專利名稱：一種穩(wěn)定的多氧清原藥制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥原藥的制備方法，具體涉及一種穩(wěn)定的多氧清原藥制 備方法。本公司研發(fā)的多氧清原藥是不吸水鏈霉菌杭州變種的代謝產(chǎn)物，屬于 廣譜性抗生素類殺菌劑，具有較好的內(nèi)吸性，主要干擾菌體細胞壁幾丁質(zhì)的生 物合成，還能抑制病菌產(chǎn)孢和病斑擴大，對鏈格孢、宮部旋孢腔菌、稻紋枯病 菌有特效。
背景技術(shù)：
我國是農(nóng)用抗生素研究與生產(chǎn)的大國，在某些領(lǐng)域(如井岡霉素及赤霉素)
處于國際領(lǐng)先水平。我國農(nóng)用抗生素的研究始于上世紀50年代，以篩選殺菌抗 生素和植物生物調(diào)節(jié)劑為主。經(jīng)過近半個世紀的研究與發(fā)展，現(xiàn)有研究單位20 多個，科研人員數(shù)千余人，相繼成功開發(fā)了春雷霉素、赤霉素、慶豐霉素、井 岡霉素、農(nóng)抗120、中生菌素等近20個農(nóng)用抗生素品種。其中，農(nóng)用殺菌抗生 素品種為13個，占76.47%。在大規(guī)模生產(chǎn)的品種當中有井岡霉素，加上其他農(nóng) 用殺菌抗生素品種如農(nóng)抗120和多抗霉素等，農(nóng)用抗生素殺菌劑年產(chǎn)量可達5 千噸(折百計)，年應用面積達2 3億畝次，占到我國農(nóng)藥殺菌劑的10%左右。 從世界范圍看，農(nóng)用抗生素的研究與開發(fā)方面具有影響的研究機構(gòu)有5個，主 要集中在美國和日本，美國是默克公司與諾華公司，日本是明治制藥、北里研 究所和理化學研究所。從1983 1996年每年報道的新抗生素專利數(shù)量約100余 項，其中日本占80%;新農(nóng)畜抗生素為150多種，占總數(shù)的10%左右。我國的 井岡霉素與日本的多抗霉素是目前開發(fā)最為成功的兩大農(nóng)用殺菌抗生素。其生 產(chǎn)菌種都是鏈霉菌，發(fā)酵單位都在20000 Ug/ml左右，發(fā)酵時間也比較短，約在 40-60小時之間。井岡霉素己經(jīng)成為農(nóng)藥中每畝用藥成本最低的農(nóng)藥品種，而在 我國的水稻生產(chǎn)中發(fā)揮不可替代的作用。目前本公司多抗霉素(多氧清)的生 產(chǎn)技術(shù)及成本與井岡霉素相當，與日本的多抗霉素不相上下'達到了國際先進水平，而國內(nèi)其他廠家的生產(chǎn)水平則相距甚遠。本發(fā)明已有的核心技術(shù)是在國 內(nèi)首先使用離子注入法培育多氧清超高產(chǎn)菌株，并建立起了低濃度產(chǎn)品中試生 產(chǎn)線。本發(fā)明的主要內(nèi)容為運用超濾、納濾等現(xiàn)代膜提取技術(shù)應用于多氧清的 生產(chǎn)工藝中，開發(fā)高濃度的多抗霉素水劑和粉劑二大系列，建立起低成本、連
續(xù)、穩(wěn)定、高產(chǎn)、高收率的發(fā)酵及提取工藝，使發(fā)酵時間由當前的90-120小時 縮短到《50小時、發(fā)酵單位由當前的5000-8000u g/ml提高到20000ug/ml以上、 提取收率由當前的70%提高到95%以上。 多氧清產(chǎn)品理化性質(zhì)和基本特征
中文通用名稱多氧清
英文通用名稱polyoxin 其他名稱多抗霉素 技術(shù)指標有效含量》15%
結(jié)構(gòu)式理化性質(zhì)多氧清為無定型粉末，熔點H60。C (分解)；溶解度(20°C) lkg/1
水；〈100mg/l丙酮，甲醇和一般有機溶劑；PH值2.5-4.5， PHl-8下穩(wěn)定。 多氧清產(chǎn)品的特征
(1) 通過"二化"(馴化、優(yōu)化)措施，采用離子注入法，60C o照射等 復合誘變，培育"多氧清"超高產(chǎn)菌株，并建立低濃度產(chǎn)品中試生產(chǎn)線。
(2) 通過"二濾"(超濾、納濾)現(xiàn)代膜提取技術(shù)，并將"二濾"現(xiàn)代膜 提取技術(shù)應用于"多氧清"的生產(chǎn)工藝中，優(yōu)化制劑產(chǎn)品，開發(fā)高濃度水劑和 粉劑二大系列制劑產(chǎn)品。
(3) 通過"二藝"(發(fā)酵工藝、提取工藝)，建立低成本、連續(xù)、穩(wěn)定、高 產(chǎn)、高收率的發(fā)酵及提取工藝，從而實現(xiàn)"一縮"、"二高"的目的，即縮短發(fā) 酵周期(將發(fā)酵時間由當前的90-120小時縮短到《50小時)、提高發(fā)酵單位(將 發(fā)酵單位由當前的5000-8000 ug/ml提高到20000ug/ml以上)、提高提取收率(將 提取收率由當前的70%提高到95%以上)。
(4) 通過"二優(yōu)"工藝(優(yōu)化廢水處理工藝、優(yōu)化廢渣處理工藝)，重點 加強廢水處理工藝的研究，確保達標排放。
(5) 通過"二線"技術(shù)集成(水劑生產(chǎn)線技術(shù)集成、粉劑生產(chǎn)線技術(shù)集成)， 優(yōu)化生產(chǎn)工藝，建立15000噸"多氧清"水劑和粉劑二大系列生產(chǎn)示范基地。
技術(shù)內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種"多氧清"原藥的制備方法 本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
本發(fā)明提供一種"多氧清"原藥的制備方法，包括如下步驟
1、研究內(nèi)容
(1)離子注入、經(jīng)60。C照射復合誘變育種。建立高效快速篩選流程，研究氮離子注入突變機理及引發(fā)菌株突變點位，研究氮離子注入射程，射能及60°C 照射60劑量對誘變效應的影響，獲得較優(yōu)菌株1 2株。
(2) 進行菌株的生理生化鑒定和16SrRNA同源性分析，確定菌株的進化 位置；探討所得菌株的可能代謝概貌，找出代謝過程中的關(guān)鍵酶及其代謝節(jié)點， 對其中最關(guān)鍵的幾種酶進行特性研究，并分析關(guān)鍵節(jié)點的剛?cè)嵝裕瑯?gòu)建菌株代 謝網(wǎng)絡(luò)并進行代謝流量分析。
(3) 研究多抗霉素的膜提取工藝，改變傳統(tǒng)板濾膜分離工藝。應用膜分離 技術(shù)來提高產(chǎn)品的純度，并大幅度降低制造成本，從而減少環(huán)境污染，提高產(chǎn) 品品質(zhì)與提取收率。
(a) 膜技術(shù)是一種新興的技術(shù)。由于其多學科性特點，可以用于大量的分 離過程。膜技術(shù)的特點是非常定性的，且不同過程及不同應用場合會有較大差 別。膜分離技術(shù)具有七大特點 一是可實現(xiàn)連續(xù)分離；二是能耗通常較低；三 是易與其它分離過程結(jié)合(聯(lián)合過程)；四是可在溫和條件下實現(xiàn)分離；五是易
于放大；六是膜的性能可以調(diào)節(jié)；七是不需要填加物。其膜的分離原理如圖l。
(b) 研究Ultra-flo超濾膜與納濾膜提取新工藝。多抗素發(fā)酵完成后，發(fā)酵 液中除了含有2%左右濃度的抗生素外，還含有大量的其他雜質(zhì)。這些雜質(zhì)包括 菌絲體，未用完的培養(yǎng)基，產(chǎn)生菌的其他代謝產(chǎn)物，還有的是在發(fā)酵液預處理 過程中需要加入的物質(zhì)等，這些雜質(zhì)在發(fā)酵液中的濃度往往超過抗生素的百倍、 千倍、甚至上萬倍，而且其中很多代謝產(chǎn)物的物化性能和多抗霉素又非常接近。 因此要從發(fā)酵液中去掉這些雜質(zhì)，以制取高純度的產(chǎn)品，發(fā)酵液的提取及精制 是很重要的一個環(huán)節(jié)。在多抗霉素的膜法提取新工藝中，我們主要做兩個改進:
一是用Ultra-flo膜系統(tǒng)代替板框過濾，并在其后添加了一個小超濾以進一步除 去大分子雜質(zhì)；二是用九十年代的最新膜過濾技術(shù)——納濾替代傳統(tǒng)的薄膜濃縮。由于Ultra-flo鋸齒膜在工藝上有重大創(chuàng)新，顯示出能夠直接處理高粘度、 高含固量流體；保持穩(wěn)定的高膜通量；消除濃差極化、難堵塞、易清洗；各膜 片相互獨立，大大降低換膜成本；系統(tǒng)可逐級拓展，中試結(jié)果適用于生產(chǎn)規(guī)模; 操作維護簡單，故障明顯易于排除；采用錯流與橫過濾工藝，得到最大限度分 離等技術(shù)優(yōu)勢，解決了傳統(tǒng)工藝無法解決的難題，已在生物制藥、有機酸等領(lǐng) 域的三達客戶膜應用中創(chuàng)造出驕人的技術(shù)效果和經(jīng)濟效益。
(C)多抗霉素膜法提取新工藝 傳統(tǒng)工藝如圖2
膜分離工藝
經(jīng)本公司全體技術(shù)人員的長期研究，并經(jīng)中試驗證，認定以上膜分離工藝 可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的工藝過程，簡要描述如下
① 用專用的發(fā)酵液Ultra—flo超濾技術(shù)替代傳統(tǒng)的板框壓濾。在不需要加入
助濾劑、絮凝沉淀劑及其他任何化學試劑的情況下，可把菌絲體、固體殘余培
養(yǎng)基、99%以上的蛋白(包括可溶解性蛋白)、部分色素一步除去，得到澄清的
② 小分子量超濾，可進一步去除Ultra-flo得到的超濾液中的色素、多糖等 雜質(zhì)，得到澄黃色的溶液。
③ 小超濾的濾液，再經(jīng)過納濾膜的濃縮，將多氧清由低濃度濃縮成高濃度 的溶液，直接制成水劑產(chǎn)品，或?qū)⑵鋰姼沙煞蹌?。納濾濃縮過程中還可以將小 超濾濾液中的單糖、無機鹽去除，從而進一步提高產(chǎn)品的純度。從中試實驗中 可以看出，納濾透析液近乎沒有顏色，而濃縮的速度很快，可以保證納濾低成 本濃縮小超濾濾液，而溫度低于40。C，避免了熱破壞造成的損失。
膜分離工藝的優(yōu)點。采用Ultra-Flo膜系統(tǒng)有如下優(yōu)點
71) 產(chǎn)物回收率一般為97 99%，比采用板框過濾提高了 25%。
2) 最終產(chǎn)物質(zhì)量比采用板框過濾時高。
3) 減輕工藝提取難度，節(jié)約輔消耗。
4) 操作工藝流程簡化，操作成本低。
5) Ultra-flo超濾系統(tǒng)實行系統(tǒng)封閉過濾，濾液不受人為污染，排渣無須手動， 生產(chǎn)環(huán)境改善，操作勞動強度減輕。
用納濾技術(shù)與傳統(tǒng)的減壓濃縮、薄膜蒸發(fā)濃縮相比具有如下優(yōu)越性
1) 由納濾技術(shù)濃縮完全是物理過程，無相變的發(fā)生、能耗低、運行費用低；
2) 透過液中僅含有無機鹽，可回收利用，無廢液排放，符合環(huán)保要求；
3) 濃縮質(zhì)量和濃縮收率都較高且穩(wěn)定；
4) 實行系統(tǒng)封閉運行，勞動強度低，生產(chǎn)環(huán)境改善；
膜系統(tǒng)運行平穩(wěn)，維修容易。膜系統(tǒng)可分性強，可根據(jù)料液流量大小隨時 切換膜的運行數(shù)量，其余可進行清洗、保護或更換等操作，故膜系統(tǒng)無傳統(tǒng)工 藝的每年大修要求，在40 45'C左右用低壓力大流量對膜進行清洗，只需清洗 一小時左右即能使膜通量恢復，而不用拆卸設(shè)備，可實現(xiàn)全自動運行與清洗。 本工藝的占地面積大大縮小。由于膜設(shè)備都是由膜元件疊加起來的，使膜設(shè)備 占地極小。膜系統(tǒng)為全封閉系統(tǒng)，無物料和氣體的泄漏，噪音小，并容易實現(xiàn) 全自動化運行。
2、技術(shù)方案
采用的主要原材料為玉米粉、豆餅粉等，經(jīng)發(fā)酵、提取、濃縮、干燥后制成 多抗霉素粉劑產(chǎn)品。
一是發(fā)酵工藝從砂土管中取出保存的多抗霉素(多氧清) 菌種放在經(jīng)消毒的斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)數(shù)天，待出現(xiàn)灰色孢子后，取出移至經(jīng)滅
菌消毒的茄子瓶中培養(yǎng)24-28小時，以1-2%的接種量接入菌種，至鏡檢菌絲量多而粗壯、染色深后將菌絲移至種子罐中(事先滅菌、消毒)，在與茄子瓶相同的
條件下進行培養(yǎng)24小時，待菌絲鏡檢呈網(wǎng)狀后進行工業(yè)發(fā)酵40-43小時，至菌絲 著色淺且不均勻、PH值上升可放罐。二是提取工藝從發(fā)酵罐中放出的發(fā)酵液 用鹽酸酸化至PH3-5后，用板框壓濾機過濾，濾餅為帶菌絲體的固體殘渣，是一 種高效優(yōu)質(zhì)的生物肥料，經(jīng)加工后制成成品生物肥料出售。濾液在隔膜三效濃縮 器進行濃縮到一定濃度后(溫度控制在60-70°C)，再用鹽酸進行酸化到PH2時進 行檢驗，合格后進行分裝成水劑多氧清產(chǎn)品；濃縮液用閃蒸干燥器進行干燥處理， 形成粉劑產(chǎn)品。三是設(shè)備選型在項目關(guān)鍵工序發(fā)酵工段，采用先進的全套電腦 控制系統(tǒng)和大容積不銹鋼罐，實行全過程自動控制，確保發(fā)酵條件，保證產(chǎn)品品 質(zhì)；濃縮和干燥工段采用超濾和閃蒸干燥等先進工藝設(shè)備；包裝采用全自動高速
罐裝線，在關(guān)鍵技術(shù)部門質(zhì)檢、菌種培養(yǎng)室，立足引進具有國內(nèi)先進水平的儀器， 逐步建成企業(yè)技術(shù)開發(fā)中心。
3、技術(shù)路線
根據(jù)中試工藝研究的成果，本項目確定的技術(shù)方案是以玉米粉、豆餅粉等為主
要原材料，經(jīng)發(fā)酵、濃縮、提取、干燥后制成多氧清水劑和粉劑產(chǎn)品。主要工
藝流程如圖3。
4、技術(shù)組成成份與質(zhì)量
(1) 以玉米、豆餅粉等為主要原材料、進一步篩選菌種、優(yōu)化發(fā)酵工藝， 建立起穩(wěn)定的多氧清工業(yè)化生產(chǎn)工藝，使發(fā)酵時間《50小時，下罐效價》20000 U g/ml。
(2) 運用超濾、納濾等膜高新技術(shù)于多氧清的后提取工藝中'替代傳統(tǒng)的 板框過濾、減壓濃縮，使多氧清的總收率由目前的70%提高到95%以上。
(3) 技術(shù)質(zhì)量。原藥產(chǎn)品的有效含量為15°/。；水劑產(chǎn)品外觀為棕色至深棕 色均相液體，無霉變，允許有少量沉淀物，是發(fā)酵液經(jīng)超濾、納濾處理后直接加工而成；制劑產(chǎn)品有1%和3%多氧清(多抗霉素)兩種規(guī)格，有效成分含量
分別為10000 li g/ml±500和30000 Ug/ml± 1500、沉淀物為《2.0%和《5.00/0; 可濕性粉劑的加工是將納濾處理的高濃度水劑直接經(jīng)閃蒸干燥形成，并加載體、 潤濕劑等稀釋成有效成分含量為10%的可濕性粉劑?？蓾裥苑蹌┩庥^為均勻的 黃色疏松粉末、不應有團塊，pH值范圍3.0 6.0，水分《3%，懸浮率》70%， 細度(通過44!1111試驗篩)^95%，加速貯存試驗合格。
1%多氧清發(fā)酵實例一玉米粉10.0%，豆粕5.0%，蠶蛹粉1.5%，酵母粉 1.0%，水82.5%;實例二玉米粉8.0%，淀粉6.0%，豆粕5.0%,酵母粉1.0%， 水80.0% 。
權(quán)利要求
1、一種多氧清原藥的制備方法，其有效成分為15％。
2、 按照權(quán)利要求1所述的多氧清(多抗霉素)為無定型粉末，熔點H6(TC (分解);溶解度(20°C) lkg/l水;〈100mg/l丙酮，甲醇和一般有機溶劑；PH值2.5-4.5， PHl-8下穩(wěn)定。有效含量>15%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)藥原藥的制備方法，具體涉及一種多氧清原藥的制備方法。本發(fā)明是以玉米、豆餅粉等為主要原材料、進一步篩選菌種、優(yōu)化發(fā)酵工藝，建立起穩(wěn)定的多氧清工業(yè)化生產(chǎn)工藝，使發(fā)酵時間≤50小時，下罐效價≥20000μg/ml。運用超濾、納濾等膜高新技術(shù)于多氧清的后提取工藝中，替代傳統(tǒng)的板框過濾、減壓濃縮，使多氧清的總收率由過去的70％提高到95％以上。其產(chǎn)品可用于廣泛防治黃瓜白粉病、蘋果斑點落葉病、蕃茄葉霉病、煙草赤星病、西瓜蔓枯病等在內(nèi)的多種病菌害。
文檔編號A01P3/00GK101496524SQ20081005702
公開日2009年8月5日 申請日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者吳家全, 張仕耀, 鵬 李, 李軍民, 李鳳明 申請人:北京綠色農(nóng)華植?？萍加邢挢熑喂?br>