)細(xì)胞的導(dǎo)入不是目的。利用這種方法并不總能實(shí)現(xiàn)高受精率。隨后，這 被涉及向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)直接注射精子的胞質(zhì)內(nèi)精子注射所替代。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供將基因?qū)朐缙谂咛ヒ陨a(chǎn)利用非人靈長類例如狨猴的人 類疾病模型動(dòng)物的基因轉(zhuǎn)移方法。普通的狨猴(Callithrixjacchus)是一種非常小的、屬于與人類緊密相關(guān)的類人猿
科的新世界猴。普通的狨猴相比大的猴子具有的優(yōu)點(diǎn)在于它們的繁殖力高，以及由于它 們的小尺寸而可以容易地處理。本發(fā)明人認(rèn)為，如果可以通過外源基因?qū)牖蚰繕?biāo)基因 的破壞來生產(chǎn)人類疾病(例如，帕金森氏病和亨廷頓氏病)模型狨猴，則這樣的人類疾病 模型狨猴將顯著地促進(jìn)用于神經(jīng)或其他器官的再生藥物的開發(fā)。本發(fā)明人早先成功生產(chǎn) 了普通狨猴的ES細(xì)胞(W02006/029093)，然后嘗試了但是未能利用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因 的普通狨猴。因此，本發(fā)明人嘗試用其他技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的普通狨猴，進(jìn)行對(duì)于轉(zhuǎn)基因 的普通狨猴的生產(chǎn)所必需的、涉及發(fā)育工程學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)研究，然后深入 地研究了細(xì)胞制備方法等等，以用于轉(zhuǎn)基因普通狨猴的有效生產(chǎn)。具體地，本發(fā)明人建立了用于將基因?qū)肫胀ㄡ鹾锏脑缙谂咛サ幕蜣D(zhuǎn)移方 法，其是用于轉(zhuǎn)基因的普通狨猴生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)。特別地，通常難以提高將外源基因?qū)?入靈長類的早期胚胎的效率。通過導(dǎo)入人類基因的轉(zhuǎn)基因靈長類的成功生產(chǎn)幾乎從未被 報(bào)道。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，外源基因可以通過在利用病毒載體將外源基因?qū)朐缙谂咛r(shí)使 用含有蔗糖的溶液來有效地導(dǎo)入到早期胚胎中。因而，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。本發(fā)明涵蓋以下的[1]到[17]。[1]將外源基因?qū)敕侨遂`長類動(dòng)物的早期胚胎的方法，包括向非人靈長類動(dòng)物 的早期胚胎添加0.2M-0.3M蔗糖溶液來進(jìn)行蔗糖處理，提高圍卵腔的體積，然后將含有 與啟動(dòng)子可操作地連接的人類外源基因的病毒載體注射到所述早期胚胎的圍卵腔中。[2]根據(jù)[1]的方法，其中所述早期胚胎的圍卵腔的體積通過蔗糖處理提高到蔗糖 處理之前所述圍卵腔的體積的1.2到8倍。[3]根據(jù)[1]的方法，其中可被注入到未用蔗糖處理的早期胚胎中的外源基因的數(shù) 量的1.2到8倍數(shù)量的外源基因被注射到早期胚胎中。[4]根據(jù)[1]到[3]的任一項(xiàng)的方法，其中所述靈長類動(dòng)物是狨猴。[5]根據(jù)[1]到[4]的任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒載體選自由慢病毒載體、腺病
4毒載體和腺相關(guān)病毒載體構(gòu)成的組。[6]根據(jù)[5]的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。[7]根據(jù)[1]到[6]的任一項(xiàng)的方法，其中所述早期胚胎是通過自然交配獲得的、 處在原核期和桑椹期之間的著床前胚胎。[8]根據(jù)[1]到[6]的任一項(xiàng)的方法，其中所述早期胚胎是通過人工授精獲得的、 處在原核期和桑椹期之間的胚胎。[9]根據(jù)[1]到[8]的任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒載體以范圍從1.3X IO3CFU到 1.3 X IO5CFU每胚胎的滴度注射。[10]生產(chǎn)其中外源基因可以被傳播到種系的轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法， 其包括通過根據(jù)[1]到[9]的任一項(xiàng)的方法將外源基因?qū)朐缙谂咛ブ?，將含有被?dǎo)入其 中的所述外源基因的所述早期胚胎植入到代理母親中，然后發(fā)育所述胚胎。[11]根據(jù)[10]的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述外源基因是涉及 人類疾病的基因。[12]根據(jù)[11]的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述涉及人類疾病的 基因是突變體α-共核蛋白基因，其是人類帕金森氏病的原因基因，或是突變體亨廷頓 基因，其是人類亨廷頓氏病的原因基因，且所述人類疾病模型靈長類動(dòng)物是人類帕金森 氏病模型靈長類動(dòng)物或人類亨廷頓氏病模型靈長類動(dòng)物。[13]根據(jù)[11]的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述外源基因被用于 敲除涉及人類疾病的、人類基因的內(nèi)源非人靈長類動(dòng)物直向同源基因，且所述轉(zhuǎn)基因的 非人靈長類動(dòng)物是人類疾病模型敲除靈長類動(dòng)物。[14]轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其是通過根據(jù)[11]到[13]的任一項(xiàng)的方法產(chǎn)生的，其 中所述外源轉(zhuǎn)基因具有種系傳播能力。[15]轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其中作為人類帕金森氏病的原因基因的突變體人類 α-共核蛋白基因、或作為人類亨廷頓氏病的原因基因的突變體人類亨廷頓基因被導(dǎo)入其 中，所述基因被傳播到種系。[16]根據(jù)[15]的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其是人類帕金森氏病模型靈長類動(dòng)物或人 類亨廷頓氏病模型靈長類動(dòng)物。[17]根據(jù)[15]或[16]的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其中所述靈長類動(dòng)物是狨猴。本說明書在此合并日本專利申請(qǐng)Νο.2008-017955的說明書和/或附圖的全部?jī)?nèi) 容，其是本申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)聲明的基礎(chǔ)。


圖1是顯示將病毒載體注射到圍卵腔的方法的要點(diǎn)的示意圖。 圖2顯示了照片，其顯示了在0.25Μ蔗糖溶液或Μ2培養(yǎng)基中剛剛注射病毒載體 溶液之后的胚胎。圖3顯示了照片，其顯示了在0.25Μ蔗糖溶液或Μ2培養(yǎng)基中注射病毒載體溶液 之后2.5、3.5禾口 8.5天的胚胎。圖4顯示了照片，其顯示了從轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的成纖維細(xì)胞、血液和胎盤提 取的樣品的Southern印跡分析的結(jié)果。
圖5顯示了出生的轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的照片。圖6顯示了照片，其顯示了在轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的毛根、血液和胎盤中的EGFP轉(zhuǎn)錄。圖7顯示了照片，其顯示了在轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的胎盤中的EGFP表達(dá)。圖8顯示了照片，其顯示了在轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的耳朵中的EGFP表達(dá)。圖9顯示了照片，其顯示了在轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的毛根中的EGFP表達(dá)。圖10顯示了轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的外周血的FACS分析的結(jié)果。圖11顯示了照片，其顯示了來自#666的向上游的精子和IVF胚胎以及來自#584 的天然胚胎和野生型動(dòng)物的RT-PCR分析的結(jié)果。圖12顯示了照片，其顯示了 IVF胚胎的落射熒光顯微分析的亮視野和暗視野。圖13顯示了含有突變體α-共核蛋白基因的慢病毒載體的結(jié)構(gòu)。圖14顯示了照片，其顯示了體外授精(A)和由此發(fā)育的桑椹胚(B和C)。圖15顯示了利用微衛(wèi)星標(biāo)記物的親子測(cè)試的結(jié)果。圖16顯示了照片，其顯示了來自所獲得后代的毛根樣品的RT-PCR的結(jié)果。圖17是所獲得的人類帕金森氏病模型普通狨猴的照片。
具體實(shí)施例方式以下將詳細(xì)解釋本發(fā)明。狨猴例如普通狨猴(Callithrix jacchus)是一種新世界猴，是與人類緊密相關(guān)的非 常小的類人猴子。狨猴具有比大的猴子更高的繁殖效率，并且由于它們的小尺寸而可以 容易地操作。此外，狨猴具有短的妊娠期(約144天)，在12-18個(gè)月內(nèi)到達(dá)性成熟。 雌性狨猴每次分娩有2到3個(gè)后代，在它們的一生中有40到80個(gè)后代。人類疾病模型動(dòng)物，其是靈長類動(dòng)物例如狨猴，可以通過以下來獲得將與涉 及人類疾病的人類基因相應(yīng)的靈長類動(dòng)物的直向同源基因、或涉及人類疾病的人類基因 導(dǎo)入靈長類動(dòng)物中，然后引起該原因基因的蛋白質(zhì)的高水平表達(dá)；或敲除靈長類動(dòng)物的 該直向同源基因或敲入涉及人類疾病的人類基因。這樣的人類疾病的實(shí)例包括帕金森氏病和亨廷頓氏病。帕金森氏病模型動(dòng)物可 以通過將突變體α-共核蛋白基因?qū)腱`長類動(dòng)物來生產(chǎn)。人類野生型α-共核蛋白基 因的核苷酸序列在SEQIDNO 16中示出，α -共核蛋白蛋白質(zhì)的氨基酸序列在SEQID NO 17中示出。突變體α-共核蛋白基因是人類帕金森氏病的原因基因，其中相應(yīng)于 位置30的丙氨酸的、SEQ ID NO 16的核苷酸101到103的核苷酸序列(gca)被突變 成ccc、cct, cca或ccg，以使在α-共核蛋白蛋白質(zhì)的位置30處的丙氨酸被突變?yōu)楦?酸。并且該突變體α-共核蛋白基因的特征在于，相應(yīng)于位置53的丙氨酸的、SEQID NO 16的核苷酸170到172的核苷酸序列(gca)被突變?yōu)閍cu、acc、aca或acg，以使 在α-共核蛋白蛋白質(zhì)的位置53處的丙氨酸被突變成蘇氨酸。在本發(fā)明中，突變體基因 具有核苷酸突變，所述核苷酸突變包括相對(duì)于人類野生型α-共核蛋白基因在α-共核 蛋白蛋白質(zhì)的位置30處的丙氨酸被脯氨酸替換，和在位置53處的丙氨酸被蘇氨酸替換， 所述突變基因被稱為引起帕金森氏病的突變體人類α-共核蛋白基因。例如，在SEQID NO 16中所示的核苷酸序列中，位置101的“g”被突變?yōu)椤癈”，位置170處的“g”被突變?yōu)椤癮”。并且，該突變體α-共核蛋白蛋白質(zhì)包含SEQ ID NO: 17所示的氨基 酸序列，其中在位置30處的丙氨酸被突變?yōu)楦彼?，在位?3處的丙氨酸被突變?yōu)樘K氨 酸(SEQ ID NO: 18)。當(dāng)靈長類動(dòng)物是狨猴時(shí)，人類野生型α -共核蛋白基因的核苷酸 170到核苷酸172的核苷酸序列在SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列中是“gca”，而狨 猴野生型α-共核蛋白基因的是“aca”。野生型狨猴α-共核蛋白蛋白質(zhì)的位置53處 的氨基酸是蘇氨酸，而野生型人類α-共核蛋白蛋白質(zhì)的是丙氨酸。因而，突變體人類 α-共核蛋白蛋白質(zhì)與這一蛋白質(zhì)是相同的，所述蛋白質(zhì)在野生型狨猴α-共核蛋白蛋白 質(zhì)的位置30處的丙氨酸被突變?yōu)楦彼?。可以被?dǎo)入人類帕金森氏病模型狨猴中的突變 體α -共核蛋白基因序列的實(shí)例在SEQ ID NO 19中示出。在SEQ ID NO 19的核苷 酸序列中，相對(duì)于野生型基因，不僅是與α-共核蛋白蛋白質(zhì)的位置30的丙氨酸相應(yīng)的 核苷酸序列(“gca”突變?yōu)椤癱cc”)，而且與位置31的甘氨酸相應(yīng)的核苷酸序列也被 突變(“gga”被突變?yōu)椤癵gg”)。然而，與位置31處的甘氨酸相應(yīng)的核苷酸序列中 的突變不引起氨基酸替換。這個(gè)突變是為了提供突變體基因選擇的方便性。具體地，與 氨基酸30到31相應(yīng)的核苷酸序列是cccggg，從而產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶SmaI的新的識(shí)別 序列(該序列不存在于野生型中)。在突變體選擇時(shí)，其中引入了感興趣的突變的、通過 SmaI消化的克隆，將容易通過克隆的選擇來選擇。例如，通過將包含SEQ ID NO 19中所示核苷酸序列的DNA，或包含相對(duì)于 SEQ ID NO 19中所示核苷酸序列具有一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的刪除、替換或添加的核苷酸 序列的DNA導(dǎo)入靈長類動(dòng)物中，可以獲得呈現(xiàn)人類帕金森氏病的癥狀的人類帕金森氏病 模型靈長類動(dòng)物。在此，術(shù)語“一個(gè)或幾個(gè)”是指1到5個(gè)、優(yōu)選1到4個(gè)、和1到3 個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選1個(gè)或2個(gè)，特別優(yōu)選1個(gè)。此外，根據(jù)利用BLAST (例如，使用默認(rèn) 的，也就是說初始設(shè)置參數(shù))等等計(jì)算的，在此可以被導(dǎo)入的DNA具有與SEQ ID NO: 19中所示核苷酸序列至少95%或更高、優(yōu)選97%或更高、進(jìn)一步優(yōu)選98%或更高、和特 別優(yōu)選99%或更高的同一性；當(dāng)導(dǎo)入所述動(dòng)物時(shí)，可以使得靈長類動(dòng)物呈現(xiàn)人類帕金森 氏病的癥狀。此外，在此可以被導(dǎo)入的DNA在嚴(yán)格條件下會(huì)與SEQ IDNO 19中所示的 核苷酸序列雜交，當(dāng)導(dǎo)入所述動(dòng)物時(shí)可以使得靈長類動(dòng)物呈現(xiàn)人類帕金森氏病的癥狀。 在此，術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指在例如 Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 ed.Vol.1, pp.1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)中描述的 條件。根據(jù)Sambrook etal.，例如，該條件是，利用預(yù)洗滌溶液(5XSSC，0.5% SDS和 1.0mMEDTA(pH8.0))的約55°C和5XSSC的過夜雜交條件。并且，在甚至更高的溫度 進(jìn)行的雜交和洗滌也被包括在該條件中。此時(shí)，洗滌溶液的溫度和鹽濃度可以取決于各 種因素例如探針的長度來適宜地調(diào)整。例如，此處可以采用5XSSC或更低以及20°C或 更高的條件。當(dāng)突變體人類α-共核蛋白基因被導(dǎo)入靈長類動(dòng)物時(shí)，原本存在于靈長類動(dòng)物 中的α-共核蛋白基因和突變體人類α-共核蛋白基因共存在內(nèi)，因而獲得轉(zhuǎn)基因的靈 長類動(dòng)物。突變體人類α-共核蛋白基因的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)引起人類帕金森氏病的癥狀的發(fā) 展。此外，此時(shí)，原本存在于靈長類動(dòng)物中的α--共核蛋白可以通過同源重組等等而被 突變體人類α-共核蛋白基因所替代。同樣，亨廷頓氏病模型靈長類動(dòng)物可以通過將突變體導(dǎo)入靈長類動(dòng)物來生產(chǎn)，所述突變體中從37到876的CAG序列的重復(fù)序列存在于人類亨廷頓基因(HTT基因)的
第一外顯子中。通過該人類疾病的原因基因向靈長類動(dòng)物的導(dǎo)入，轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物將發(fā)展 上述人類疾病的病理狀況。例如，在帕金森氏病模型靈長類動(dòng)物的情況中，它將在出生 后1到數(shù)年內(nèi)發(fā)生癥狀，例如，顫抖、運(yùn)動(dòng)不能、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)反射的損傷和神經(jīng)細(xì)胞 中的多巴胺降低。同樣在亨廷頓氏病的情況中，動(dòng)物將發(fā)生癥狀，例如基底神經(jīng)節(jié)萎 縮、額葉萎縮、癡呆癥狀和癲癇癥癥狀。取決于疾病，動(dòng)物可能需要時(shí)間來發(fā)生這些癥 狀。在本發(fā)明中，處于尚未呈現(xiàn)這些癥狀的狀態(tài)下、通過導(dǎo)入原因基因而生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因 的靈長類動(dòng)物也被稱作疾病模型動(dòng)物。在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物中，其中導(dǎo)入了外源基因的轉(zhuǎn)基因被傳播到種 系，然后通過種系遺傳給后代。具體地，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物具有種系傳播能 力，使得在它的后代中觀察到轉(zhuǎn)基因表達(dá)，從而人類疾病模型靈長類動(dòng)物的后代也可以 用作人類疾病模型靈長類動(dòng)物。例如，通過從初代轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物采集生殖細(xì)胞 (卵子或精子)，并用從正常的靈長類動(dòng)物采集的生殖細(xì)胞對(duì)其授精，發(fā)育受精卵，然后 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的存在，可以確認(rèn)種系傳播。通過以下步驟生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物。因而，只有當(dāng)以下步驟的每一個(gè)被優(yōu) 化并組合地進(jìn)行這些步驟時(shí)，才可以高效地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物(a)采集和回收靈長類動(dòng)物的受精卵的步驟，或采集未受精的卵并進(jìn)行其體外受 精的步驟；(b)通過將外源基因?qū)朐缙谂咛磉M(jìn)行遺傳操作的步驟；(c)保存受精卵或早期胚胎的步驟；和(d)將早期胚胎植入雌性靈長類代理母親來引起其發(fā)育的步驟。上述步驟的順序是復(fù)雜的，且步驟(a)到(d)并不總是按該順序進(jìn)行。以下，分別詳細(xì)地描述這些步驟。屬于靈長類的狨猴主要用作以下說明中的實(shí) 例。然而，本發(fā)明的方法對(duì)具有小體積的早期胚胎圍卵腔的哺乳動(dòng)物，例如其他靈長類 或牛是適用的。(1)采集狨猴的未受精的卵的步驟未受精的卵可以通過刺激狨猴的卵巢來采集。刺激卵巢的方法的實(shí)例是下述方 法，其涉及將促濾泡激素(FSH)施用給性成熟的雌性狨猴、然后施用絨毛膜促性腺激素 (CG)的方法。對(duì)于FSH和CG，可以使用狨猴FSH和CG，也可以使用屬于其他靈長 類的物種、包括人類的FSH和CG。同樣，也可以使用天然的激素，也可以使用重組激 素。鑒于獲取的容易性，可以適宜地使用人類重組FSH(hFSH)或CG(hCG)。要施用的 FSH的濃度為從100IU/ml到1000IU/ml，優(yōu)選從100IU/ml到750IU/ml，進(jìn)一步優(yōu)選從 100IU/ml到500IU/ml。FSH的劑量為從IOIU/動(dòng)物到IOOIU/動(dòng)物。FSH連續(xù)地施用 6到15天，優(yōu)選7到15天，更優(yōu)選8到15天，進(jìn)一步更優(yōu)選9到15天，再進(jìn)一步更優(yōu) 選10到15天，特別優(yōu)選10或11天。對(duì)于給藥途徑，優(yōu)選肌肉內(nèi)給藥。在上述周期的期間的每一天施用FSH之后，施用CG。要施用的CG的濃度為 從 100IU/ml 到 1000IU/ml，優(yōu)選從 100IU/ml 到 750IU/ml，進(jìn)一步優(yōu)選從 100IU/ml 到 500IU/ml。CG的劑量為從IOIU/動(dòng)物到IOOIU/動(dòng)物。在FSH的施用之后，施用CG 7到21天，優(yōu)選10到15天，進(jìn)一步優(yōu)選12天。對(duì)于給藥途徑，優(yōu)選肌肉內(nèi)給藥。在CG施用后15到30、優(yōu)選20到25、進(jìn)一步優(yōu)選21或22小時(shí)之后，采集濾 泡卵細(xì)胞。例如，濾泡卵細(xì)胞可以通過利用外科手術(shù)技術(shù)的抽吸來采集。(2)采集的未受精的卵的體外成熟采集的卵細(xì)胞培養(yǎng)幾個(gè)小時(shí)到幾天，優(yōu)選在適合于靈長類卵細(xì)胞成熟的培養(yǎng)基 中過夜，以便引起體外成熟(IVM)。對(duì)于用于體外成熟的培養(yǎng)基，可以使用Waymouth 培養(yǎng)基(Invitrogen)、IVM培養(yǎng)基(Medicult)等等?？紤]到在體外受精之后的胚胎發(fā)育 率，IVM培養(yǎng)基是期望的。由此獲得的成熟卵細(xì)胞通過體外受精而用精子受精。受精 卵培養(yǎng)在ISMl培養(yǎng)基或ISM2培養(yǎng)基中，以使卵發(fā)育成為早期胚胎。在此，術(shù)語“早期 胚胎”是指處于原核期和胚泡期之間的胚胎。為了通過導(dǎo)入外源基因來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的狨 猴，原核期(PN期到2PN期)和桑椹期之間的胚胎是優(yōu)選的。(3)狨猴早期胚胎的保存如果必要，由此獲得的狨猴早期胚胎被低溫保存。此時(shí)，優(yōu)選使用用于哺乳動(dòng)物早期胚胎或哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞(日本專利公開 (Kokai)NO.2007-105013A)的基于磷酸鹽緩沖液的玻璃化溶液(僅含有10% (ν/ν)到15% (v/V)的丙二醇作為多元醇)。該玻璃化溶液是基于磷酸鹽緩沖液的防腐溶液。這樣的防 腐溶液的實(shí)例包括通過添加丙二醇到改良的磷酸鹽緩沖液(PBl)而制備的ΡΒ10，和通過 添加丙二醇、乙二醇、Percoll (注冊(cè)商標(biāo))和蔗糖到PBl而制備的PEPeS。PlO通過添加 5% (ν/ν)到 15% (ν/ν) > 優(yōu)選 10% (ν/ν)到 15% (ν/ν)、特別優(yōu)選 10% (ν/ν)丙二醇到 PBl而制備。同樣，PEPeS通過添加5% (ν/ν)到15% (ν/ν)、優(yōu)選10% (ν/ν)到15% (ν/ν),以及特別優(yōu)選 10% (ν/ν)的丙二醇，25% (v/v) ilj 35% (ν/ν) > 優(yōu)選 30% (ν/ν) 的乙二醇，15% (v/v) IlJ 25% (ν/ν) > 優(yōu)選 20% (ν/ν)的 Percoll(注冊(cè)商標(biāo))和 0.2Μ 到 0.5Μ、優(yōu)選0.3Μ的蔗糖到PBl而制備。狨猴早期胚胎浸入PlO玻璃化溶液中1到20分 鐘，優(yōu)選3到15分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選5到10分鐘。浸入可以在室溫下(22°C到25°C )進(jìn) 行。隨后，通過浸入來預(yù)處理的胚胎與PlO玻璃化溶液一起添加到低溫保存試管中，然 后在0°C到5°C，優(yōu)選在0°C冷卻幾十秒到幾分鐘，優(yōu)選30秒到2分鐘，進(jìn)一步優(yōu)選1分 鐘。隨后，PlO中的胚胎置于PEPeS玻璃化溶液中，然后在_196°C或更低的低溫下冷 凍。這樣低溫保存的早期胚胎如下處理。例如，含有冷凍胚胎的冷凍試管從液氮中取 出，置于室溫下10秒到60秒，優(yōu)選約30秒。然后注射被保持在室溫的、數(shù)量是試管的 容量的5到10倍的用于解凍的溶液，用于解凍。隨后，胚胎用解凍用溶液洗滌。這種 用于解凍的溶液沒有限制，例如，可以使用通過添加0.2M到0.5M以及優(yōu)選0.3M蔗糖到 上述BPl而制備的溶液。(4)通過遺傳操作進(jìn)行的狨猴早期胚胎的轉(zhuǎn)化遺傳操作通過將涉及人類疾病的基因?qū)脶鹾镌缙谂咛セ蚯贸鹾镏?涉及人 類疾病)的人類基因的直向同源基因來進(jìn)行。在本發(fā)明中，其中已經(jīng)導(dǎo)入了人類基因的 狨猴和其中基因被敲除的狨猴被稱為轉(zhuǎn)基因的狨猴。要被導(dǎo)入的基因或要被敲除的基因 取決于疾病類型來確定。當(dāng)導(dǎo)入涉及人類疾病的基因時(shí)，所述基因可以通過同源重組等 等用相關(guān)基因的狨猴直向同源基因替代?；?qū)牒突蚯贸梢酝ㄟ^已知的遺傳工程技術(shù)來進(jìn)行。
要被導(dǎo)入狨猴中的DNA連接到可以在狨猴細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子。可以被表達(dá)的 這樣的啟動(dòng)子的實(shí)例包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞衍生的啟動(dòng)子，例如，CAG(雞β-肌動(dòng)蛋白)啟 動(dòng)子、PGK(磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子和EFla (延伸因子Ια)啟動(dòng)子，和病毒啟動(dòng)子， 例如，巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、猿猴病毒40(SV40)啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子和腺 病毒啟動(dòng)子。在這些啟動(dòng)子中，優(yōu)選CAG啟動(dòng)子和CMV啟動(dòng)子。同樣，也可以整合增 強(qiáng)基因表達(dá)的增強(qiáng)子。要被導(dǎo)入的基因和啟動(dòng)子可操作地連接，然后導(dǎo)入載體中。在此 可以使用任何載體，只要它可以誘導(dǎo)動(dòng)物中轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)表達(dá)。其中啟動(dòng)子被預(yù)先整合 的載體可也可以在此使用。作為載體，病毒載體，優(yōu)選例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載 體或腺相關(guān)病毒載體。在載體中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，特別是慢病毒載體是優(yōu)選的。慢病 毒的實(shí)例是人類免疫缺陷病毒(HIV)。例如，SIN載體(SIN第三代VSV-G偽型人類免 疫缺陷病毒載體(第三代慢病毒載體)(Miyoshi，H.et al.，J Virol 72，8150-7 (1998))可 以被適宜地使用。病毒載體可以注射到早期胚胎的圍卵腔中或胚泡的胚囊腔中。作為早期胚胎， 可以使用通過人工授精獲得的胚胎或通過自然交配受精獲得的著床前胚胎。要注射的病 毒載體優(yōu)選具有高滴度。例如，具有1.3X IO3CFU到1.3X IO5CFU的滴度的載體理想地 被注射到每個(gè)胚胎中。作為早期胚胎，處在原核期(PN期到2PN期)和桑椹期之間的胚 胎是優(yōu)選的。此時(shí)，注射通過將早期胚胎置于0.2M到0.3M、優(yōu)選0.25 M的蔗糖中以引 起細(xì)胞質(zhì)暫時(shí)皺縮來進(jìn)行。這使得圍卵腔的體積擴(kuò)大，以便注射更大數(shù)量的病毒溶液。 結(jié)果，許多外源基因被導(dǎo)入早期胚胎中，使得轉(zhuǎn)化容易地發(fā)生。當(dāng)使用靈長類動(dòng)物的早 期胚胎時(shí)，圍卵腔的體積被擴(kuò)大約1.2-10倍，優(yōu)選約1.2-8倍，進(jìn)一步優(yōu)選約1.3-8倍， 再進(jìn)一步優(yōu)選約1.5-8倍，或約1.2-6.5倍，優(yōu)選的1.3-6.5倍。作為一個(gè)實(shí)例，在原核 期的狨猴胚胎的圍卵腔的體積是約31.5pl，其可以通過蔗糖處理提高到約231pl，其是原 始體積的約7.3倍。具體地，在本發(fā)明的方法中，靈長類動(dòng)物的早期胚胎的圍卵腔的體 積通過蔗糖處理提高到未用蔗糖處理的圍卵腔的體積的約1.2-10倍，優(yōu)選約1.3-8倍，進(jìn) 一步優(yōu)選約1.5-8倍，再進(jìn)一步優(yōu)選約2-8倍。圍卯腔的提高的體積從IOOpl到500pl， 優(yōu)選從150pl到400pl，進(jìn)一步優(yōu)選從200μ1到300μ1。結(jié)果，當(dāng)使用同時(shí)構(gòu)建的含有外 源基因的載體時(shí)，可以被導(dǎo)入到用蔗糖處理的早期胚胎中的基因的數(shù)量，是可以被導(dǎo)入 到未用蔗糖處理的早期胚胎的基因的數(shù)量的約1.2-10倍，優(yōu)選約1.3-8倍，進(jìn)一步優(yōu)選約 1.5-8倍，再進(jìn)一步優(yōu)選約2-8倍。這時(shí)，非常高的蔗糖濃度對(duì)于胚胎是有毒的。蔗糖 理想地在0.3Μ或更低的濃度下使用。當(dāng)基因被導(dǎo)入本發(fā)明的早期胚胎中時(shí)，使用蔗糖來處理早期胚胎的方法適合于 圍卵腔太小而不能注射足夠數(shù)量的病毒載體溶液的哺乳動(dòng)物。具有這樣的小的胚胎圍卵 腔的哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括屬于靈長類和牛類的哺乳動(dòng)物。敲除狨猴可以通過已知的方法例如同源重組來生產(chǎn)。同源重組是一種細(xì)胞內(nèi)的 現(xiàn)象，通過這種現(xiàn)象，兩個(gè)DNA分子通過相同的核苷酸序列經(jīng)歷同源重組。在同源重 組中，轉(zhuǎn)移載體通過連接啟動(dòng)子和外源基因來構(gòu)建，使得目標(biāo)基因位點(diǎn)的序列在中間被 分開。載體被導(dǎo)入早期胚胎中，然后在細(xì)胞的基因和轉(zhuǎn)移載體上相同序列部分之間發(fā)生 重組。因而被夾持的啟動(dòng)子和外源基因被整合到細(xì)胞的基因組中，目標(biāo)基因被分開而 失去其功能，因而基因被敲除。這樣的轉(zhuǎn)移載體可以根據(jù)目標(biāo)基因的核苷酸序列信息
10來設(shè)計(jì)和構(gòu)建。要被破壞的基因的同源重組利用轉(zhuǎn)移載體來進(jìn)行。這樣的轉(zhuǎn)移載體可 以根據(jù)在 Ed.，D.M.Glover et al.，Ikunoshin Kato，Translation Supervisor, DNA cloning 4-mammalsian system- (2nd Edition) TaKaRa等等中描述的方法來構(gòu)建。上述各種病毒載體
可以在此使用。慢病毒載體是優(yōu)選的。同樣，利用使用重組酶和重組酶的識(shí)別位點(diǎn)的 方法，目標(biāo)基因可以通過同源重組來敲除。根據(jù)該方法，其中要被敲除的目標(biāo)基因側(cè)翼 是上述重組酶識(shí)別位點(diǎn)核苷酸序列的DNA，以及其中啟動(dòng)子連接到上述重組酶的上游的 DNA,被導(dǎo)入狨猴中。當(dāng)重組酶被表達(dá)時(shí)，側(cè)翼是重組酶識(shí)別位點(diǎn)的目標(biāo)基因被切下， 失去它的功能。這樣的方法的實(shí)例是利用Cre-IoxP系統(tǒng)的方法。Cre-IoxP系統(tǒng)在Sauer， B.etal.，Proc.Natl.Acad, Sci.U.S.A.，85 5166-5170, 1988 ； Gu, H., et al., Cell, 73，1155-1164，1993等等中描述。根據(jù)這些描述，狨猴早期胚胎可以通過利用Cre-IoxP 系統(tǒng)敲除目標(biāo)基因來生產(chǎn)。(5)遺傳操縱的狨猴早期胚胎向狨猴代理母親中的植入向代理母親中的植入通過已知的方法植入到代理母親的子宮內(nèi)來進(jìn)行。此時(shí)，作為代理母親的接受者狨猴、以及作為胚胎的供體的供體狨猴的性周期 (排卵周期)預(yù)先被同步。性周期同步可以通過施用性激素例如前列腺素來進(jìn)行。將參考以下實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1利用激素試劑的卵巢刺激的研究利用狨猴以涉及發(fā)育工程學(xué)的基礎(chǔ)研究形式，研究普通狨猴的卵巢刺激。人類重組促濾泡激素(hFSH)以50IU/狨猴向性成熟的雌性狨猴連續(xù)地肌內(nèi)注射 施用5天、10天和11天。在開始hFSH施用后的第12天，以75IU/狨猴肌內(nèi)注射施用 人絨毛膜促性腺激素ChCG)。在hCG施用后21到37小時(shí)，將濾泡卵細(xì)胞通過外科技術(shù) 吸出，然后卵細(xì)胞使用Waymcmth培養(yǎng)基(Invitrogen)在5% CO2下培養(yǎng)過夜。對(duì)卵細(xì)胞 進(jìn)行體外成熟(IVM)培養(yǎng)，然后進(jìn)行體外受精(IVF)。從而檢測(cè)卵巢刺激。結(jié)果，5天、10天和11天的FSH施用分別產(chǎn)生了 9.0士5.7、12.8士6.7和 14.7士8.1的采集的卵細(xì)胞的平均數(shù)。沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性差異。然而，觀察到 了下述傾向，即hFSH施用期越長，獲得的卵細(xì)胞的數(shù)目越高。并且，IVM率分別是 30.2%, 84.5%和67.4%。觀察到經(jīng)歷10和11天的hFSH施用的組的IVM率顯著(ρ
<0.01)更高于經(jīng)歷5天hFSH施用的組的。在IVF率中也觀察到類似的顯著差異(ρ
<0.01) (0%, 35%和 40% )。隨后，研究了卵細(xì)胞暴露于人絨毛膜促性腺激素(hCG)的時(shí)間，該人絨毛膜促 性腺激素誘導(dǎo)卵細(xì)胞成熟的開始。在hCG施用之后21到22小時(shí)、23到25小時(shí)和31到 37小時(shí)采集卵細(xì)胞。研究采集的卵細(xì)胞的數(shù)量、IVM率和體外繁殖力。結(jié)果，采集的 卵細(xì)胞的平均數(shù)分別是20.4士 12.8、10.67士4.0禾口 3.67士 1.5。 當(dāng)在hCG施用之后21到 22小時(shí)采集卵細(xì)胞時(shí)，采集的卵細(xì)胞的數(shù)量是顯著地高的(P <0.01)。IVM率分別是 72%, 54.3%和100%。其證實(shí)，在hCG施用之后31到37小時(shí)采集的卵細(xì)胞引起了顯 著地高的(P < 0.05)IVM率。并且，體外受精率分別是36.3%、22.8%和76.7%。根據(jù)上述結(jié)果揭示，當(dāng)考慮到采集的卵細(xì)胞的數(shù)量、卵細(xì)胞成熟率和體外成熟 率之間的平衡時(shí)，hFSH施用的合適的持續(xù)時(shí)間是10天或11天，暴露于hCG的適合的時(shí) 間是21到22小時(shí)。
實(shí)施例2體外受精的研究體外受精需要濾泡卵細(xì)胞采集、體外卵細(xì)胞成熟和體外受精的步驟。因此， 研究體外成熟培養(yǎng)基，作為體外受精方法的研究的第一階段。被報(bào)道適合于猴卵細(xì)胞 成熟的Waymouth培養(yǎng)基，與用于人類受精力處理的IVM培養(yǎng)基(Medicult)比較。結(jié) 果，在IVM培養(yǎng)基中的卵細(xì)胞成熟率(39.7%)顯著地低于Waymouth培養(yǎng)基中的成 熟率(61.5%)，但是在IVM培養(yǎng)基中成熟的卵細(xì)胞的體外受精之后發(fā)育成胚泡的比率 (22.2% )顯著地高于在Waymouth培養(yǎng)基中成熟的情況(4.3% )。上述結(jié)果揭示，更好的是，在IVM培養(yǎng)基中使經(jīng)歷體外受精的胚胎成熟，然后 將它們植入到子宮中。實(shí)施例3將普通狨猴早期胚胎植入代理子宮中的條件的研究通過體外受精獲得的受精卵(257個(gè))和49個(gè)通過自然交配受精獲得的受精卵植 入到子宮和輸卵管中。研究這些受精卵的發(fā)育潛力和其植入方法。作為通過體外受精獲 得的受精卵的植入的結(jié)果，獲得了 3個(gè)后代，出生率是1.2%。另一方面，對(duì)于通過自然 交配獲得的受精卵的植入來說，獲得了 9個(gè)后代，出生率是18.4%。對(duì)于通過自然交配 獲得的卵來說，出生率是顯著地高的(P <0.01)。此外，就出生率而言比較了受精卵的 著床位置，包括輸卵管(η = 140)和子宮(η = 166)。結(jié)果，對(duì)于植入到輸卵管來說，發(fā) 現(xiàn)出生率是2.1%，對(duì)于植入到子宮中來說，發(fā)現(xiàn)出生率是5.4%。沒有觀察到取決于著 床位置的出生率的顯著差異。實(shí)施例4普通狨猴配子和早期胚胎的低溫保存的研究普通狨猴早期胚胎的保存尚未被充分地研究。因此，研究了在桑椹期和胚泡期 之間的早期胚胎的保存。這些普通狨猴胚胎(η = 6)使用玻璃化溶液(由本發(fā)明人開發(fā)； 日本專利公開(Kokai)ΝΟ.2007-105013Α)來保存。胚胎在液氮中保存12到20天，然后 用加溫溶液來加溫。結(jié)果，確認(rèn)了所有胚胎發(fā)育成擴(kuò)大的胚泡。根據(jù)結(jié)果揭示，這種方 法也適合于普通狨猴早期胚胎。實(shí)施例5慢病毒載體溶液的注射的研究PN(原核)胚胎置于0.25Μ蔗糖或不含蔗糖的Μ2培養(yǎng)基中。然后將其中已經(jīng) 導(dǎo)入EGFP的慢病毒載體注射到圍卵腔中。在胚泡期的胚胎的情況中，病毒注射到囊胚 腔中。向胚胎中的注射使用DNA注射針頭來進(jìn)行。使用CAG啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、 PGK啟動(dòng)子或EFl α啟動(dòng)子。圖1顯示了將慢病毒載體導(dǎo)入圍卵腔的方法的要點(diǎn)。圖2顯示了剛剛注射慢病毒載體溶液之后的PN胚胎的照片。圖2Α顯示了使用 0.25Μ蔗糖溶液的胚胎。圖2Β顯示了使用Μ2培養(yǎng)基的胚胎。如圖2中所示，在PN胚 胎的整個(gè)圍卵腔中觀察到病毒溶液，所述PN胚胎的慢病毒載體溶液的注射已經(jīng)在蔗糖溶 液中進(jìn)行。相比之下，僅在PN胚胎的注射部分的外周部中觀察到慢病毒載體，所述PN 胚胎的慢病毒載體的注射已經(jīng)在Μ2培養(yǎng)基中進(jìn)行。圖3顯示了在慢病毒溶液注射2.5、3.5和8.5天后的PN胚胎的照片。圖3Α顯 示了使用了 0.25Μ蔗糖溶液的PN胚胎，圖3Β顯示了使用Μ2培養(yǎng)基的PN胚胎。表1顯示了使用蔗糖的情況下的基因表達(dá)率和沒有使用蔗糖的情況下的基因表 達(dá)率。如表1中所示，GFP表達(dá)效力在使用蔗糖的情況中是顯著地高的。
表1Sue+ Suc-慢病毒注射的卵 44 76表達(dá)GFP 的卵 43 31GFP 表達(dá)率97.7 40.8當(dāng)蔗糖濃度過度地高時(shí)，觀察到對(duì)胚胎的毒性。實(shí)施例6向普通狨猴早期胚胎中的基因轉(zhuǎn)移A.方法(1)通過利用激素試劑的卵巢刺激采集非受精卵使用兩歲或更大的狨猴。人類重組促濾泡激素(hFSH)以50IU/動(dòng)物向性成熟的雌性狨猴連續(xù)肌內(nèi)注射施 用11天。在開始hFSH施用后12天，人絨毛膜促性腺激素(hCG)以75IU/動(dòng)物肌內(nèi)注 射施用。在hCG施用后21到37小時(shí)，濾泡卵細(xì)胞通過利用2.9ml注射器和23號(hào)注射針 頭通過外科技術(shù)吸出。濾泡卵細(xì)胞吸出到含有10% FBS的Waymouth培養(yǎng)基中。卵細(xì) 胞從培養(yǎng)基中采集，洗滌兩次，然后在5%C02*38°C的條件下利用Waymouth培養(yǎng)基培 養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)之后僅采集成熟的卵細(xì)胞(中期II)，然后用于體外受精(IV)。(2)精液采集和精子的制備狨猴精液利用Ferti Care personel 振動(dòng)器(Kuederling，Let al.，Am J Primatol 52,
149-54(2000))采集。精液采集在TYH培養(yǎng)基中，然后用3ml TYH培養(yǎng)基洗滌兩次。 添加TYH培養(yǎng)基(300 μ 1)，然后在30°C在CO2孵育器中放置10分鐘，以使精子游動(dòng)。(3)體外受精(IVF)用透明質(zhì)酸酶處理的卵細(xì)胞用TYH培養(yǎng)基洗滌，然后以液滴的形式分配它的 70 μ L 70 μ 1液滴含有最多10個(gè)卵細(xì)胞。上述方法制備的精子(10 μ 1)添加到液滴中。 此時(shí)最終的精子密度是5Χ IO9個(gè)精子/ml。在添加精子之后26到30小時(shí)，采集卵細(xì) 胞，然后用ISMl培養(yǎng)基(Medicult)洗滌。受精卵培養(yǎng)在ISMl培養(yǎng)基中48小時(shí)，轉(zhuǎn)移 到含有小鼠胎兒的飼養(yǎng)細(xì)胞的IISM2培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)。(4)胚胎采集和胚胎植入作為前列腺素F2α 類似物的氯前列醇(Estramate，Takeda Schering-Plough K.K.) 在黃體期后第10天以0.75mg/動(dòng)物施用給供體和接受者普通狨猴，從而同步排卵周期 (Summers, P.M.etal.，JReprod Fertil 73, 133-8(1985))。血漿樣品(0.1ml)在氯前列醇
施用之后第2、9、11和13天經(jīng)由股靜脈采集。根據(jù)利用RIA的血漿黃體酮水平的測(cè)量， 確定排卵日期。血漿黃體酮水平達(dá)到lOng/ml的日子被確定是排卵日期(第0天)。在 排卵日期后第7到10天，供體狨猴被麻醉，從該普通狨猴采集卵。子宮頸和兩根輸卵管 通過近中央剖腹術(shù)來取出，然后夾住。范圍從末端(鄰近于子宮)到子宮頸的子宮腔用 含有10% FBS(胎兒牛血清)的2.5mL的DMEM(Dalbecco' s_改良的Eagle' s培養(yǎng)基) 沖洗。用于沖洗的培養(yǎng)基使用置于子宮腔中的23號(hào)注射針頭從子宮的底部采集。在胚 胎采集后的第4天，進(jìn)一步施用氯前列醇。利用DPC黃體酮試劑盒(Diagnostic Products Corp.)測(cè)定血漿孕激素濃度。具有與供體的排卵周期同步的排卵周期的接受者普通狨猴被麻醉，然后通過近中央剖腹術(shù)取出子宮和卵巢。23號(hào)注射針經(jīng)由子宮腔從子宮頸插入到末端(鄰近子宮)。 利用玻璃毛細(xì)管吸移管將一(1)到3個(gè)胚胎植入到子宮腔中。在胚胎植入之后，通過每 周一次測(cè)量血漿黃體酮水平來檢測(cè)每個(gè)接受者的妊娠的存在或不存在，直到可通過腹部 的子宮觸診來監(jiān)視妊娠。(5)慢病毒載體的制備和導(dǎo)入人類胚腎293T細(xì)胞在補(bǔ)充有10%熱滅活的胎牛血清、100單位/ml青霉素、 100 μ g/ml鏈霉素和250ng/ml兩性霉素B的DMEM中生長。SIN載體系統(tǒng)被用于外 源DNA向CMES中的導(dǎo)入。構(gòu)建具有四種不同的啟動(dòng)子(CAG、CMV、EF-IafP PGK啟動(dòng)子)的、表達(dá)EGFP(增強(qiáng)綠色熒光蛋白質(zhì))的三種載體。載體分別被稱為 CAG-EGFP、CMV-EGFP、EFl a-EGFP 禾口 PGK-EGFP。利用Fugene 6轉(zhuǎn)染試劑，通過載體和包裝構(gòu)建體與VSV-G和Rev表達(dá)構(gòu)建體 向293T細(xì)胞中的共轉(zhuǎn)染構(gòu)建慢病毒載體。在轉(zhuǎn)染后第4天，采集培養(yǎng)基中含有的病毒顆 粒，通過0.22 μ m過濾器過濾，然后經(jīng)歷在25,OOOrpm和4°C下的離心4小時(shí)。病毒沉淀 物在ISM2培養(yǎng)基(Medicult)中與病毒沉淀物體積1/1000的原始的慢病毒載體上清液懸浮。通過將病毒溶液注射到普通狨猴胚胎中來導(dǎo)入慢病毒。將2PN(2原核)-到桑椹 期胚胎置于0.25M蔗糖中，然后將病毒注射到圍卵腔中。在胚泡期胚胎的情況中，病毒 注射到囊胚腔中。向胚胎中的注射總是使用微量注射器(Eppendorf femtojet express)和微型機(jī)械手 (Narishige微型機(jī)械手)來進(jìn)行。(6) RT-PCRPoly A+ RNA 利用 Quick Prep Micro mRNA 純化試劑盒(GE health care)分離 自毛根、小的皮膚區(qū)域和紅血球。RNA樣品利用Improm-II Reverse Transcription系統(tǒng) (Promega)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。每種PolyA+RNA樣品的一半與逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)用于第一鏈cDNA 合成，其剩余一半作為陰性對(duì)照樣品沒有逆轉(zhuǎn)錄酶地反應(yīng)?？俁NA利用RNA II試劑盒 (MACHEREY-NAGEL)分離自胎盤。對(duì)數(shù)量從IOOng到1 μ g的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。利用1/40-3/20 cDNA合成反應(yīng)混合物作為模板進(jìn)行PCR。十(10) μ 1的PCR混 合物含有 1 X PCR緩沖液(IOmM Tris-HCl (ρΗ 9.0)、1.5mM MgCl2 和 50mM KCl)、0.2mM dNTPs、0.2 μ M弓丨物和1.OUTaq聚合酶。對(duì)于EGFP基因表達(dá)的檢測(cè)，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的 PCR,每個(gè)循環(huán)由下述組成在94°C變性30秒，在62°C退火30秒和在72°C延伸30秒。 在此使用的引物序列如下所示。5，-GCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGC-3‘ (EGFP5-5,正向引物) (SEQ ID NO 1)5，-TCACGAACTCCAGCAGGACCAT-3 ‘ (EGFP 3-1,反向引物)(SEQ ID NO: 2)對(duì)于β-肌動(dòng)蛋白表達(dá)的檢測(cè)，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR，每個(gè)循環(huán)由下述組成 在94°C變性30秒，在58°C退火30秒和在72°C延伸30秒。在此使用的引物序列如下所不。5，-TCCTGACCCTGAAGTACCCC-3 ‘ (β-actinOOl，正向引物)(SEQ IDNO: 3)5，-GTGGTGGTTGAAGCTGTAGCC-3 ‘ ( β -actin 002，反向引物)(SEQ ID
NO 4)(7)免疫組織化學(xué)分析組織包埋在OCT化合物中，在液氮中冷凍，然后在-80°C保存直到分析。從團(tuán) 塊制備五(5)μιη切片，然后使用4%多聚甲醛在4°C固定30分鐘。內(nèi)源的過氧化物酶 活性通過利用0.03%過氧化氫溶液在室溫下處理30分鐘來抑制。切片用水洗滌5分鐘， 然后用PBS洗滌2分鐘。載玻片使用10 %山羊血清(Nichirei Corporation)在室溫下進(jìn)行 封閉處理10分鐘，然后與兔抗Rv抗體在4°C過夜反應(yīng)。在用PBS洗滌3次之后，載玻 片與生物素化的二級(jí)抗體和Simple Stain Mouse MAX PO (Nichirei Corporation)在室溫下反 應(yīng)30分鐘，隨后用PBS洗滌3次。從而利用DAB (3，3，- 二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽)辣根 過氧化酶復(fù)合物檢測(cè)結(jié)合的單克隆抗體的位置。隨后，樣品用HE(蘇木色素和曙紅)染 色，然后包埋。(8) FACS 分析外周血樣品在2000rpm進(jìn)行離心5分鐘，收集全血細(xì)胞，然后用Iml的PBS洗 滌。全血細(xì)胞懸浮在0.13M NH4Cl中，然后在2000rpm進(jìn)行離心5分鐘。生成物用Iml PBS再次洗滌。沉淀在冰上與小鼠IgGl抗狨猴CD45和6C9抗體孵育30分鐘。樣品用 PBS洗滌，然后與作為二級(jí)抗體的APC標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體混合?；旌衔镌诒戏跤?30分鐘。在與二級(jí)抗體孵育之后，樣品用PBS洗滌，然后懸浮在200μ1的PI溶液中。 然后進(jìn)行FACS分析。(9) Southern 印跡分析利用DNeasy Blood and Tissue試劑盒(Qiagen)從皮膚、全血細(xì)胞和胎盤成纖維細(xì) 胞提取基因組DNA。其中已經(jīng)注射了 CAG-EGFP的動(dòng)物的基因組DNA用Bam HI消化。 其中已經(jīng)注射了 CMV-EGFP的動(dòng)物的基因組DNA用EcoR I消化。利用DIG系統(tǒng)產(chǎn)品 (Roche)進(jìn)行Southern印跡分析。具體地，5 μ g的基因組DNA在0.8%瓊脂糖凝膠上使 用25伏特進(jìn)行過夜電泳，生成物轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。CMV-EGFP用EcoR I消 化，然后利用PCR DIG探針合成試劑盒以DIG標(biāo)記。在DIG Easy Hyb Granules (Roche) 中，膜與DIG標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交。在洗滌膜之后，雜交的探針浸入封閉溶液中30分 鐘，用于與抗DIG堿性磷酸酶共軛物反應(yīng)。在洗滌膜之后，利用雜交的CSPD探針進(jìn)行 檢測(cè)，然后將生成物暴露于X射線底片。(10)胎盤和后代中轉(zhuǎn)基因的測(cè)定采集成熟動(dòng)物的小的胎盤切片和耳朵皮膚樣品，然后進(jìn)行蛋白酶K處理?；?組 DNA 使用 Mag Extractor System MFX-9600 Magnia R Plus (Toyobo Co.，Ltd.)提取。此 外，基因組 DNA 使用 DNeasy Blood & Tissue 試劑盒(Qiagen)禾Π QIAmp DNA Micro 試劑 盒(Qiagen)分別從成熟動(dòng)物的全血樣品和嬰兒的毛根提取。EGFP轉(zhuǎn)基因使用以下PCR引物組檢測(cè)。GFPF 1 CTGGTCGAGCTGGACGGCGACG (SEQ ID NO 5)GFPR 1 CACGAACTCCAGCAGGACCATG (SEQ ID NO 6)作為內(nèi)源對(duì)照基因的β-肌動(dòng)蛋白基因使用以下PCR引物組檢測(cè)。
Comm- β -ActinF TGTAGGTACTAACACTGGCTCGTGTGACAA (SEQ ID NO 7)Comm- β -ActinR GGGTGTTGAAGGTCTCAAACATGATCTGTA (SEQ ID NO 8)EGFP的基因轉(zhuǎn)移效力與β-肌動(dòng)蛋白是幾乎相同的。因此，通過比較性的CT 方法，禾1J 用 ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (Applera Corporation, Applied Biosystems)禾口 SYBR Premix Ex TaqTM 的 Master Mix (Perfect Real Time， Takara Bio Inc) 來進(jìn)行EGFP轉(zhuǎn)基因的相對(duì)測(cè)定。(11)熒光原位雜交(FISH)為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因，進(jìn)行熒光原位雜交。外周血樣品在含有植物凝集素、伴刀豆 凝集素A、脂多糖和2-巰基乙醇的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾天。在與具有30yg/ml 的終濃度的BrdU培養(yǎng)幾小時(shí)之后，將0.02 μ g/ml終濃度的秋水仙堿添加到培養(yǎng)基中，然 后進(jìn)一步培養(yǎng)樣品幾小時(shí)。采集淋巴細(xì)胞，然后用低滲溶液處理。除去紅血球，然后利 用甲醇/乙酸(3 lvol/vol)固定沉淀物。在固定之后，在載玻片上涂布細(xì)胞，風(fēng)干過 夜，用H0eChst33258染色，然后進(jìn)行紫外線處理。CAG-EGFP用毛地黃毒苷-11-dUTP標(biāo)記，然后作為探針在37°C雜交過夜。在 嚴(yán)格條件下洗滌載玻片，然后利用抗_Dig-Cy3檢測(cè)結(jié)合的標(biāo)記物。Leica CW4000 FISH 和Leica CW4000 karyo用于染色體分析。B.結(jié)果(1)利用慢病毒載體的轉(zhuǎn)基因的普通狨猴的生產(chǎn)對(duì)于基因轉(zhuǎn)移的胚胎，使用體外受精(IVF)胚胎和通過自然交配獲得著床前胚 胎。利用含有3種啟動(dòng)子(CAG、CMV和EFl- α啟動(dòng)子)的3種SIN載體導(dǎo)入EGFP 基因。載體被分別稱為CAG-EGFP、CMV-EGFP和EFl α-EGFP。由此構(gòu)建的SIN載
體注射到胚胎的圍卵腔中。普通狨猴的早期胚胎的圍卵腔太小，而不能注射足夠數(shù)量的 病毒溶液。即使病毒被注射到這樣的小間隙中，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因表達(dá)率低達(dá)46%。因而， 嘗試了下述方法，其涉及將早期胚胎置于0.25Μ蔗糖溶液中來引起細(xì)胞質(zhì)的暫時(shí)皺縮， 從而提高注射的病毒溶液的數(shù)量。在此使用原核到桑椹胚胚胎。在囊胚期胚胎的情況 中，將SIN載體注射到囊胚腔中?？偣?7個(gè)體外受精(IVF)胚胎和總共64個(gè)通過自然交配獲得的著床前胚胎利用 高滴度(5.6X IO9CFU到SfxiO11CFlK集落形成單位/ml))的SIN載體注射。表2顯示 了結(jié)果。利用0.25M蔗糖將慢病毒載體注射到27個(gè)IVF胚胎中的16個(gè)、64個(gè)著床前胚 胎的47個(gè)之內(nèi)(表3)。通過0.25M蔗糖處理，每個(gè)圍卵腔的體積擴(kuò)大1.2到6.5倍。在 11個(gè)IVF胚胎和15個(gè)著床前胚胎的情況中，使用囊胚期的胚胎，SIN載體不使用0.25M 蔗糖地注射到囊胚腔中。EGFP表達(dá)在注射SIN載體之后48小時(shí)發(fā)生。這樣，4個(gè)IVF 胚胎和12個(gè)著床前胚胎在注射后立即植入接受者動(dòng)物中。因此，沒有測(cè)量胚胎階段的 EGFP表達(dá)。在慢病毒載體的注射后48小時(shí)EGFP表達(dá)率在用蔗糖處理的著床前胚胎中 是89.7%，但在囊胚期的未處理的胚胎中是92.9%。通過熒光顯微術(shù)在48個(gè)著床前胚胎 和17個(gè)IVF胚胎中觀察到EGFP表達(dá)。Ai(61)個(gè)著床前胚胎和19個(gè)IVF胚胎植 入接受者動(dòng)物中，接受者動(dòng)物的排卵周期已與供體的周期同步。每個(gè)接受者動(dòng)物中每個(gè)周期植入一(1)到3個(gè)胚胎。代理母親的總數(shù)是51個(gè)。植入IVF胚胎或著床前胚胎的 七⑵個(gè)接受者懷孕。它們之中三(3)只狨猴分別在43、62和82天流產(chǎn)。在144到 147天，總共5只健康后代從其余4只狨猴中誕生。3只狨猴的每一個(gè)得到1個(gè)后代，另 外1只狨猴得到雙胞胎。這樣出生的5只后代有4只雌性狨猴和1只雄性狨猴。在5只 出生的后代中，3個(gè)后代來自其中注射了 CAG-EGFP的胚胎，2只后代來自其中注射了 CMV-EGFP的胚胎(表4)。因此，CAG或CMV作為啟動(dòng)子是優(yōu)選的。同樣，如表3 中所示，當(dāng)使用未經(jīng)蔗糖處理的著床前(IVF)胚胎時(shí)EGFP表達(dá)率是40.8%;使用經(jīng)蔗糖 處理的著床前(IVF)胚胎時(shí)是97.7%。當(dāng)進(jìn)行蔗糖處理時(shí)，EGFP表達(dá)率是顯著地高的 (P < 0.01)。表權(quán)利要求
1.將外源基因?qū)敕侨遂`長類動(dòng)物的早期胚胎的方法，包括向非人靈長類動(dòng)物的早 期胚胎添加0.2M-0.3M蔗糖溶液來進(jìn)行蔗糖處理，提高圍卵腔的體積，然后將含有與啟 動(dòng)子可操作地連接的人類外源基因的病毒載體注射到所述早期胚胎的圍卵腔中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述早期胚胎的圍卵腔的體積通過蔗糖處理提高到蔗 糖處理之前所述圍卵腔的體積的1.2到8倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中可被注入到未用蔗糖處理的早期胚胎中的外源基因的 數(shù)量的1.2到8倍數(shù)量的外源基因被注射到早期胚胎中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3的任一項(xiàng)的方法，其中所述靈長類動(dòng)物是狨猴。
5.根據(jù)權(quán)利要求1到4的任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒載體選自由慢病毒載體、腺病 毒載體和腺相關(guān)病毒載體構(gòu)成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒載體是慢病毒載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的方法，其中所述早期胚胎是通過自然交配獲得的、 處在原核期和桑椹期之間的著床前胚胎。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到6的任一項(xiàng)的方法，其中所述早期胚胎是通過人工授精獲得的、 處在原核期和桑椹期之間的胚胎。
9.根據(jù)權(quán)利要求1到8的任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒載體以范圍從1.3X103Cm到 1.3 X IO5CFU每胚胎的滴度注射。
10.生產(chǎn)其中外源基因可以被傳播到種系的轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其包括 通過根據(jù)權(quán)利要求1到9的任一項(xiàng)的方法將外源基因?qū)朐缙谂咛ブ?，將含有被?dǎo)入其中 的所述外源基因的所述早期胚胎植入到代理母親中，然后發(fā)育所述胚胎。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述外源基因 是涉及人類疾病的基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述涉及人類疾病 的基因是突變的α-共核蛋白基因，其是人類帕金森氏病的原因基因，或是突變體亨廷 頓基因，其是人類亨廷頓氏病的原因基因，且所述人類疾病模型靈長類動(dòng)物是人類帕金 森氏病模型靈長類動(dòng)物或人類亨廷頓氏病模型靈長類動(dòng)物。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的非人靈長類動(dòng)物的方法，其中所述外源基因被用 于敲除涉及人類疾病的人類基因的內(nèi)源非人靈長類動(dòng)物直向同源基因，且所述轉(zhuǎn)基因的 非人靈長類動(dòng)物是人類疾病模型敲除靈長類動(dòng)物。
14.轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其是通過根據(jù)權(quán)利要求11到13的任一項(xiàng)的方法生產(chǎn)的， 其中所述外源轉(zhuǎn)基因具有種系傳播能力。
15.轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其中作為人類帕金森氏病的原因基因的突變的人類α-共 核蛋白基因、或作為人類亨廷頓氏病的原因基因的突變的人類亨廷頓基因被導(dǎo)入其中， 所述基因被傳播到種系。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其是人類帕金森氏病模型靈長類動(dòng)物或 人類亨廷頓氏病模型靈長類動(dòng)物。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的轉(zhuǎn)基因的靈長類動(dòng)物，其中所述靈長類動(dòng)物是狨猴。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供將基因?qū)肱咛サ姆椒?，用于利用非人靈長類動(dòng)物例如狨猴來生產(chǎn)人類疾病模型靈長類動(dòng)物。本發(fā)明涉及將外源基因?qū)敕侨遂`長類動(dòng)物的早期胚胎的方法，其包括將非人靈長類的早期胚胎置于0.2M到0.3M蔗糖溶液中，以提高圍卵腔的體積，然后將含有與啟動(dòng)子可操作連接的人類外源基因的病毒載體注射到所述早期胚胎的圍卵腔中。
文檔編號(hào)A01K67/027GK102016029SQ20088012838
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2008年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者佐佐木惠理佳, 岡野榮之 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義墪