專利名稱：沉默赤霉素2-氧化酶的表達(dá)的組合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離的編碼紅麻(/7Awa^ c朋"Wm^)赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及沉默GA 2-氧化酶基因的表達(dá)以 增加才直物中的纖維的方法。
背景技術(shù)：
植物纖維是具有錐形末端和非常厚的、高度木質(zhì)化的細(xì)胞壁的細(xì)長(zhǎng)細(xì) 胞。許多具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)品如紙、繩索(繩和索)和紡織品都是由植 物纖維衍生而來。纖維細(xì)胞充當(dāng)植物莖和根的支持組織。纖維是厚壁組織
的組分，厚壁組織還含有較短的、厚壁硬化細(xì)胞(石細(xì)胞)。纖維經(jīng)常發(fā)現(xiàn) 于單子葉植物和雙子葉植物莖和根的木質(zhì)部(木材)和韌皮部(樹皮)組織。
在樹木的主要商業(yè)產(chǎn)品中，纖維是一項(xiàng)重大的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。1997年時(shí)曾 預(yù)測(cè)造紙纖維的全球總消費(fèi)量將從1998年的約3億噸增加至2010年的約 4.25億p屯。
纖維形成的誘導(dǎo)受葉中產(chǎn)生的植物激素生長(zhǎng)素和赤霉素，以及根中產(chǎn) 生的細(xì)胞分裂素(cytokinine)的控制。生長(zhǎng)素和赤霉素還控制纖維細(xì)胞壁中 木質(zhì)素的形成和結(jié)構(gòu)。已顯示在木質(zhì)部和韌皮部中赤霉素均是誘導(dǎo)纖維的 特異性信號(hào)(Aloni， Plant Physiol. 63: 609-614， 1979; Aloni等，Plant Physiol. 94: 1743-1747， 1990)。
生長(zhǎng)緩慢的障礙。
赤霉素(GA)是一組多于100個(gè)的四環(huán)二萜，其中一些是在整個(gè)植物生 命周期中影響生長(zhǎng)和發(fā)育過程的必要的內(nèi)源調(diào)節(jié)劑，所述生長(zhǎng)和發(fā)育過程
9包括芽的伸長(zhǎng)、葉的擴(kuò)展和成形、開花和種子萌發(fā)。GA在控制芽的伸長(zhǎng)
中的重要性得到了擬南芥(/1ra/H^/xTO)、玉米和豌豆的GA-缺陷型突變體 的證明。這些突變體具有與野生型(wt)植物相比降低的活性GA水平和更 短的節(jié)間，造成矮化表型。所述GA-缺陷型突變體的表型可通過施加活性 GA得到完全恢復(fù)。植物中GA的生物合成是通過從曱羥戊酸開始的類異 戊二烯途徑發(fā)生的。赤霉素水平主要受赤霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄控制的 調(diào)節(jié)。
多功能酶GA20-氧化酶是控制GA生物合成的關(guān)鍵酶。它催化C20赤 霉素GA12/GA53通過三個(gè)連續(xù)的氧化反應(yīng)逐步轉(zhuǎn)化成GA9/GA20，它們 分別是生物活性赤霉素GA4和GA1的直接前體。GA 20-氧化酶基因的表 達(dá)受GAl/4作用的下調(diào)，暗示直接終產(chǎn)物抑制參與該基因的調(diào)節(jié)。生物活 性GA降解的第一步包括GA 2-氧化酶，該酶使活性GA的C-2羥基化。 已從幾個(gè)物種中克隆了 GA2-氧化酶基因(Thomas等.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.， 96 (1999) 4698-4703)。
已顯示具有高水平GA的纖細(xì)突變體表現(xiàn)出過度伸長(zhǎng)。編碼GA 2-氧 化酶的SLENDER基因揭示了 GA 2-氧化酶在控制GA水平中的作用。事 實(shí)上，GA2-氧化酶在擬南芥中的過表達(dá)導(dǎo)致GA水平降低，產(chǎn)生具有GA 缺陷的突變體"典型的矮化表型。
迄今為止，大多數(shù)關(guān)于增加纖維產(chǎn)量的遺傳研究都集中于GA-20氧化 酶的過表達(dá)。在過表達(dá)GA-20氧化酶的轉(zhuǎn)基因植物中，葉和節(jié)間中均測(cè)量 到了高水平的GA，證實(shí)GA生物合成得到增強(qiáng)。這些轉(zhuǎn)基因植物顯示增 加的纖維長(zhǎng)度(Eriksson等.Planta， 214: 920-930, 2002; Huang等，Plant Physiol. 118: 773-781， 1998;和Biemelt等，Plant Physiol. 135: 254-265, 2004)，并且由于GA2-氧化酶的催化，顯示非常高的非活性GA的水平。
第6,670,527號(hào)美國(guó)專利(Thomas等)公開了編碼紅花菜豆(i^o^o/M c6)cc/we^)牙口扣乂南芥(v4raZ)z'(iop^s1 Aa/z'crw")的GA-2 fU匕酶的斗亥酉臾序歹'J ，牙口這 些GA2-氧化酶的氨基酸序列。第6,670,527號(hào)美國(guó)專利涉及抑制植物生長(zhǎng) 的方法，所述方法包括用表達(dá)具有GA 2-氧化酶活性的植物多肽的核酸轉(zhuǎn) 化植物細(xì)胞。第6,670,527號(hào)美國(guó)專利進(jìn)一步教導(dǎo)編碼核酶的反義核酸序
10列和核酸序列，所述核酶可通過阻止GA 2-氧化酶滅活赤霉素而用于促進(jìn) 植物生長(zhǎng)。
第6,723,897號(hào)美國(guó)專利(Brown等)公開了通過生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物降低 植物中的GA水平的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物具有包含編碼GA 2-氧化酶的 序列的轉(zhuǎn)基因，GA2-氧化酶滅活內(nèi)源GA。
第4,507,144號(hào)美國(guó)專利(Aloni)公開了增加植物的纖維產(chǎn)量的過程， 所述過程包括多次向植物施加生長(zhǎng)素和赤霉素的組合，和在所述植物達(dá)到 需要的生長(zhǎng)階段后收獲纖維(crop)。
紅麻(Kenaf, //A/scws ccr朋aZ)w i/力是一種與棉花((7aw)^/ww /^n^wm L.) 近緣的生長(zhǎng)迅速的一年生植物，6個(gè)月內(nèi)高度可達(dá)4-6米，每英畝可產(chǎn)5-10 噸干纖維。紅麻是一種環(huán)境友好的植物，長(zhǎng)期以來一直用作生產(chǎn)繩索和索 的來源。美國(guó)對(duì)紅麻(kenaf)的研究主要涉及作物生產(chǎn)(yield production)。 20 世紀(jì)70年代和80年代的一些研究涉及在新聞?dòng)眉堉惺褂眉t麻，而將紅麻 商業(yè)化制成各種產(chǎn)品成為近年來的主要焦點(diǎn)。紅麻是優(yōu)良的纖維來源，因 為它幾乎不需要養(yǎng)護(hù)，而且由于其快速的萌發(fā)和出土，只需很少或不需要 使用除草劑。植物頂部葉片的致密冠層阻止雜草的生長(zhǎng)。此外，紅麻需要 的肥料量大致與陸地棉相同而少于玉米。大多數(shù)害蟲都不會(huì)攻擊此含纖維 的植物莖，因而無需使用殺蟲劑。
考慮到軟木材不足以供應(yīng)日益增加的紙漿和紙制品的需求，紅麻是很 有前途的紙漿替代品。由于紅麻生長(zhǎng)迅速，因而此植物是比美國(guó)目前用于 制漿的南方松(Southern pine tree)更好的纖維來源，南方松達(dá)到可收獲尺寸 需要的時(shí)間從7到40年不等。
存在對(duì)有效和改良的方法的未滿足的需求，以增加一般的植物和特別 的紅麻植物的樹皮(韌皮部)和木材(木質(zhì)部)的纖維。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供分離的編碼紅麻赤霉素2-氧化酶(GA 2-氧化酶)的核酸序 列和該酶的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于沉默才直物GA 2-氧化酶的基因表達(dá)的核酸序列，和通過沉默GA 2-氧化酶的基因表達(dá)增加植物纖維
產(chǎn)量的方法。
本文首次公開了使用設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生靶向擬南芥植物GA 2-氧化酶基因 的siRNA的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥植物，導(dǎo)致產(chǎn)生了其中GA 2-氧化酶 基因表達(dá)被RNA千擾(RNAi)沉默的轉(zhuǎn)基因植物。發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)基因擬南芥 植物高于非轉(zhuǎn)基因野生型擬南芥植物，它們的節(jié)間更長(zhǎng)，并且它們比其野 生型對(duì)應(yīng)植物開花更快。此外，所述轉(zhuǎn)基因擬南芥植物莖中的纖維細(xì)胞數(shù) 量高于野生型植物的數(shù)量。
本文進(jìn)一步公開使用設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生靶向煙草植物GA 2-氧化酶基因的 siRNA的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草植物，導(dǎo)致產(chǎn)生了其中GA2-氧化酶基因表 達(dá)被沉默的轉(zhuǎn)基因植物。發(fā)現(xiàn)所述轉(zhuǎn)基因煙草植物高于非轉(zhuǎn)基因野生型煙 草植物。所述轉(zhuǎn)基因煙草植物的葉長(zhǎng)于野生型植物的葉。
本文公開了其中GA 2-氧化酶被沉默的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植物表現(xiàn) 出與其中過表達(dá)GA 20-氧化酶的轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植物相似的表型特 性。因此，本發(fā)明令人驚訝地公開了沉默GA 2-氧化酶基因的表達(dá)引起的 植物赤霉素水平的增加，使植物生長(zhǎng)更快和更高，所述植物的韌皮部和/ 或木質(zhì)部纖維含量高于非轉(zhuǎn)基因野生型植物。
本發(fā)明進(jìn)一步公開了如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶 的DNA序列、如SEQ ID NO: 2所述的紅麻GA2-氧化酶的氨基酸序列和 如SEQ ID NO: 3所述的紅麻GA 2-氧化酶基因組序列。本發(fā)明進(jìn)一步公 開了能夠產(chǎn)生RNA分子的DNA序列，所述RNA分子能夠抑制各種植物 的GA 2-氧化酶基因的表達(dá)。所述DNA序列可用于轉(zhuǎn)化植物以沉默GA 2-氧化酶基因的表達(dá)，以便降低這些植物中的赤霉素水平，并且所述轉(zhuǎn)化植 物的纖維量和密度高于對(duì)照植物的纖維量和密度。所述轉(zhuǎn)化植物可以是紙 漿和纖維的寶貴來源。本發(fā)明DNA序列特別適用于轉(zhuǎn)化紅麻植物。
本發(fā)明在本文是以擬南芥和煙草植物為例。但是，任何用作商業(yè)纖維 來源的植物在使用能夠產(chǎn)生靶向所述植物的GA2-氧化酶基因的siRNA的 DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之后，均可成為更好和更富集的纖維來源，并因此屬于本 發(fā)明范圍。根據(jù)第一個(gè)方面，本發(fā)明提供分離的包含如SEQIDNO: 1所述的編 碼紅麻赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列、其片段、互補(bǔ)鏈或同 源序列的核酸分子，其中所述同源序列與SEQIDNO: 1具有至少80%序 列同 一性。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述同源序列與SEQ ID NO: 1具有至少 90%、可選地至少95%、可選地100%序列同一性。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案， 所述分離的核酸分子具有如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶 的核苷酸序列。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述分離的核包含如SEQIDNO: 4所述的核苷酸。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供分離的包含如SEQIDNO: 2所述的 氨基酸序列的紅麻GA 2-氧化酶多肽或其類似物或片段，其中所述類似物 與SEQ ID NO: 2具有至少80%、可選地至少90%、可選地至少95%或100% 氨基酸序列同源性。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所迷分離的紅麻GA 2-氧化酶多 肽具有如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供具有如SEQ ID NO: 3所迷的核苷酸 序列的編碼紅麻GA 2-氧化酶的核酸分子。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供下調(diào)紅麻GA 2-氧化酶基因的表達(dá)的雙鏈 RNA分子，所述雙鏈RNA分子包含
a) 包含與紅麻GA2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少90% 序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的所述雙鏈RNA的第一個(gè) RNA鏈；和
b) 包含與紅麻GA 2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的互補(bǔ)序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的所述雙鏈 RNA的第二個(gè)RNA鏈，
其中所述第一個(gè)和第二個(gè)RNA鏈能夠彼此雜交以形成所述雙鏈 RNA分子。
根據(jù)一些實(shí)施方案，所述第一個(gè)和第二個(gè)RNA鏈各包含至少25個(gè)核 苷酸、可選地至少50個(gè)核普酸、可選地至少100個(gè)核苷酸、可選地至少 400個(gè)核苷酸。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所迷第一個(gè)RNA鏈與紅麻GAS-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少95%序列同一性、可選地100%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第二個(gè)RNA鏈與紅麻GA 2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的互補(bǔ)序列或其片段具有至少95%序列同一性、可選地100%序列同一性。才艮據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述GA2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述第一個(gè)RNA鏈與由包含如SEQ ID NO: 4所述的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少90%序列同一性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，所述第二個(gè)RNA鏈與由包含如SEQ ID NO: 38所述的核苷酸序列的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少90%序列同一性。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生能夠下調(diào)紅麻GA 2-氧化酶基因表達(dá)的RNA分子的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼形成雙鏈RNA的RNA序列的多核苷酸序列的植物啟動(dòng)子，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列，和
(ii) 包含與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核苷酸序列，
其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)紅麻GA 2-氧化酶基因的表達(dá)。
根據(jù)一些進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列各包含至少25個(gè)核苷酸、可選地至少50個(gè)核苷酸、可選地至少100個(gè)核苷酸。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少95%序列同一性、可選地100%序列同源性。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: l所述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段具有至少95%序列同一性、可選地100%序列同源性。
14根據(jù)一些實(shí)施方案，所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 4所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%、可選地95%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 38所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%、可選地95%序列同一性。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述植物啟動(dòng)子選自由組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和發(fā)育階段特異性啟動(dòng)子組成的組。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含可選擇的標(biāo)記。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述可選擇的標(biāo)記是編碼賦予抗生素抗性的產(chǎn)物的多核苷酸序列。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體進(jìn)一步包含選自由增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)組成的組的表達(dá)控制序列。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體的第一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列可操作地連接至同一啟動(dòng)子。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述笫一個(gè)和第二個(gè)核苦酸序列被間隔子序列(spacer sequence )隔開。根據(jù)某些實(shí)施方案，所述間隔子序列產(chǎn)生自內(nèi)含子。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供耙向如SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的區(qū)域的寡核苷酸序列，其中所述寡核普酸序列能夠與所述核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的區(qū)域特異性雜交，從而抑制GA2-氧化酶的表達(dá)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，所述核苷酸序列的區(qū)域選自由5'-非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、終止密碼子區(qū)和3'-非翻譯區(qū)組成的組。根據(jù)某些實(shí)施方案，所述寡核苷酸序列包含至少20個(gè)核苷酸。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述寡核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾的核苷酸間鍵合?？蛇x地，所迷寡核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾的糖。優(yōu)選地，所述寡核苷酸序列連接至植物啟動(dòng)子，其中所述植物啟動(dòng)子可操作地連接至所述反義寡核普酸序列。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供靶向如SEQIDNO: 3所述的核苦酸序列或其互補(bǔ)鏈的區(qū)域的反義寡核苷酸序列，其中所述反義寡核香酸序列能夠與所述核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈的區(qū)域特異性雜交，從而抑制GA 2-氧化酶的表達(dá)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，所述核苷酸序列的區(qū)域選自由5'-非翻譯區(qū)、編碼區(qū)、終止密碼子區(qū)和3'-非翻譯區(qū)組成的組。根據(jù)某些實(shí)施方案，所述反義
寡核苷酸序列包含至少20個(gè)核苷酸。應(yīng)理解，所述寡核苷酸序列可由長(zhǎng)達(dá)500個(gè)核香酸組成。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述反義寡核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾的核苷酸間鍵合。可選地，所述寡核苷酸序列包含至少一個(gè)修飾的糖。優(yōu)選
地，所述寡核苷酸序列連接至植物啟動(dòng)子，其中所述^i物啟動(dòng)子可操作地
連接至所述反義寡核苷酸序列。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供編碼核酶的核苷酸序列，所述核酶能
夠特異性切割由包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供用本發(fā)明雙鏈RNA;或用本發(fā)明DNA構(gòu)建體；或用本發(fā)明反義寡核苷酸序列；或用本發(fā)明編碼核酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其中GA 2-氧化酶基因的表達(dá)被下調(diào)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述植物細(xì)胞是紅麻植物細(xì)胞。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含至少一個(gè)用本發(fā)明雙鏈RNA;或用本發(fā)明用于產(chǎn)生RNA的DNA構(gòu)建體；或用本發(fā)明反義寡核苷酸序列；或用本發(fā)明編碼核酶的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中GA 2-氧化酶基因的表達(dá)被下調(diào)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明原理的轉(zhuǎn)基因植物的種子。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物的種子是轉(zhuǎn)基因紅麻植物的種子。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供根據(jù)本發(fā)明原理的轉(zhuǎn)基因植物的莖。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物的莖是轉(zhuǎn)基因紅麻植物的莖。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供通過下調(diào)GA 2-氧化酶生產(chǎn)具有降低的GA 2-氧化酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將包含可操作地連接至編碼RNA序列的多核苷酸序列的植物啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列；和
(ii) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互補(bǔ)序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核香酸序列，
其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)所述GA 2-氧化酶基因
的表達(dá)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物選自由被子植物家族和棵子植物家族組成的組。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物選自由木槿屬(Hibiscus sp.)、片勿屬(Populus sp.)、桉屬(Eucalyptus sp.)、向曰葵屬(Helianthussp.)、黃麻屬(Corchorus sp.)和苧麻屬(Boehemiera sp.)組成的組。沖艮據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物選自由紅麻、向日葵(/^//朋^^ a朋m/s L.，sunflower)、 赤斗會(huì)(五wc"/z)^ms cama/dw/ew57X)、 大麻(C"m"aZ)^ sa"va L.)、 黃麻(Co r/2ontf o/Ztohzw L.)和苧麻C8oe/ eme"力m'vea L.)纟且成的纟且。才艮氺居某個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物。根據(jù)其它的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物，則所述DNA構(gòu)建體符合本發(fā)明原理。
根據(jù)其它的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基因植物是擬南芥，則所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQ 1DNO:35所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 39所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基因植物是煙草，則所迷第一個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 40所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，如果所述植物是番茄，則所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 37所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同 一性，并且所述笫二個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 41所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
17根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供通過下調(diào)GA 2-氧化酶生產(chǎn)具有降低的GA 2-氧化酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括向至少一個(gè)植物細(xì)胞導(dǎo)入本發(fā)明雙鏈RNA;或本發(fā)明反義寡核苷酸序列；或本發(fā)明編碼核酶的核香酸序列，從而生產(chǎn)具有比非轉(zhuǎn)基因植物更高的赤霉素水平和更低的GA 2-氧化酶基因表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法進(jìn)一 步包括向所述轉(zhuǎn)基因植物導(dǎo)入有效增加纖維量的赤霉素或/和生長(zhǎng)素的步驟。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法進(jìn)一步包括向至少一個(gè)植物細(xì)胞導(dǎo)入編碼赤霉素20-氧化酶的核酸分子的步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻。
根據(jù)一些實(shí)施方案，引入本發(fā)明雙鏈RNA;或本發(fā)明DNA構(gòu)建體；或本發(fā)明反義寡核苷酸序列；或本發(fā)明編碼核酶的核苷酸序列是通過選自下述組的方法執(zhí)行的農(nóng)桿菌04gra/^ctehMW)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法(microprojectile bombardment )、花4分介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、才直物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移和致密胚性愈傷組織的電穿孔。
根據(jù)進(jìn)一步方面，本發(fā)明提供增加植物纖維產(chǎn)量的方法，所述方法包括向至少一個(gè)植物細(xì)胞導(dǎo)入包含可操作地連接至編碼RNA序列的多核苷酸序列的植物啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體，所述多核苷酸序列包含
(i) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少90。/。序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列，和
(ii) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互補(bǔ)序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核苷酸序列，
其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA下調(diào)GA2-氧化酶基因的表達(dá)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，所述第一個(gè)(fist)核苷酸序列與編碼所述GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少95%、可選地100%序列同一性。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述第二個(gè)核苷酸序列與編碼所述GA 2-氧化酶的核酸分子的互補(bǔ)序列或其片段具有至少95%、可選地100%序列同一性或100%
18同源性。
根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述植物選自由被子植物家族和棵子植物家族組成的組。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述被子植物家族包括但不限于木槿屬、楊屬、桉屬、向日葵屬、黃麻屬和苧麻屬。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述植物選自由紅麻、向日葵、赤桉、大麻、黃麻和苧麻組成的組。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述植物是紅麻植物。根據(jù)其它的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基
因植物是紅麻植物，則所述DNA構(gòu)建體符合本發(fā)明原理。
根據(jù)其它的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基因植物是擬南芥，則所述第一個(gè)
核香酸序列與如SEQ IDNO:35所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 39所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，如果所述轉(zhuǎn)基因植物是煙草，則所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，并且所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 40所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。根據(jù)進(jìn)一步的實(shí)施方案，如果所述植物是番茄，則所述第一個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 37所述的核香酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 41所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供包含分離的包含如SEQIDNO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶核普酸序列、或其互補(bǔ)鏈或同源序列的核酸分子的表達(dá)載體，其中所述同源序列與SEQIDNO: 1具有至少80%序列同一性。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述表達(dá)載體內(nèi)的同源序列與SEQIDNO: 1具有至少90%、可選地至少95%、可選地100%序列同一性。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述表達(dá)載體包含分離的具有如SEQ TD NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶的核苷酸序列的核酸分子。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供過表達(dá)紅麻GA 2-氧化酶基因的植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞用包含分離的包含如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA2-氧化酶的核普酸序列、或其互補(bǔ)鏈或同源序列的核酸分子的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中所述同源序列與SEQIDNO: 1具有至少80%序列同一性。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述表達(dá)載體內(nèi)的同源序列與SEQIDNO: 1具有至 少90%、可選地至少95%、可選地100%序列同一性。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案， 所述植物細(xì)胞用包含分離的包含如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶的核普酸序列的核酸分子的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方 案，所迷植物細(xì)胞是紅麻植物細(xì)胞。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供包含至少 一個(gè)用包含分離的包含如 SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA2-氧化酶的核苷酸序列、或其互補(bǔ)鏈或 同源序列的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述 同源序列與SEQ ID NO: 1具有至少80%序列同一性。根據(jù)一些實(shí)施方案， 所述同源序列與SEQIDNO: 1具有至少90%、可選地至少95%、可選地 100%序列同一性。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物包含至少一個(gè)用包 含分離的包含如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶的核苷酸序 列的核酸分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基 因植物是紅麻植物。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)過表達(dá)紅麻GA 2-氧化酶的轉(zhuǎn)基因植 物的方法，所述方法包括向植物的至少 一個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入包含分離的包含如 SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA2-氧化酶的核芬酸序列、或其互補(bǔ)鏈或 同源序列的核酸分子的表達(dá)載體，其中所述同源序列與SEQIDNO: l具 有至少80%、可選地至少90%、可選地至少95%、可選地100%序列同一 性，進(jìn)而生產(chǎn)赤霉素(GA)水平低于非轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物。根據(jù)某個(gè) 實(shí)施方案，所述生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法包括向至少一個(gè)細(xì)胞導(dǎo)入包含分離 的包含如SEQ ID NO: 1所述的編碼紅麻GA 2-氧化酶的核苷酸序列的核 酸分子的表達(dá)載體的步驟。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植 物。
根據(jù)下面的圖、說明、實(shí)施例和權(quán)利要求將能更好地理解本發(fā)明的這 些和其它實(shí)施方案。
附圖簡(jiǎn)述
20


圖1A-B顯示在長(zhǎng)日或短日條件下生長(zhǎng)的擬南芥植物的照片。
圖1A顯 示在長(zhǎng)日條件下生長(zhǎng)的擬南芥植物；左野生型(wt)對(duì)照；中轉(zhuǎn)基因過 表達(dá)GA 20-氧化酶的植物；右轉(zhuǎn)基因沉默GA 2-氧化酶的植物。
圖1B 顯示在短日條件下生長(zhǎng)的擬南芥植物。左wt對(duì)照；右轉(zhuǎn)基因過表達(dá) GA 20-氧化酶的擬南芥。
圖2顯示野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的莖的橫切片(cross section)。在 轉(zhuǎn)基因過表達(dá)GA 20-氧化酶的植物中，觀察到維管束中和維管束之間的纖 維細(xì)胞數(shù)增加，以及纖維細(xì)胞壁木質(zhì)化的降低。
圖3顯示煙草植物的照片。顯示了野生型煙草植物和轉(zhuǎn)基因過表達(dá)GA 20-氧化酶的植物。
圖4A-C顯示野生型和轉(zhuǎn)基因GA20-氧化酶植物的莖的橫切片。過表 達(dá)GA-20氧化酶的植物的內(nèi)層韌皮部島含有纖維(圖4A和4B)，而wt植 物的節(jié)間則未觀察到纖維(圖4C)。
圖5A-C顯示野生型和GA 2-氧化酶沉默的煙草植物的照片。左轉(zhuǎn) 基因沉默GA2-氧化酶的植物；右野生型植物。轉(zhuǎn)基因沉默GA2-氧化酶 的植物長(zhǎng)于野生型植物。
圖6A-B顯示GA 2-氧化酶沉默的抹系與wt對(duì)照之間的比較。圖6A 顯示GA2-氧化酶沉默的林系與wt對(duì)照之間平均節(jié)間數(shù)、最長(zhǎng)葉的平均長(zhǎng) 度和平均高度的比較。圖6B顯示每種GA 2-氧化酶沉默植物和wt植物的 平均、最短和最長(zhǎng)高度(厘米)。
圖7顯示紅麻GA 2-氧化酶的基因組序列。
圖8顯示編碼紅麻GA 2-氧化酶的cDNA的核苷酸序列和該酶的氨基 酸序列。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述 定義
術(shù)語"基因"指編碼肽、多肽、蛋白質(zhì)或RNA分子的染色體DNA、
21質(zhì)粒DNA、 cDNA、合成DNA或其它DNA，和所述編碼序列側(cè)翼參與表 達(dá)調(diào)節(jié)的區(qū)域。
術(shù)語"核酸"指脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。所述核酸可 以是單、雙或多鏈，并可包含修飾或未修飾的核苷酸。
術(shù)語"植物"在本文使用其最廣泛的涵義。它包括但不限于木本、草 本、多年生或一年生植物的任何物種。它還指主要分化為植物發(fā)育的任何 階段存在的結(jié)構(gòu)的多個(gè)植物細(xì)胞。所述結(jié)構(gòu)包括但不限于根、莖、芽、 葉、花、花瓣、果實(shí)等。
術(shù)語"雜交"指核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的能力。當(dāng)兩個(gè)核 酸鏈中的互補(bǔ)序列彼此結(jié)合時(shí)，即發(fā)生雜交。
如本文所用，當(dāng)用于核酸序列時(shí)，術(shù)語"同源性"指至少兩個(gè)核普酸 序列之間的相似性或同一性程度?？赡艽嬖诓糠滞葱曰蛲耆葱?即， 同一性)。"序列同一性"指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列之間相關(guān)性的量度，表 示為占總比較長(zhǎng)度的百分比。同一性計(jì)算考慮那些一致的和位于各自序列 同一相對(duì)位置的核苷酸殘基。缺口，即比對(duì)中殘基存在于一個(gè)序列而不存 在于另一序列的位置，被認(rèn)為是具有不同殘基的位置。 一個(gè)廣泛使用和接 受的用來執(zhí)行序列比對(duì)的計(jì)算機(jī)程序是CLUSTALW 1.6版(Thompson等. Nucl. Acids Res.， 22: 4673-4680， 1994)。相似地，當(dāng)用于蛋白質(zhì)序列時(shí)， 術(shù)語"同源性"指至少兩個(gè)蛋白質(zhì)序列之間的相似性或同一性程度?？赡?存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。
術(shù)語"啟動(dòng)子"或"啟動(dòng)子區(qū)"指通常發(fā)現(xiàn)于編碼序列上游(5')的核酸 序列，其通過為RNA聚合酶和/或在正確位點(diǎn)起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子 提供識(shí)別位點(diǎn)控制信使RNA(mRNA)的產(chǎn)生，進(jìn)而控制所述編碼序列的表 達(dá)。如本文所預(yù)期，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)包括通過連接至各種調(diào)節(jié)序列、隨 機(jī)或控制的誘變和增強(qiáng)子序列的添加或復(fù)制產(chǎn)生的啟動(dòng)子的變體。當(dāng)作為 合適的重組載體的一部分導(dǎo)入宿主時(shí)，本文公開的啟動(dòng)子區(qū)和其生物功能 同等物負(fù)責(zé)驅(qū)動(dòng)處于其控制的編碼序列的轉(zhuǎn)錄，這可通過其產(chǎn)生mRNA的 能力證明。術(shù)語"DNA構(gòu)建體"或"表達(dá)載體"指產(chǎn)生自任何來源的，能夠進(jìn)行
基因組整合或自主復(fù)制的、包含其中已以功能上可操作方式連接了一個(gè)或
多個(gè)DNA序列的DNA分子的任何物質(zhì)，如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制 序列、噬菌體或線狀或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核苷酸序列。所述 DNA構(gòu)建體或載體能夠?qū)?'調(diào)節(jié)序列或啟動(dòng)子區(qū)和所選基因產(chǎn)物的DNA 序列導(dǎo)入細(xì)胞，其導(dǎo)入方式能使所述DNA序列轉(zhuǎn)錄成有功能的mRNA， 所述mRNA被翻譯，從而進(jìn)行表達(dá)。DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體可構(gòu)建為能 夠表達(dá)雙鏈RNA或反義RNA，以抑制所關(guān)注的特定RNA的翻譯。
術(shù)語"異源基因，，指編碼不在其天然環(huán)境的(即，已被人為改變的)多 肽或蛋白質(zhì)的基因。例如，異源基因包括來自一個(gè)物種而被導(dǎo)入另一物種 的基因。異源基因還包括生物體本身的以某種方式改變(例如，突變、以多 個(gè)拷貝加入、連接至非天然啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列等)的基因。異源基因可包 含包含植物基因的cDNA形式的植物基因序列；所述cDNA序列可以正 義(產(chǎn)生mRNA)或反義方向(產(chǎn)生與所述mRNA轉(zhuǎn)錄物互補(bǔ)的反義RNA轉(zhuǎn) 錄物)表達(dá)。
當(dāng)用于植物或果實(shí)或種子時(shí)，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"(即，"轉(zhuǎn)基因植物"或 "轉(zhuǎn)基因果實(shí)，，或"轉(zhuǎn)基因種子")指在其一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中含有至少一個(gè) 異源基因的植物或果實(shí)或種子。
術(shù)語"反義寡核苷酸"指通過RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋 白質(zhì)核酸)相互作用與靶RNA結(jié)合，并改變所述靶RNA的活性的寡核香 酸(有關(guān)綜述，參見Stein和Cheng， 1993 Science 261， 1004)。典型地，反 義分子與靶序列在所述反義分子的一段連續(xù)序列上互補(bǔ)。但是，在某些實(shí) 施方案中，反義寡核苷酸可與兩個(gè)(或甚至多個(gè))不連續(xù)靶序列互補(bǔ)。
術(shù)語"轉(zhuǎn)化"指外源核酸序列(例如，載體、表達(dá)載體)導(dǎo)入細(xì)胞或原 生質(zhì)體的過程，在所述細(xì)胞或原生質(zhì)體中，所述外源核酸摻入染色體或能 夠自主復(fù)制。
術(shù)語"再生"指從植物細(xì)胞(例如，植物原生質(zhì)體或外植體)培養(yǎng)植物 的過程。術(shù)語"基因表達(dá)"指基因內(nèi)編碼的遺傳信息通過所述基因的"轉(zhuǎn)錄"
(即，通過RNA聚合酶的酶促作用)轉(zhuǎn)化為RNA(例如，mRNA 、 rRNA、 tRNA 或snRNA)，和通過mRNA的"翻譯"轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的過程?；虮磉_(dá)可 在所述過程的許多階段被調(diào)節(jié)。"上調(diào)"或"激活"指增加基因表達(dá)產(chǎn)物(即， RNA或蛋白質(zhì))的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)，而"下調(diào)"或"抑制"指降低基因表達(dá)產(chǎn) 物(即，RNA或蛋白質(zhì))的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。參與上調(diào)或下調(diào)的分子(例如，轉(zhuǎn)錄 因子)通常分別被稱為"激活子"和"抑制子"。
術(shù)語"片段"指分別是全長(zhǎng)核酸分子或全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的一部分的多核苷 酸或多肽。
如本文所用，術(shù)語"類似物"指包含通過氨基酸置換、添加或化學(xué)修 飾改變的SEQTDNO: 2紅麻GA2-氧化酶的序列的蛋白質(zhì)。通過使用"氨 基酸置換"，即表明將序列內(nèi)的殘基置換為具有相同功能的氨基酸殘基， 造成沉默變化。例如，所述序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基可被置換為具 有相似極性的另一氨基酸，所述另一氨基酸充當(dāng)功能同等物，造成沉默變 化。此類置換被稱為保守置換。此外，只要所述類似物的酶促活性得到保 留(如果與完整紅麻GA2-氧化酶的活性相比)，也可進(jìn)行非保守置換。
本發(fā)明提供如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所述的紅麻GA 2-氧 化酶的cDNA和氨基酸序列(圖8)。本發(fā)明進(jìn)一步提供如SEQ ID NO: 3 所迷的紅麻GA2-氧化酶的基因組序列(圖7)和如SEQ ID NO: 4所述的用 于沉默GA2-氧化酶表達(dá)的DNA序列。
本發(fā)明提供包含所關(guān)注的核酸的DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體，其可進(jìn)一 步包含植物啟動(dòng)子。
文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了許多在植物細(xì)胞中具有活性的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子 包括胭脂堿合成酶(NOS)啟動(dòng)子(Ebert等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 5745-5749, 1987)、章魚堿合成酶(OCS)啟動(dòng)子、花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子如 花椰菜花葉病毒(CaMV) 19S啟動(dòng)子(Lawton等，Plant Mol. Biol. 9: 315-324， 1987)和CaMV35S啟動(dòng)子(Odell等，Nature 313: 810-812, 1985)、玄參花 葉病毒35S-啟動(dòng)子；來自核酮糖-l,5-二磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)的 光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、Adh啟動(dòng)子(Walker等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:
246624-6628, 1987)、蔗糖合成酶啟動(dòng)子(Yang等，Proc. Natl. Acad. Sd. USA. 87: 4144-4148， 1990)、 R基因復(fù)合體啟動(dòng)子(Chandler等，The Plant Celll: 1175-1183， 1989)和葉綠素ap結(jié)合蛋白基因啟動(dòng)子和類似啟動(dòng)子。這些啟 動(dòng)子已用于構(gòu)建在植物中表達(dá)的DNA構(gòu)建體。
為了在所述植物的源組織如葉、種子、根或莖中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)選的是，
本發(fā)明使用的啟動(dòng)子在這些特異性組織中具有相對(duì)高的表達(dá)。為此，可以 從許多具有組織或細(xì)胞特異性或增強(qiáng)型表達(dá)的基因啟動(dòng)子中進(jìn)行選擇。文
獻(xiàn)中已報(bào)道的所述啟動(dòng)子的實(shí)例包括豌豆葉綠體谷氨酰胺合成酶GS2啟 動(dòng)子(Edwards等，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 3459-3463， 1990)、小 麥葉綠體果糖-l,6-二磷酸酶(FBP酶)啟動(dòng)子(Lloyd等，Mol. Gen. Genet. 225: 209-216， 1991)、馬鈴薯核光合成ST-LS1啟動(dòng)子(Stockhaus等，EMBO 丄8: 2445-2451， 1989)、擬南芥絲氨酸/蘇氨酸激酶(PAL)啟動(dòng)子和葡糖淀 粉酶(CHS)啟動(dòng)子。
特異性啟動(dòng)子的表達(dá)可通過使用克隆在所述啟動(dòng)子的下游并瞬時(shí)或 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞的報(bào)告基因進(jìn)行監(jiān)控，所述報(bào)告基因如(3-葡糖醛酸糖 苷酶(Jefferson等，E廳OJ. 6: 3901-3907， 1987)、萸光素酶(LUC， Ow等， Science 234: 856-859， 1986)、綠色熒光蛋白(GFP， Sheen等，Plant J. 8: 777-784， 1995)或任何其他報(bào)告基因。報(bào)告基因活性的檢測(cè)指示所述啟動(dòng) 子在組織內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性。
所述DNA構(gòu)建體或載體還可包括與所關(guān)注的編碼區(qū)一起的，完全或 部分作用以終止所述區(qū)域的轉(zhuǎn)錄的核酸序列。例如，已分離的此類序列包 括Tr7 3'序列和NOS 3'序列(Ingelbrecht等，The Plant Cell 1: 671-680， 1989; Bevan等，NucleicAcidsRes.il: 369-385, 1983)或類似序列。
所述DNA構(gòu)建體或栽體還可包括調(diào)節(jié)元件。所述調(diào)節(jié)元件的實(shí)例包 括Adh內(nèi)含子1 (Callis等，Genes and Develop. 1: 1183-1200， 1987)、蔗 糖合成酶內(nèi)含子(Vasil等，Plant Physiol. 91: 1575-1579， 1989)、玉米hsp70 基因的第 一個(gè)內(nèi)含子(第5,362,865號(hào)美國(guó)專利)和TMV Q元件(Gallie等， The Plant Celll: 301-311， 1989)。適當(dāng)時(shí)可包括這些和其它調(diào)節(jié)元件。
所述DNA構(gòu)建體或載體還可包括可選擇的標(biāo)記。可選擇的標(biāo)記可用
25于選擇含有外源遺傳物質(zhì)的植物或植物細(xì)胞。所述可選擇的標(biāo)記的實(shí)例包
括編碼卡那霉素抗性，并可使用卡那霉素G418進(jìn)行選擇的neo基因 (Potrykus等，Mol. Gen. Genet. 199: 183-188, 1985);編碼雙丙氨磷抗性 的bar基因；編碼草甘膦抗性的突變的EPSP合成酶基因；賦予溴苯腈抗 性的腈水解酶基因(Stalker等，J. Biol. Chem. 263: 6310-6314、 1988);和 抗甲氨蝶呤的DHFR基因(Thillet等，J. Biol. Chem. 263: 12500-12508， 1988)。
所述DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體還可包括翻譯增強(qiáng)子。DNA構(gòu)建體可包 含一個(gè)或多個(gè)5'非翻譯的先導(dǎo)序列，其可增強(qiáng)所述基因產(chǎn)物從得到的 mRNA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。所述序列可獲自病毒RNA、合適的真核基因或合 成基因序列和類似序列。
植物轉(zhuǎn)化
本發(fā)明DNA構(gòu)建體可用于穩(wěn)定或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中， 所述核酸分子整合至植物基因組，如此其代表穩(wěn)定的和遺傳的性狀。在瞬 時(shí)轉(zhuǎn)化中，所述核酸分子在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)，但其不整合至基因組，如 此其代表瞬時(shí)性狀。
外源DNA穩(wěn)定整合至植物基因組DNA的主要方法包括(i)農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(參見例如Klee等(1987). Annu Rev Plant Physiol 3S， 467-486; 和Gatenby, A. A. Plant Biotechnology,第93-112頁(1989) S. Kung和C. J. Arntzen編，Butterworth Publishers, Boston, Mass);禾口(ii)直4妄DNA 4爭(zhēng)牙多， 包括微注射、電穿孔和基因槍法(U.S. 6,723,897和其中的參考文獻(xiàn)，其通 過引用結(jié)合入本文，如同完全在本文中進(jìn)行描述一樣)。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移是一種廣泛適用的將基因?qū)胫参锛?xì)胞的系統(tǒng)，原 因是DNA可以導(dǎo)入完整的植物組織，從而無需從原生質(zhì)體再生完整植物。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的系統(tǒng)包括使用含有確定的整合至植物基因組DNA的DNA區(qū) 段的質(zhì)粒載體。接種植物組織的方法因植物物種和農(nóng)桿菌遞送系統(tǒng)而有所 不同。 一種廣泛使用的方法是葉盤法，其可使用任何組織的外植體執(zhí)行， 為啟動(dòng)完整植物的分化提供了良好來源。 一種補(bǔ)充方法將農(nóng)桿菌遞送系統(tǒng) 與真空滲透結(jié)合使用。農(nóng)桿菌系統(tǒng)特別適合用于生成轉(zhuǎn)基因雙子葉植物。在電穿孔中，原生質(zhì)體短暫接受強(qiáng)電場(chǎng)，打開微孔以允許DNA進(jìn)入。
在微注射中，則使用微吸管將DNA直接機(jī)械注入細(xì)胞。在基因槍法中， DNA被吸附至微射彈(microprojectile)如硫酸鎂晶體或鎢顆粒，然后所述微 射彈;故物理加速至細(xì)胞或植物組織。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)化之后，植物即進(jìn)行繁殖。植物繁殖最普通的方法是通過種子。 但是，通過種子繁殖進(jìn)行再生的缺點(diǎn)是由于雜合性而使作物不一致，因?yàn)?植物是根據(jù)孟德爾原則的遺傳變異產(chǎn)生種子的。換言之，每粒種子在遺傳 上都是不同的，每粒種子將按其自身的特異性性狀生長(zhǎng)。因此，優(yōu)選的再 生應(yīng)使再生的植物與親本轉(zhuǎn)基因植物具有同 一的性狀和特性。再生轉(zhuǎn)化植 物的優(yōu)選方法是微繁殖，該方法提供快速、 一致的轉(zhuǎn)化植物繁殖。
養(yǎng)二代植物的過程。此過程允許大量繁殖具有優(yōu)選的組織和表達(dá)融合蛋白 的植物。新生的植物與原始植物在遺傳上相同并具有所述原始植物的全部 特性。微繁殖允許在短時(shí)間內(nèi)大量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物材料，快速增殖所選的栽 培植物并保留原始轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物的特性。此植物克隆方法的優(yōu)點(diǎn)包括 植物增殖的速度和產(chǎn)生的植物的質(zhì)量和一致性。
微繁殖是需要改變不同階段的培養(yǎng)基或生長(zhǎng)條件的多階段程序。微繁 殖過程包括四個(gè)基本的階段階段一，初始組織培養(yǎng)；階段二，組織培養(yǎng) 物增殖；階段三，分化和植物形成；和階段四，溫室培養(yǎng)和鍛煉。階段一 建立組織培養(yǎng)并鑒定無污染物。階段二增殖初始組織培養(yǎng)物，直至產(chǎn)生符 合生產(chǎn)目標(biāo)的足夠數(shù)量的組織樣品。階段三切割新生的組織樣品并將其培 養(yǎng)成獨(dú)立的小植物。階段四將轉(zhuǎn)化的小植物轉(zhuǎn)移至溫室進(jìn)行鍛煉，其中植 物對(duì)光的耐受性逐漸增加，以便它們可以在自然環(huán)境下繼續(xù)生長(zhǎng)。
雖然目前優(yōu)選穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化，但是本發(fā)明也正視，例如葉細(xì)胞、分生組 織細(xì)胞或完整植物的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)化可通過上述任何直接DNA轉(zhuǎn)移方法或使用改良的植物病毒 通過病毒感染實(shí)現(xiàn)。
已顯示可用于轉(zhuǎn)化植物宿主的病毒包括花椰菜花葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)和桿狀病毒(BV)。使用植物病毒的植物轉(zhuǎn)化參見，例如，
Communications in Molecular Biology: Viral Vectors (分子生物學(xué)通訊病毒 載體)，Cold Spring Harbor Laboratory, New York,第172-189頁。
構(gòu)建植物RNA病毒以在植物中導(dǎo)入和表達(dá)非病毒外源核酸序列在本 領(lǐng)域?yàn)橐阎?，并參見上述參考文獻(xiàn)以及Dawson等(1989) Virology 〃么 285-292。
如果轉(zhuǎn)化病毒是DNA病毒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)所述病毒本身進(jìn)行 合適的修飾。可選地，所述病毒可首先克隆至細(xì)菌質(zhì)粒以便構(gòu)建需要的含 有外來DNA的病毒載體。然后可將病毒從所述質(zhì)粒上切下。如果所述病 毒是DNA病毒，則可將細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)連接至所述病毒DNA,然后細(xì)菌可 復(fù)制所述病毒DNA。所述DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯將產(chǎn)生包殼所述病毒DNA 的外殼蛋白。如果所述病毒是RNA病毒，所述病毒一般以cDNA克隆和 插入到質(zhì)粒。然后使用所述質(zhì)粒制備所有的植物基因構(gòu)建體。然后從所述 質(zhì)粒的病毒序列轉(zhuǎn)錄所述RNA病毒，然后翻譯所述病毒基因以產(chǎn)生包殼 所述病毒RNA的外殼蛋白。
已使用基于磷酸鈣沉淀、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的 方法報(bào)告了植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化(參見，例如，Marcotte等，Nature 335: 454-457, 1988)。
從單個(gè)植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子或從各種轉(zhuǎn)化外植體再生、發(fā)育和培養(yǎng)植 物在本領(lǐng)域?yàn)楣?。此再生和生長(zhǎng)過程典型地包括如下步驟選擇轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞，將所述各個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞經(jīng)胚胎發(fā)育的通常階段、經(jīng)小植物生根階段 進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因胚胎和種子的再生方式相似。然后將得到的轉(zhuǎn)基因生根 芽種植于適當(dāng)?shù)闹参锷L(zhǎng)培養(yǎng)基如土壤。
含有編碼感興趣的蛋白質(zhì)的外來的、外源基因的植物的發(fā)育或再生在 本領(lǐng)域?yàn)楣?。?yōu)選地，所述再生植物進(jìn)行自花授粉，以提供純合的轉(zhuǎn)基 因植物。否則，將獲自所述再生植物的花粉與農(nóng)藝學(xué)重要系的實(shí)生植物雜 交。相反地，用這些重要系的植物的花粉對(duì)所述再生植物授粉。使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員公知的方法培育本發(fā)明含有所需多肽的轉(zhuǎn)基因植物。
28沉默GA 2-氧化酶的表達(dá)
可使用各種干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的分子(例如，反義、siRNA、核酶或 DNA核酶)在基因組和/或轉(zhuǎn)錄物水平實(shí)現(xiàn)GA2-氧化酶的沉默。
一種能夠下調(diào)或沉默GA 2-氧化酶的物質(zhì)是RNA千擾(RNAi)過程中 的小干擾RNA (siRNA)分子。RNAi是一個(gè)兩步驟過程。在第一個(gè)起始步 驟中，輸入的雙鏈(dsRNA)被消化為21-至23-核苷酸(nt)的小干擾RNA (siRNA)，這很可能是通過dsRNA-特異性核糖核酸酶RNA酶III家族成員 Dicer的作用，其以依賴ATP的方式加工(切割)dsRNA(直接或通過轉(zhuǎn)基因 或病毒引入)。連續(xù)的切割事件將所述RNA降解為19-至21-bp的雙鏈體 (siRNA)，每個(gè)雙鏈體均具有2個(gè)核苷酸的3'突出端。
在第二個(gè)步驟(稱為效應(yīng)步驟)中，所述siRNA雙鏈體與核酸酶復(fù)合 體結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)。 RISC的激活需要所述siRNA 雙鏈體依賴ATP的解旋?；钚訰ISC然后通過堿基配對(duì)相互作用靶向同源 轉(zhuǎn)錄物并從所述siRNA的3'端將所述mRNA切割成12個(gè)核苷酸的片段。 雖然切割的機(jī)制仍未得到闡明，但是研究表明每個(gè)RISC均含有一個(gè)siRNA 和RNA酶。
由于RNAi非凡的力量，因此推測(cè)所述RNAi途徑中存在擴(kuò)增步驟。 擴(kuò)增可通過復(fù)制所述輸入dsRNA生產(chǎn)更多siRNA，或通過復(fù)制形成的 siRNA發(fā)生?？蛇x地或附加地，擴(kuò)增可通過^L大RISC的周轉(zhuǎn)事件實(shí)現(xiàn)。 有關(guān)RNAi的更多信息，參見下列綜述Cullen, B. R. (2002). RNA interference: antiviral defense and genetic tool (RNA干擾抗病毒防御和遺 傳工具).Nat Immunol 3， 597-599;和Brantl, S. (2002). Antisense隱RNA regulation and RNA interference (反義RNA調(diào)節(jié)和RNA干擾).Biochim Biophys Acta 1575, 15-25。
適合用于本發(fā)明的RNAi分子的合成可按下述方法實(shí)現(xiàn)。首先，在GA 2-氧化酶mRNA序列AUG起始密碼子下游掃描AA-雙核苷酸序列。將出 現(xiàn)的每個(gè)AA和19個(gè)3'-鄰近的核苷酸記錄為潛在的siRNA耙位點(diǎn)。優(yōu)選 地，siRNA耙位點(diǎn)選自開放閱讀框(ORF)，因?yàn)榉欠g區(qū)(UTR)更富含調(diào)節(jié) 蛋白結(jié)合位點(diǎn)。UTR-結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合體可干擾siRNA內(nèi)切核
29酸酶復(fù)合體的結(jié)合(Tusch1(2001))。但是，應(yīng)理解，靶向非翻譯區(qū)的siRNA 也可有效，這得到了 GAPDH的證實(shí)，其中靶向5' UTR的siRNA介導(dǎo)細(xì) 胞GAPDH mRNA下降約90%并完全消除了蛋白質(zhì)水平。
第二，使用任何序列比對(duì)軟件將潛在的靶位點(diǎn)與適當(dāng)?shù)幕蚪M數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行比較，所述序列比對(duì)軟件如可獲自NCBI服務(wù)器的BlastN軟件 (www.ncbi.nhn.nih.gov/BLAST/)。過濾掉與其它編碼序列具有顯著同源性 的假定靶位點(diǎn)。
選擇合格的耙序列作為siRNA合成的模板。優(yōu)選的序列是包含低G/C 含量的序列，因?yàn)橐炎C明與包含高于55%的G/C含量的序列相比，這些序 列可更有效地介導(dǎo)基因沉默。優(yōu)選沿所述耙基因長(zhǎng)度選擇幾個(gè)靶位點(diǎn)以供 評(píng)估。為了更好地評(píng)估所選的siRNA，優(yōu)選同時(shí)使用陰性對(duì)照。陰性對(duì)照 siRNA優(yōu)選地包括與所述siRNA相同的核苷酸組成，但是與基因組缺乏顯 著的同源性。因此，優(yōu)選地使用合成的siRNA核苷酸序列，條件是其未顯 示出與任何其它基因具有任何顯著的同源性。
本發(fā)明提供設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生靶向紅麻GA 2-氧化酶的siRNA的DNA構(gòu) 建體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述DNA構(gòu)建體包含
(a) 至少 一個(gè)可操作地連接至的植物啟動(dòng)子；
(b) 編碼形成雙鏈RNA的RNA序列的多核苷酸序列，其中所述多 核苷酸序列包含與所述GA2-氧化酶的正義核苷酸序列或其片 段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核 苷酸序列，和與所述GA2-氧化酶的正義核苷酸序列的互補(bǔ)序列 或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核香酸的第 二個(gè)核香酸序列；和任選地
(c) 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明所述的DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)為表達(dá)莖環(huán)RNA， 其除了所述第一個(gè)(正義)和所述第二個(gè)(反義)核苷酸序列外，還進(jìn)一步包含 間隔子多核苷酸序列，所述間隔子多核苷酸序列位于編碼所述第一個(gè)和所 述第二個(gè)核苷酸序列的DNA區(qū)域之間。所述間隔子多核苷酸序列的長(zhǎng)度可根據(jù)所述莖環(huán)RNA的特異性結(jié)構(gòu)而有所不同。典型地，所述間隔子長(zhǎng)
度與所述第一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列長(zhǎng)度的比值在1:5至1:10范圍內(nèi)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)靶向紅麻GA 2-氧化酶的siRNA的DNA構(gòu)建體包含
(a) 至少 一個(gè)可操作地連接至的植物啟動(dòng)子；
(b) 編碼以莖環(huán)形式形成雙鏈RNA的RNA序列的多核苷酸序列，其中所述雙鏈RNA包含與所述GA 2-氧化酶的正義核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列；與所述GA2-氧化酶的正義核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段具有至少卯％同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核苷酸序列；
(c) 連"t妄所述第一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列的間隔子序列；和任選地，
(d) 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述間隔子包含產(chǎn)生自本領(lǐng)域已知的基因內(nèi)含子的核苷酸序列，以增強(qiáng)siRNA的產(chǎn)生。
本發(fā)明雙鏈RNA的第 一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列可以是所述GA 2-氧化酶基因的片段，可以是全長(zhǎng)基因、非編碼區(qū)或其部分或其組合。
如本文所用，RNA分子的核苷酸序列可通過參考序列表的DNA核苷酸序列鑒定。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，所指是RNA還是DNA取決于上下文。此外，除T-堿基在RNA分子中被置換為尿嘧啶(U)外，所述核普酸序列是相同的。
根據(jù)某些實(shí)施方案，設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)靶向GA2-氧化酶的siRNA或其片段的DNA構(gòu)建體、所述DNA構(gòu)建體的第二個(gè)(反義)核苷酸序列的長(zhǎng)度主要由所述第 一個(gè)(正義)核苷酸序列的長(zhǎng)度確定，并可與后一序列的長(zhǎng)度相符。但是，可以使用長(zhǎng)度具有約10%差異的反義序列。
設(shè)計(jì)用于生產(chǎn)siRNA的DNA構(gòu)建體的第一個(gè)和第二個(gè)核苷酸序列可以是任何長(zhǎng)度，只要所述序列包含至少20個(gè)連續(xù)核苷酸。因此，所述第一個(gè)和所述第二個(gè)核普酸序列可包含GA 2-氧化酶基因的片段或全長(zhǎng)的GA2-氧化酶基因。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述核苷酸序列的長(zhǎng)度是20個(gè)核苷酸至1,200個(gè)核苷酸。
根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明DNA構(gòu)建體產(chǎn)生的siRNA的目標(biāo)是沉默GA 2-氧化酶基因的片4殳，包括GA 2-氧化酶的編碼區(qū)。
根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第一個(gè)核苷酸序列包含與SEQ 1DNO: 1所述核苷酸序列或其片段具有90%同一性、合適地95%或100%同一性的核普酸序列。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述第一個(gè)核苷酸序列由如SEQID NO: 4所述的序列組成。
根據(jù)另一優(yōu)選的實(shí)施方案，所述第二個(gè)核苷酸序列包含與如SEQ IDNO: 1所述的核酸分子的互補(bǔ)鏈或其片段具有90%同一性、合適地95%或100%同一性的核苷酸序列。根據(jù)某個(gè)實(shí)施方案，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 4所述的序列互補(bǔ)。
根據(jù)某些實(shí)施方案，所述第一個(gè)和所述第二個(gè)核苷酸序列可操作地連接至同一啟動(dòng)子。所轉(zhuǎn)錄的鏈至少是部分互補(bǔ)的，其能夠形成dsRNA。根據(jù)其它的實(shí)施方案，所述第一個(gè)和所述第二個(gè)核苷酸序列轉(zhuǎn)錄為兩個(gè)單獨(dú)的鏈。當(dāng)由此產(chǎn)生dsRNA時(shí)，待轉(zhuǎn)錄的DNA序列的側(cè)翼具有兩個(gè)啟動(dòng)子，一個(gè)控制所述第一個(gè)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，而另一個(gè)控制所述第二個(gè)，即互補(bǔ)核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。這兩個(gè)啟動(dòng)子可相同或不同。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所述第 一個(gè)和所述第二個(gè)核香酸序列可操作地連接至同 一啟動(dòng)子。
能夠沉默GA 2-氧化酶的另一物質(zhì)是能夠特異性切割GA 2-氧化酶的mRNA轉(zhuǎn)錄物或DNA序列的DNA核酶分子。DNA核酶是能夠同時(shí)切割單鏈和雙鏈靶序列的單鏈多核苷酸(Breaker等(1995) Curr Biol 2, 655-660;Santoro等(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94， 4262-4266)。已提出了 DNA核酶的通用才莫型("10-23"模型)。"10-23" DNA核酶具有15個(gè)脫氧核糖核苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，所述催化結(jié)構(gòu)域側(cè)翼是兩個(gè)各自為7至9個(gè)脫氧核糖核普酸的底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域。此類DNA核酶可在噪呤:嘧啶連接點(diǎn)有效切割其底物RNA(有關(guān)DNA核酶的綜述，參見Khachigian (2002) Curr OpinMolTher4, 119-121)。
32構(gòu)建和擴(kuò)增合成的、加工的識(shí)別單鏈和雙鏈靶切割位點(diǎn)的DNA核酶
的實(shí)例參見第6,326,174號(hào)美國(guó)專利(Joyce等)。
沉默GA 2-氧化酶也可通過使用能夠與編碼所述GA 2-氧化酶的mRNA轉(zhuǎn)錄物特異性雜交的反義寡核苷酸來實(shí)現(xiàn)。
應(yīng)理解，存在根據(jù)熱力學(xué)周期鑒定與其靶mRNA具有最高預(yù)測(cè)結(jié)合親和力的那些序列的算法，所述熱力學(xué)周期同時(shí)考慮所述耙mRNA和所述寡核香酸的結(jié)構(gòu)變化能量學(xué)(參見，例如，Walton等(l999) BiotechnolBioeng65， 1-9)。
此外，還公布了使用體外系統(tǒng)設(shè)計(jì)和預(yù)測(cè)特異性寡核苷酸的效力的幾種方法(Matveeva等(1998). Nature Biotechnology 16, 1374-1375)。
因此，目前的共識(shí)是，如上所述，反義技術(shù)領(lǐng)域最近的發(fā)展導(dǎo)致了高度精確的反義設(shè)計(jì)算法和多種寡核苷酸遞送系統(tǒng)的產(chǎn)生，使得普通的技術(shù)人員能夠設(shè)計(jì)和實(shí)現(xiàn)適合下調(diào)基因序列的表達(dá)的反義方法，而無需執(zhí)行過量試驗(yàn)和誤差實(shí)驗(yàn)。
能夠下調(diào)GA 2-氧化酶的另一物質(zhì)是能夠特異性切割編碼GA 2-氧化酶的mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子。核酶越來越多地用于通過切割編碼感興趣的蛋白質(zhì)的mRNA序列特異性地抑制基因表達(dá)(Welch等(1998) Curr OpinBiotechno19, 486-496)?？梢栽O(shè)計(jì)切割任何特異性靶RNA的核酶，這使得核酶同時(shí)成為基礎(chǔ)研究和治療應(yīng)用的寶貴工具。
調(diào)節(jié)細(xì)胞中GA 2-氧化酶基因的表達(dá)的另一方法是通過三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸(TFO)。近期的研究顯示，可設(shè)計(jì)以序列特異性方式識(shí)別和結(jié)合雙鏈螺旋DNA中的多聚噪呤或多聚嘧咬區(qū)域的TFO。這些識(shí)別原則列于Maher III等(1989) Science 245， 725-730; Cooney等(1988) Science 241，456-459)。寡核苷酸修飾(如引入嵌入劑和主鏈置換)和結(jié)合條件(例如，
p_tl ，口「t)丙"n乂叉)ET"7L1L^1貝7J丁凡/J艮丄fU ^S"'f王日3閣,1'早*于,7口吧^R，斤，口不穩(wěn)定，最近顯示，合成的寡核苷酸可以靶向特異性序列(有關(guān)近期的綜述，
參見Seidman等(2003) J Clin Invest 112, 487-494)。
因此，可設(shè)計(jì)針對(duì)GA 2-氧化酶調(diào)節(jié)區(qū)域中的任何給定序列的三鏈結(jié)構(gòu)序列。三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸優(yōu)選地長(zhǎng)至少19、更優(yōu)選地25、更優(yōu)選地30 或更多個(gè)核苷酸，最高為50個(gè)堿基對(duì)。
應(yīng)理解，任何本發(fā)明所述沉默核苦酸序列可包含至少一個(gè)2'-糖修飾、 至少 一個(gè)核酸堿基修飾和/或至少 一個(gè)磷酸主鏈修飾。
基因表達(dá)的下調(diào)指靶基因(即，GA 2-氧化酶基因)的蛋白質(zhì)和/或 mRNA產(chǎn)物水平的下降或缺失。下調(diào)的結(jié)果可通過檢查所述細(xì)胞或植物的 外在特性或通過生物化學(xué)方法確認(rèn)，所述生物化學(xué)方法如RNA溶液雜交、 核酸酶保護(hù)、Northern雜交、反轉(zhuǎn)錄、使用微陣列監(jiān)控基因表達(dá)、抗體結(jié) 合、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測(cè)定(RIA)和熒 光激活細(xì)胞分析(fluorescence activated cell analysis, FACS)。對(duì)于細(xì)胞中 RNA介導(dǎo)的抑制，可使用其蛋白質(zhì)產(chǎn)物易于測(cè)定的報(bào)告或藥物抗性基因方 便地測(cè)定基因表達(dá)。
本發(fā)明公開的包含沉默核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因植物可用于生產(chǎn)紙、紡織 品、索、麻袋(sack)、木材、家具和類似物品的各種行業(yè)。
實(shí)施例
材料和方法 植物
擬南齊^4raZ),tfo/w7's (L.))Heynh. Columbia生態(tài)型
煙草(7V7co"a"a toksrc扁L.) samsun NN栽培變種
紅麻-報(bào)6/scMs c""朋6/湖51 L Tainung 2栽培變種
農(nóng)才干菌(y4groZx3cfen."ffl g/^de"5p菌才朱
GV3101 -用于轉(zhuǎn)化紅麻、擬南齊和煙草(Hellens等(2000) Trends Plant Sci 5: 446-451)?？股乜剐岳Ｆ胶蛻c大霉素。
細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基
細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基按前述方法配制(Sambrook等(1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)).Cold Spring Harbor:
34Cold Spring Harbor Laboratory Press)。對(duì)于固體培養(yǎng)基，添加1,5% w/v瓊 脂。添加的抗生素終濃度為氨節(jié)青霉素]00叱/ml、卡那霉素50昭/ml (用 于細(xì)菌)和100-250 pg/ml(用于植物)、壯觀霉素100貼/ml、利福平100昭/ml 和慶大霉素10(Vg/ml。
植物生長(zhǎng)培養(yǎng)基
Murashige & Skoog - MS
每升4.4g MS #M0222 (Duchefa Biochemic B. V., The Netherlands)培養(yǎng)基和 15g蔗糖。使用IN KOH將pH調(diào)節(jié)至5.8。對(duì)于固體培養(yǎng)基，添加0.6% w/v 植物瓊脂弁P 1001 (DuchefaBiochemicB.V., TheNetherlands)。添加的抗生素 (如果需要)終濃度為卡那霉素100-250貼/ml、潮霉素15貼/ml和G418 15 (xg/ml。
引物
引物序列(5，+3，)目標(biāo)用途
CaMV35S 啟動(dòng)子末端CAAGACCCTTCCTCTATATAAG SEQ ID NO:5鑒定CAMV35S 啟動(dòng)子的存在
NOS i冬止子反向TTATCCTAGTTTGCGCGCTA SEC ID NO:6鑒定NOS終止子 的存在
M13 -20TGTAAAACGACGGCCAGT SE(3IDNO:7通用引物
35M13-21AACAGCTATGACCATGATTACG SE<3 ID NO:8
GM035S反向GCTCCTACAAATGCCATCA SE<) ID NO:9鑒定CAMV35S啟動(dòng)子 陽性轉(zhuǎn)基因植物
GM035S正向GATAGTGGGATTGTGCGTCA SEQIDNO:IOAT-GA20Hope5'ATGGATCCTATGGCCGTAAGTTTCGTA ACAAC SEQIDNO:llpBinPlus克隆(Bamffl和 EcoRI)
AT-GA20Hope3，ACGAATTCGGTTAGATGGGTTTGGTGAGCCAA TCTG SEQIDNO:12AT-GA20Over5'GGTCTAGAATGGCCGTAAGTTTCGTAACAAC SEQIDNO:13pBIN-GFP克隆(XbaI)
AT-GA20Over3' -stopCCTCTAGAGATGGGTTTGGTGAGCC SE()IDNO:14AT-gA20Over3' +stopCCTCTAGATTAGATGGGTTTGGTGAGCC SE(JIDNO:]5ATGA2ClaKpnCCATCGATGGTACCCCTGAAAGTTCCCGGGCT TTTG SEQIDNO:16pKannibal克隆
ATGA2BamHI-EcoRICGGGATCCCGGAATTCCGCAATGGCGGTATTG TCTAAACC SE(3IDNO:17GA2TABAC正義 5，ACTCGAGAGATTOGATTTGGTGAGC SEQIDNO:18pKamiibal克隆
GA2TABAC反義AATCGATAACCTGCAATGAGTCACC SE(3IDNO:19GA2TABAC正義 35AGGTACCAACCTGCAATGAGTCACC SEQIDNO:20GA2TABAC反義 3，GTCTAGAAGATTGGATTTGGTGAGC SEQIDNO:215'紅麻反義GATCGATGCAGAGTCACTCTGCTCGTCC SEQ ID NO:22pKaimibal克隆
3'紅麻正義CGGTACCCCAGAGTCACTCTGCTCGTCC SEQ ID NO:235'紅麻反義GTCTAGAGGTGATCAACCATGGGGTTCCC SEQ ID NO:243'紅;眛正義CCTCGAGGGTGATCAACCATGGGGTTCCC SEQIDNO:25GA2紅麻巢式GGGCAGCCCAAACCTTATGG SEQ ID NO:26紅麻GA2-氧化酶基因的 巢式引物
GA2紅麻5，ATGGTGTTATTATCAAAACCTGGAATTG SE(JIDNO:27紅麻GA2-氧化酶基因的 引物
GA2紅麻3'GCCTAAAAGATAGAGAGATTATGAGGCAGC SE(J IDNO:28反向1紅麻 GA2CCATGGGAACCCCATGGTTGATCAC SE(JIDNO:29反向PCR分離紅麻 GA2-氧化酶的引物
反向2紅麻 GA2GCGGCAAAGAGAAGAACTCGGTGGC SE( IDNO:30反向3紅麻 GA2CAGGCTGAACCATTACCCTCCATGCCC SEQID戮31反1S7 4 EL淋 GA2CuAuAA i j i uA丄i utvjA 111 uuuuAvi。 SEQBDNO:32紅麻簡(jiǎn)并5'TGYGARGARTTYGGYTTYTTYAARG SECJIDNO:33分離紅麻GA2-氧化酶的 簡(jiǎn)并引物 5'有256個(gè)置換 3'有512個(gè)置換
紅麻簡(jiǎn)并3'GGRTCDGTRTGYTCNCGRAANCC SEC ID NO:3436分子程序
標(biāo)準(zhǔn)DNA分子技術(shù)根據(jù)Sambrook等(如上)和Ausubel等(Protocols in Molecular Biology (分子生物學(xué)方案).(1987) New York, NY: John Wiley 和Sons)進(jìn)行。
質(zhì)粒DNA制備
根據(jù)Alkaline Lysis Miniprep (堿性裂解小量制備法)(Sambrook等， 如上)提取用于常規(guī)操作和測(cè)序的質(zhì)粒DNA。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
PCR用于基因擴(kuò)增、基因檢測(cè)和克隆。除非另外指出，否則反應(yīng)條件 如下5-100ng模板DNA、 0.05mMdNTP、 7.5(xM各個(gè)引物、lOmMTrispH 8.8、 50mMKCl、 0.08%諾乃洗滌劑(Nonidet )P40、 1.5mMMgCl2、 O.lmg/ml BSA和0.125-.05pl Taq DNA聚合酶，終體積25^1。反應(yīng)條件為94。C保 持10分鐘，然后是30個(gè)循環(huán)的94。C保持1分鐘、54。-62。C保持1分鐘和 72匸保持3分鐘，最后一步是72。C保持10分鐘。
測(cè)序和序列分析
DNA測(cè)序通過Sanger (Sanger F. (1981) Science 214:1205-1210)的雙脫 氧核苷酸鏈終止法執(zhí)行，使用焚光DNA自動(dòng)測(cè)序儀。數(shù)據(jù)庫(kù)的同源性搜 索使用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心的基本局部比對(duì)搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)執(zhí)行。使用Clustal W分析核苷酸和氨基酸序列。
才直物DNA分析
微量DNA分離
DNA提取緩沖液0.35M山梨醇、0.1M Tris-HCl pH畫7.5、 5mMEDTA。 使用前加入0.02M亞硫酸氬鈉。
核裂解緩沖液0.2MTrispH-7.5、 50mMEDTA、 2MNaCl、 2%CTAB。
提取緩沖液混合物-1體積DNA提取緩沖液、1體積核裂解緩沖液、 0.4體積5。/。十二烷基肌氨酸鈉(w/v,溶于ddH20)。
一百毫克取自頂端分生區(qū)的新鮮葉片冷凍，在液氮中用木制牙簽研磨。然后將研磨后的組織與400 ^1提取緩沖液混合物勻漿，渦旋1分鐘。
然后將勻漿的混合物在65。C孵育40分鐘。溶胞產(chǎn)物用l:i體積比氯仿抽 提一次。將管渦旋5分鐘，然后在Eppendorff離心機(jī)中15,000g離心5分 鐘。向DNA沉淀的水相加入2/3體積的異丙醇和0.1體積的3MNaOAC pH 6。將管在-20。C下孵育30分鐘，然后20,000g、 4。C離心30分鐘。DNA沉 淀(pellets)用70%乙醇洗滌一次，用100^1 ddH20溶解。
DNA印跡分析
限制酶切消化、瓊脂糖凝膠電泳、DNA印跡、雜交和放射自顯影基本 根據(jù)Bernatzky和Tanksley (Plant Mol. Biol. Rep. 4: 37-41 ， 1986)和Sambrook
等(如上)執(zhí)行。
引物標(biāo)記混合物
TM-0.25MTrispH8、 0.025MMgC12、 0.005M DTT (儲(chǔ)存于4°C)
OL -于TE中的90單位/ml的六脫氧核苷酸(Boehringer Mannheim)(儲(chǔ)存 于畫20。C)
DTM —于TM中的O.lmM dATP、 dGTP和dTTP (儲(chǔ)存于-20。C) LS - 500jil HEPES 1M pH 6.6、 500^1 DTM、 140^1 OL (儲(chǔ)存于-80。C)
40嗎基因組DNA使用需要的限制酶消化，使用供應(yīng)商推薦的緩沖液，
反應(yīng)體積150[il,并加入終濃度4mM的亞精胺和終濃度100pg/ml的RNA
酶A。消化后的DNA片段使用NEB緩沖液(0.1M Tris堿、10mM EDTA
pH-8.1、 126 mM醋酸鈉)在0.5嗎/ml溴化乙錠預(yù)染色的1%瓊脂糖凝膠上
分離。電泳后，凝膠在紫外燈下拍照。進(jìn)行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移之前，紫外(254nm)
照射斷裂DNA，持續(xù)3分鐘。內(nèi)含DNA的瓊脂糖凝膠在變性液(lMNaCl、 n《A/f >j。r u、rb toi玄1《，kFkf 狄'isi ^盆d/ j-r ,:i、:夂2 、》 々i、 p^J^6fr;^ f古
脂糖凝膠在中和液(1.5MNaCl、 0.5MTrispH7)中孵育另外1.5小時(shí)，然后 用ddH20洗滌2次。使用20 X SSC將DNA印至Hybond W (Amersham-Biosciences, Sweden)膜上，保持20小時(shí)。用2XSSC洗滌印膜 (Blot)并千燥。使用下述方案用P"dCTP標(biāo)記探針在加入llplLS、 5plBSA(lmg/ml)、 5^1 dCTP和l^il克列諾片段DNA聚合酶(總體積40 pl)之前，將約50ngDNA在18^1 ddH20中煮沸5分鐘，立即在水上冷卻。所述標(biāo)記混合物在37 。C孵育1小時(shí)，使用ProbeQuant G50微量離心柱(Amersham)除去未摻入的核苷酸。
預(yù)雜交和雜交
預(yù)雜交和雜交使用塑料/玻璃管在回轉(zhuǎn)式振蕩培養(yǎng)箱(25rpm, 65°C )中執(zhí)行。膜在含有0.263MNa2HPO4、 7% SDS、 lmM EDTA、 1% BSA的45ml雜交緩沖液中預(yù)雜交2小時(shí)(20ml預(yù)雜交緩沖液足夠用于一塊20cm x10cm的印膜)。探針在沸水中變性10分鐘，然后將其加入30ml雜交緩沖液中。雜交在回轉(zhuǎn)式振蕩儀、65。C下過夜執(zhí)行。然后將膜在0.263MNa2HP04、1%SDS中，20分鐘，65°C洗滌一次，然后用2 X SSC、 0.1% SDS，20分鐘洗滌一次，第三次用IX SSC、 0.1% SDS洗滌20分鐘。然后輕輕干燥膜，用塑料包裝，使用Kodak增強(qiáng)屏(intensifier screen)在-80。C對(duì)Kodak Bio max-MS X射線膠片曝光24-72小時(shí)。
才直物RNA分析
小量制備RNA分離
葉片或種子使用研缽和研杵在液氮中研磨。最多150mg樣品使用SV總RNA分離試劑盒#23200 (Promega, USA)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行總RNA分離。
沉默質(zhì)粒的構(gòu)建
使用pKannibal載體(Wesley等Plant J. 27: 581-590， 2001)沉默擬南芥、煙草和紅麻的GA2-氧化酶。使用Kannibal引物從各個(gè)植物中PCR克隆兩個(gè)互補(bǔ)片段。正義片段使用Kpnl和Xhol克隆，反義片段使用Clal和Xbal克隆。將所迷正義和反義方向克隆至pKannibal載體。使用Wort消化含有正義和反義片段的pKannibal,然后將其亞克隆至雙元載體pArt27 (Gleave,A.P. Plant MolBiol 20: 1203-1207， 1992)。將得到的構(gòu)建體通過電穿孔導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101。
過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
39因組擬南芥GA20-氧化酶基因分別克隆至pBinPlus和pNoga (后者是含有GFP基因的pBinl9+變體)的3SSQ啟動(dòng)子和Nos終止子之間，所述35SQ啟動(dòng)子含有翻譯增強(qiáng)子信號(hào)，所述Nos終止子分別加有N末端Myc和C末端GFP標(biāo)簽。將得到的構(gòu)建體電穿孔導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101。使用這些農(nóng)桿菌菌抹轉(zhuǎn)化擬南芥、煙草和紅麻植物。
植物轉(zhuǎn)化
擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
轉(zhuǎn)化通過浸蕾法(floral dip) (Clough等，Plant Journal 16: 735-743、1998)執(zhí)行。簡(jiǎn)單而言培養(yǎng)植物至開花。在轉(zhuǎn)化日剪去角果和花。將攜帶所述雙元載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物用5%蔗糖溶液重懸至OD600=0.5。浸蘸之前，加入濃度為0.05%的Silweet L-77并充分混合。將植物的地上部分在農(nóng)桿菌溶液中浸2-3秒并輕輕搖動(dòng)。將浸過的植物置于覆蓋的盤中24小時(shí)，以保持生長(zhǎng)室的濕度并避免接觸過多的光。正常培養(yǎng)植物至種子成熟。收獲干燥的種子，在含有5(Vg/ml卡那霉素的MS平板上選擇轉(zhuǎn)化子。將假定的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移至土壤。
煙草穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
煙草samsun NN栽培變種植物按前人方法轉(zhuǎn)化(Horsh等Cold SpringHarb Symp Quant Biol 50: 433-437， 1985)。簡(jiǎn)單而言，在含有固體(0.6%植物瓊脂，Duchefa， The Netherlands) MS培養(yǎng)基的Magenta盒中在無菌條件下培養(yǎng)煙草植物。將葉片剪成小的長(zhǎng)方形，切口對(duì)著主脈。含有所需載體的農(nóng)桿菌的過夜培養(yǎng)物用MS液體培養(yǎng)基稀釋至終OD600為0.5,將所述葉片在其中孵育20分鐘。用無菌紙吸干后，將所述葉片在添加2mg/ml激動(dòng)素和0.8mg/ml IAA(Sigma)的固體MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2-3天。然后將
所述葉片轉(zhuǎn)移至含有2mg/ml激動(dòng)素、0.8mg/ml IAA、 400 mg/L凱福隆和inomff/mi "^刃i5雪妄frft f5W太ivrs這1A 在新閣；I泉會(huì)^;紐紐產(chǎn)^^玄S ^f芻芏士吞l
基，直至芽再生。然后將再生芽轉(zhuǎn)移至添加100mg/L卡那霉素和400 mg/Lclaforn的固體MS培養(yǎng)基。將在存在100mg/L卡那霉素下生根的再生芽進(jìn)行盆栽，轉(zhuǎn)移至25"C生長(zhǎng)室。通過PCR或DNA印跡分析檢驗(yàn)陽性的卡那霉素抗性植物中的插入基因的存在。
40瞬時(shí)表達(dá)分析
雙元載體克隆通過電穿孔導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌林GV3101。農(nóng)桿菌細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中28。C培養(yǎng)過夜，用VIR誘導(dǎo)培養(yǎng)基(50mM MES pH 5,6、 0.5% (w/v)葡萄糖、1.7mM NaH2P04 、 20mM NH4Cl 、 1.2mM MgS04 、 2mM KC1 、 1 7jliMFeS04、 70^M CaCl2和200nM乙酰丁香酮)稀釋，另外培養(yǎng)6小時(shí)至OD600達(dá)到0.4-0.5。然后將所述農(nóng)桿菌培養(yǎng)物稀釋至終OD60Q為0.2,將所述懸浮物用無針(needless)注射器注入煙草和紅麻植物的葉片。在共聚焦顯微鏡下觀察葉片的GFP表達(dá)。
組織制備和顯微鏡檢查
手動(dòng)將莖組織切為1至3 mm厚的切片。所述切片在室溫下用于90%乳酸中的0.4。/。的間苯二酚藍(lán)溶液(PolyScience, Niles， IL)染色約2秒，然后用自來水漂洗至洗去殘留顏色。隨后，將所述切片轉(zhuǎn)移至50%乳酸鈉在透射白光下進(jìn)行顯微分析(Aloni和Barnett， Planta 198: 595-603， 1996)。
紅麻GA 2-氧化酶和部分番茄GA 2-氧化酶基因分離
簡(jiǎn)并引物
對(duì)四種不同植物GA 2-氧化酶氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)(NCBl登錄號(hào)Q8LEA2、 Q9XFR9、 BAD17856.1和AAQ93035.1)。使用ClustalW鑒定高度保守的區(qū)域。使用Mac Vector軟件(Accelrys Software Inc.)反向翻譯最長(zhǎng)的最保守的區(qū)域。根據(jù)植物密碼子使用(Murray E.等，1999)減少置換。得到的筒并引物序列為
5'正向5'-TGYGARGARTTYGGYTTYTTYAARG-3'
3'反向5'陽GGRTCDGTRTGYTCNCGRAANCC-3'
反向PCR
使用簡(jiǎn)并引物(上文列出)對(duì)提耳又的紅麻和番茄基因組DNA執(zhí)行PCR。將得到的擴(kuò)增子克隆至pTZ57R/T質(zhì)粒并測(cè)序。根據(jù)此序列設(shè)計(jì)4個(gè)引物(即反向1-4,參見上文的引物列表)以擴(kuò)增PCR產(chǎn)物側(cè)翼的基因組DNA。兩個(gè)為外側(cè)引物，兩個(gè)用于隨后的PCR。反向PCR的DNA模板通過下述方法制備使用20UMsel在37 。C處理10昭紅麻基因組DNA3小時(shí)，然 后進(jìn)行乙醇沉淀。選擇Msel限制性內(nèi)切核酸酶是因?yàn)樵谒鰯U(kuò)增片段的 編碼序列中未發(fā)現(xiàn)其識(shí)別序列而被選擇。用T4DNA連接酶(4 U)在4°C重 新環(huán)化1 pg Msel處理的DNA，保持12小時(shí)，然后進(jìn)行乙醇沉淀。然后 使用所述反向引物對(duì)100 ng自連接的植物基因組DNA執(zhí)行PCR反應(yīng)。將 PCR產(chǎn)物克隆至pTZ57R/T質(zhì)粒并測(cè)序。然后在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索所述 分離的紅麻基因的同源序列。
實(shí)施例1 轉(zhuǎn)基因擬南芥系
增強(qiáng)型35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GA20-氧化酶基因轉(zhuǎn)化擬南芥植物
根據(jù)報(bào)告的擬南芥GA20-氧化酶序列(Xu等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6640-6644、 1995)設(shè)計(jì)引物。使用這些引物分離GA 20-氧化酶基因組 序列。PCR擴(kuò)增的基因的序列與045的序列相似(登錄號(hào)ATU20873)。所 克隆基因和所報(bào)告基因之間的Blast分析顯示幾個(gè)差異，但是沒有發(fā)現(xiàn)缺 口或終止密碼子。這些堿基對(duì)變化不可能是PCR反應(yīng)造成的突變，因?yàn)樗?們彼此鄰近并且以非常高的頻率出現(xiàn)，這不符合Taq聚合酶的錯(cuò)誤頻率。 從Co/ww/)/a生態(tài)型中分離045序列，將其導(dǎo)入雙元Ti質(zhì)粒pBinl9Plus。 將GA20-氧化酶基因在35S啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)之下克隆，將其N末端通過pLola 中間載體連接至Myc表位。使用農(nóng)桿菌菌林GV3101轉(zhuǎn)化擬南芥植物。通 過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)基因Tl系。隨機(jī)選擇的Tl林系 明顯高于wt對(duì)照植物。
使用GA2-氧化酶基因抑制構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥植物
根據(jù)NCBI中提交的擬南芥GA2-氧化酶序列(NCBI登錄號(hào) NMJ06491)設(shè)計(jì)引物，以分離373bp片段(SEQIDNO: 35)，其序列如下CCACTATTTCCAAGTCTTCTCAAAAGCCCGGGAACTTTCAG
將所述片段以正義和反義兩個(gè)方向克隆至pKannibal載體，位于Pdk 內(nèi)含子側(cè)翼(Wesley等，Plant J. 27: 581-590, 2001)。將此載體亞克隆至雙 元載體pArt27(Gleave, Plant Mol Biol 20: 1203-1207, 1992)。將所述栽體 電穿孔至用于植物轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101菌抹。通過在含有卡那霉素的培 養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)基因Tl系。
SEQ ID NO : 35的互補(bǔ)序列如下(SEQ ID NO : 39):
CCGGATTTTGGTATTGCTACCGGTTTAGACAATACCGCCATTG
轉(zhuǎn)基因擬南芥系的表型鑒定
種植了 GA 20-氧化酶過表達(dá)和GA 2-氧化酶沉默兩種轉(zhuǎn)化的Tl系， 采集葉樣品。提取基因組DNA，通過PCR檢驗(yàn)是否存在所述轉(zhuǎn)基因。將 所述轉(zhuǎn)基因的陽性系種植于對(duì)照野生型(wt)植物的旁邊。在植物生長(zhǎng)過程 中，分析其解剖學(xué)特性并與wt對(duì)照植物進(jìn)行比較。GA20-氧化酶過表達(dá)植 物顯示出與GA 2-氧化酶沉默植物相似的表型。在長(zhǎng)日條件下，所述轉(zhuǎn)基 因植物長(zhǎng)得更高，開花更快(
圖1A)。未檢測(cè)到構(gòu)成花序軸的節(jié)間數(shù)的顯著 差異。因此，植物生長(zhǎng)的增加可歸結(jié)于節(jié)間的變長(zhǎng)。在短日條件下，wt植 物長(zhǎng)有典型的大蓮座葉，而所述轉(zhuǎn)基因系長(zhǎng)有長(zhǎng)日條件下典型的花序軸(圖 1B)。用間苯二酚藍(lán)對(duì)莖橫切面進(jìn)行染色(鑒別纖維細(xì)胞中的木質(zhì)素)。沉默
43GA 2-氧化酶的轉(zhuǎn)基因系中的纖維具有淡藍(lán)色染色，相比之下，Wt纖維則
為深藍(lán)色，這很可能指示細(xì)胞壁中木質(zhì)素積累的降低(圖2)。此外，在所述
轉(zhuǎn)基因系中檢測(cè)到木質(zhì)部纖維數(shù)和密度大大增加。
實(shí)施例2
轉(zhuǎn)基因煙草系
擬南芥GA20-氧化酶基因在煙草植物中的異源過表達(dá)
使用與將GA20-氧化酶基因插入擬南芥的相同的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草植 物。將擬南芥GA20-氧化酶基因克隆至雙元載體pNOGA的含有翻譯增強(qiáng) 子信號(hào)的35S-Q啟動(dòng)子和GFP基因(綠色熒光蛋白)之間，所述GFP基因后 面是NOS終止子。通過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)選擇轉(zhuǎn)基因Tl系。 蛋白質(zhì)印跡分析確認(rèn)了蛋白質(zhì)表達(dá)。
使用GA2-氧化酶基因抑制構(gòu)建體轉(zhuǎn)化煙草植物
根據(jù)NCBI中提交的煙草GA 2-氧化酶序列(登錄號(hào)AB125232和 AB125233)設(shè)計(jì)引物，以分離155 bp沉默片段(SEQ ID NO: 36)，其序列 ^口下
TTCATTGCAGG
選擇的序列與所述兩個(gè)NCBI報(bào)告的煙草GA2-氧化酶家族基因互補(bǔ)。 將所述片段以正義和反義兩個(gè)方向克隆至pKannibal載體，位于Pdk內(nèi)含 子側(cè)翼。將此載體亞克隆至雙元載體pART27。將所述載體電穿孔至用于 植物轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101菌林。通過在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)選 擇轉(zhuǎn)基因Tl系。
SEQIDNO: 36的互補(bǔ)序列如下(SEQ ID NO: 40):
44CCAAATCCAATC
轉(zhuǎn)基因煙草系的表型鑒定
種植異源GA20-氧化酶過表達(dá)的T1系。切下葉片，在共聚焦顯微鏡 下觀察GFP發(fā)光。將表達(dá)GFP的系種植于wt植物旁邊。約2.5個(gè)月后， 對(duì)莖的節(jié)間執(zhí)行解剖學(xué)測(cè)量。轉(zhuǎn)化系高于對(duì)照(圖3)。檢測(cè)到三個(gè)轉(zhuǎn)基因系 和wt之間的節(jié)間數(shù)存在顯著增加，這與擬南芥中的表型相反。不過，和 在擬南芥中一樣，轉(zhuǎn)化造成節(jié)間長(zhǎng)度增加。節(jié)間長(zhǎng)度差異在最長(zhǎng)節(jié)間中更 加顯著。制備莖橫切片，間苯二酚藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。與 wt對(duì)照相比，轉(zhuǎn)化植物明顯產(chǎn)生更多的內(nèi)層韌皮部纖維(圖4)和更高的纖 維計(jì)數(shù)(表2)。與節(jié)間長(zhǎng)度的差異相符，在所述轉(zhuǎn)基因植物中鑒定了可檢測(cè) 的更高數(shù)量的發(fā)育階段節(jié)間，鑒于它們并未表現(xiàn)出在wt對(duì)照植物的相同 節(jié)間中觀察到的纖維分化(fiber initiation),因此這表明GA 20-氧化酶過表 達(dá)加快了植物生長(zhǎng)。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的木質(zhì)素減少在煙草轉(zhuǎn)基因植物中不顯 著。
將GA 2-氧化酶沉默的Tl系種植于wt對(duì)照旁邊。測(cè)量解剖學(xué)特性。 兩組之間的節(jié)間數(shù)無顯著差異，雖然四個(gè)最高的系要高出20%-60%(圖5 和6)。葉的大小也受沉默的影響。與wt植物相比，轉(zhuǎn)基因葉更長(zhǎng)，并存 在于更高的節(jié)間。
實(shí)施例3
紅麻和番茄沉默片段的分離
根據(jù)NCBI提交的多個(gè)物種的序列設(shè)計(jì)GA 2-氧化酶的簡(jiǎn)并引物，方 法參見上文"材料和方法"。使用這些引物對(duì)從紅麻和番茄的幼葉中提取 的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。低嚴(yán)格性PCR編程為使用54°C的雜交溫 度。擴(kuò)增的紅麻片段長(zhǎng)473 bp,并顯示不包括任何內(nèi)含子(參見下文)。因 此，使用其通過pKANNIBAL構(gòu)建沉默載體，方法同擬南芥和煙草。擴(kuò)增
45的番茄片段長(zhǎng)488 bp(參見下文)。對(duì)它們的翻譯和氨基酸水平的BLAST分 析證實(shí)，兩個(gè)序列均為GA 2-氧化酶片段。
紅麻擴(kuò)增片段序列(SEQ ID NO: 4)如下
AGACCCA
SEQ ID NO : 4 的互補(bǔ)序歹'J如下(SEQ ID NO : 38):
番茄擴(kuò)增片段序列(SEQIDNO: 37)如下:AAGAGCGACTCTG
SEQ ID NO : 37的互補(bǔ)序歹'J如下(SEQ ID NO : 41):
TTCCTCGCAA
實(shí)施例4
完整紅麻GA2-氧化酶基因分離
使用所述簡(jiǎn)并引物通過PCR獲得DNA片段，使用所述DNA片段設(shè) 計(jì)用于反向PCR和隨后的巢式PCR的引物，方法參見上文"材料和方法"。 將巢式PCR擴(kuò)增子克隆至pUC57R/T質(zhì)粒并測(cè)序。通過位于三個(gè)獨(dú)立的內(nèi) 含擴(kuò)增子的質(zhì)粒的三個(gè)獨(dú)立的序列驗(yàn)證所述序列。因此，鑒定了紅麻0八2-氧化酶的完整基因組序列(SEQIDNO: 3)(圖7)。
47該基因長(zhǎng)1134bp,包括多個(gè)假定的剪接變體。它與任何已知基因沒有 明顯的DNA同源性，但是在氨基酸水平與歐洲夾竹桃(A^7'ww 0/e朋tfer)的 GA20x2具有63%同源性和76%相似性。紅麻GA 2-氧化酶的cDNA核苷 酸序列(SEQIDNO: l)和氨基酸序列(SEQ ID NO: 2)顯示于圖8。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明不受上文特別顯示和描述的內(nèi)容的限 制。更確切地說，本發(fā)明的范圍由下述權(quán)利要求確定。
權(quán)利要求
1. 一種分離的核酸分子，所述核酸分子包含如SEQ ID NO1所述的編碼紅麻赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈或同源序列，其中所述同源序列與SEQ ID NO1具有至少80％的序列同一性。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述同源序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%的序列同一性。
3. 如權(quán)利要求l所述的分離的核酸分子，其中所述同源序列與SEQID NO: 1具有至少95%的序列同 一性。
4. 如權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子，其中所述同源序列與SEQ ID NO: 1具有100%的序列同一性或100%的序列同源性。
5. —種分離的紅麻植物GA2-氧化酶多肽或其類似物或片段，所述多 肽包含如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列，其中所述類似物與SEQ ID NO: 2具有至少80%的氨基酸序列同源性。
6. 如權(quán)利要求5所述的分離的紅麻GA2-氧化酶多肽，所述多肽具有 如SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列。
7. —種分離的核酸分子，所述核酸分子具有如SEQIDNO: 3所述的 編碼紅麻植物赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核苷酸序列。
8. —種雙鏈RNA分子，其下調(diào)紅麻GA 2-氧化酶基因的表達(dá)，所述 雙鏈RNA分子包含a) 包含與紅麻GA 2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少90%序 列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的所述雙鏈RNA的第一個(gè)RNA 鏈；和b) 包含與紅麻GA2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的互補(bǔ)序列或其片段具有 至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的所述雙鏈RNA的第 二個(gè)RNA鏈，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)RNA鏈能夠彼此雜交以形成所述雙鏈RNA分子。
9. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述第 一個(gè)RNA鏈與紅 麻GA2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有至少95%序列同一性。
10. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述第一個(gè)RNA鏈與 紅麻GA2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA或其片段具有100%序列同一性。
11. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述紅麻GA 2-氧化酶 基因轉(zhuǎn)錄的RNA包含如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列。
12. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述紅麻GA2-氧化酶 基因轉(zhuǎn)錄的RNA的片段包含如SEQ ID NO: 4所述的核香酸序列。
13. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述第二個(gè)RNA鏈與 同一性。
14. 如權(quán)利要求8所述的雙鏈RNA分子，其中所述第二個(gè)RNA鏈與 紅麻GA 2-氧化酶基因轉(zhuǎn)錄的RNA的互補(bǔ)序列或其片段具有100%序列同一性。
15. 如權(quán)利要求12所述的雙鏈RNA,其中所述第一個(gè)和第二個(gè)RNA 鏈各包含至少25個(gè)核苷酸。
16. —種用于生成能夠下調(diào)紅麻GA2-氧化酶基因的表達(dá)的RNA分子 的DNA構(gòu)建體，所述DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至編碼形成雙鏈RNA 的RNA序列的多核苷酸序列的植物啟動(dòng)子，所述多核苷酸序列包含(i) 包含與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有至少90% 序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列；和(ii) 包含與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段具 有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核苷酸序 列，其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)紅麻GA2-氧化酶基因的 表達(dá)。
17. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)核 苷酸序列各包含至少25個(gè)核苷酸。
18. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)核 苦酸序列各包含至少50個(gè)核苷酸。
19. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)核 苦酸序列各包含至少100個(gè)核苷酸。
20. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)核苷酸序列 與如SEQ ID NO: 1所述的核香酸序列或其片段具有至少95%序列同一性。
21. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)核苷酸序列 與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列或其片段具有100%序列同源性。
22. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)核苷酸序列 與如SEQ ID NO: 4所述的核香酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
23. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第二個(gè)核苷酸序列 與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片,殳具有至少95% 序列同一性。
24. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第二個(gè)核香酸序列 與如SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的互補(bǔ)序列或其片段具有100%序列 同源性。
25. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第二個(gè)核苦酸序列 與如SEQ ID NO: 38所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
26. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述植物啟動(dòng)子選自由 組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和發(fā)育階段特異性啟動(dòng) 子組成的組。
27. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含可選擇的標(biāo)記。
28. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含選自由增強(qiáng)子、 轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)組成的組的表達(dá)控制序列。
29. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)核 苷酸序列可操作地連接至同 一啟動(dòng)子。
30. 如權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體，其中所述第一個(gè)和第二個(gè)核 苦酸序列-皮間隔子序列隔開。
31. 如權(quán)利要求30所述的DNA構(gòu)建體，其中所述間隔子序列是內(nèi)含子。
32. —種一直物細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求8至15任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA轉(zhuǎn)化。
33. 如權(quán)利要求32所述的植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是紅麻植物細(xì)胞。
34. —種植物細(xì)胞，其經(jīng)權(quán)利要求16至31任一項(xiàng)所述的DNA構(gòu)建體 轉(zhuǎn)化。
35. 如權(quán)利要求34所述的植物細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是紅麻植物細(xì)胞。
36. —種轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一個(gè)用權(quán)利要求8至15任一項(xiàng)所述 的雙鏈RNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
37. 如權(quán)利要求36所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物。
38. —種轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一個(gè)用權(quán)利要求16至31任一項(xiàng)所 述的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
39. 如權(quán)利要求38所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物。
40. —種轉(zhuǎn)基因植物的種子，所述轉(zhuǎn)基因植物是權(quán)利要求36至39任 一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物。
41. 一種轉(zhuǎn)基因植物的莖，所述轉(zhuǎn)基因植物是權(quán)利要求36至39任一 項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物。
42. —種用于生產(chǎn)具有降低的GA 2-氧化酶基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物 的方法，所述方法包括將權(quán)利要求8至15的任一項(xiàng)所述的雙鏈RNA導(dǎo)入 所述才直物的至少 一個(gè)細(xì)胞。
43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述植物是紅麻植物。
44. 一種用于生產(chǎn)具有降低的GA 2-氧化酶基因的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物 的方法，所述方法包括將包含可操作地連接至編碼RNA序列的多核苷酸 序列的植物啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述多核苷酸 序列包含(i) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少 90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列；和(ii) 包含與編碼所述植物GA2-氧化酶的核酸分子的互補(bǔ)序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核香酸的第二個(gè)核苷酸 序列，其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)所述GA 2-氧化酶基因的表達(dá)。
45. 如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述植物選自由被子植物家族和 棵子植物家族組成的組。
46. 如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述植物屬于選自由木槿屬、楊 屬、桉屬、向日葵屬、黃麻屬和苧麻屬組成的組的被子植物家族。
47. 如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述植物選自由紅麻、向日葵、 赤桉、大麻、黃麻和苧麻組成的組。
48. 如權(quán)利要求47所述的方法，其中所述植物是紅麻植物。
49. 如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述植物是紅麻植物并且所述 DNA構(gòu)建體是權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體。
50. 如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述植物是擬南芥，并且所述第 一個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 35所述的核香酸序列或其片段具有至少 90%序列同一性，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 39所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
51. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述植物是煙草，并且所述第一 個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 36所述的核苷酸序列或其片段具有至少90%序列同一性，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 4G所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
52. 如權(quán)利要求50所述的方法，其中所述植物是番茄，并且所述第一 個(gè)核苷酸序列與如SEQ ID NO: 37所述的核苷酸序列或其片段具有至少 90%序列同一性，所述第二個(gè)核苷酸序列與如SEQIDNO: 41所述的核苷 酸序列或其片段具有至少90%序列同一性。
53. 如權(quán)利要求44所述的方法，其中導(dǎo)入DNA構(gòu)建體的所述步驟是 通過選自下述組的方法執(zhí)行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、基因槍法、花粉介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)化、植物RNA病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移 和致密胚性愈傷組織的電穿孔。
54. —種用于增加植物纖維產(chǎn)量的方法，所述方法包括將包含可操作 地連接至編碼RNA序列的多核香酸序列的植物啟動(dòng)子的DNA構(gòu)建體導(dǎo)入 至少一個(gè)植物細(xì)胞，所述多核苷酸序列包含(i) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子或其片段具有至少 90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第一個(gè)核苷酸序列；和(ii) 包含與編碼所述植物GA 2-氧化酶的核酸分子的互補(bǔ)序列或其片段 具有至少90%序列同一性的至少20個(gè)連續(xù)核苷酸的第二個(gè)核苷酸 序列，其中所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的RNA分子下調(diào)所述GA 2-氧化酶基因的 表達(dá)。
55. 如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述植物選自由被子植物家族和 棵子植物家族組成的組。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述植物屬于選自由木槿屬、楊 屬、桉屬、向日葵屬、黃麻屬和苧麻屬組成的組的被子植物家族。
57. 如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述植物選自由紅麻、向日葵、 赤才耍、大麻、黃麻和苧麻組成的組。
58. 如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述植物是紅麻植物。
59. 如權(quán)利要求54所述的方法，其中當(dāng)所述植物是紅麻植物時(shí)，所述 DNA構(gòu)建體是權(quán)利要求16所述的DNA構(gòu)建體。
60. —種反義寡核普酸，其靶向包含SEQ ID NO: 3所述的核苷酸序 列的核酸分子的區(qū)域。
61. —種編碼核酶的核普酸序列，所述核酶能夠切割由包含SEQ ID NO: 1所述的核苷酸序列的核酸分子轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
62. —種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1所述的分離的核酸分子。
63. —種植物細(xì)胞，其經(jīng)包含權(quán)利要求62所述的分離的核酸分子的表 達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
64. —種轉(zhuǎn)基因植物，其包含至少一個(gè)用權(quán)利要求62所述的表達(dá)載體 轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
65. 如權(quán)利要求64所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是紅麻植物。
66. —種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括將權(quán)利要求62所述的 表達(dá)載體導(dǎo)入植物的至少一個(gè)細(xì)胞，籍此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，籍此過表達(dá)紅 麻GA2-氧化酶。8
全文摘要
本發(fā)明提供分離的編碼紅麻(Hibiscus cannabinus)赤霉素2-氧化酶(GA2-氧化酶)的核酸序列。此外，本發(fā)明提供通過RNA干擾沉默GA2-氧化酶基因的表達(dá)以增加植物中，特別是紅麻(kenaf)中的纖維的方法。
文檔編號(hào)A01H5/00GK101489375SQ200780027639
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月23日
發(fā)明者喬納森·達(dá)揚(yáng), 羅尼·阿洛尼, 阿迪·阿弗尼 申請(qǐng)人:雷蒙特亞特特拉維夫大學(xué)有限公司