專(zhuān)利名稱(chēng)：：一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌s187的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187，其屬于微生物學(xué)中放線(xiàn)菌領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：放線(xiàn)菌是一類(lèi)高(G+C)n/。的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，由于其擁有獨(dú)特的合成多種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力引起了人們的廣泛關(guān)注。許多放線(xiàn)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有醫(yī)藥和植物保護(hù)方面的用途，已廣泛用作抗細(xì)菌、抗真菌和抗腫瘤藥物?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)的數(shù)萬(wàn)種微生物來(lái)源的生物活性物質(zhì)中，約有70%是由放線(xiàn)菌所合成的。然而隨著從土壤放線(xiàn)菌中發(fā)現(xiàn)新的天然活性物質(zhì)的減少，再加上耐性菌的不斷產(chǎn)生，海洋放線(xiàn)菌資源成為發(fā)現(xiàn)新藥的新的來(lái)源。海洋約占地球表面積的71%，其中蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，特殊復(fù)雜的海洋環(huán)境(高鹽度、高壓力、低溫及特殊的光照等)賦予海洋微生物產(chǎn)生不同于陸地微生物的特殊產(chǎn)物。在這些所謂生命的極限環(huán)境中，海洋放線(xiàn)菌已發(fā)展出獨(dú)特的代謝方式，這不僅確保其在極端環(huán)境中生存，也提供了產(chǎn)生新穎抗生素的潛力。因此，海洋環(huán)境將成為放線(xiàn)菌和放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物的重要新來(lái)源。
發(fā)明內(nèi)容為了解決現(xiàn)有放線(xiàn)菌領(lǐng)域存在的問(wèn)題，本發(fā)明利用海洋微生物資源，提供一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌，該海洋鏈霉菌對(duì)葡萄球菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母，黑曲霉和枯草芽孢桿菌等都具有良好的抗菌活性。本發(fā)明所涉及的一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌(拉丁文分類(lèi)命名Streptomyces，保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，CGMCC號(hào)2251，保藏日期2007年11月12日)分離自海泥樣品中，預(yù)處理方法為分散與差速離心法(DDC)，分離培養(yǎng)基為寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基M5，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)可溶性色素。海洋鏈霉菌S187具有廣譜抗菌活性，對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有抗菌活性。海洋鏈霉菌S187從其基因組中擴(kuò)增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，并能產(chǎn)生聚酮化合物。為進(jìn)一步對(duì)其其他的生物活性的研究機(jī)組和生物合成創(chuàng)造新的抗生素提供了基礎(chǔ)。上述的海洋鏈霉菌S187是從近海水域下20米處取得海泥樣品，采用分散與差速離心法(DDC)預(yù)處理方法及特異性的寡營(yíng)養(yǎng)分離培養(yǎng)基(M5)分離出一株海洋鏈霉菌S187。通過(guò)對(duì)16SrDNA的鑒定結(jié)合生理生化試驗(yàn)確定其種屬分類(lèi)，對(duì)六種模式菌的抗菌試驗(yàn)確定其抗菌活性，對(duì)其聚酮合酶I(PKSI)基因的擴(kuò)增確定其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。采用分散與差速離心的方法，能夠有效地打散海泥樣品中集結(jié)的顆粒，使放線(xiàn)菌及其孢子能夠有效地釋放出來(lái)；使用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基M5(只含有瓊脂和海水)，能夠避免快速生長(zhǎng)的細(xì)菌及其它放線(xiàn)菌的干擾，這與海洋環(huán)境寡營(yíng)養(yǎng)的條件是一致的。本發(fā)明的有益效果是(1)海洋鏈霉菌S187具有廣譜抗菌活性，對(duì)供試菌株金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母，黑曲霉和枯草芽孢桿菌都有很好的抗菌活性。(2)從海洋鏈霉菌S187中擴(kuò)增出的聚酮合酶I(PKSI)基因揭示了其產(chǎn)聚酮化合物的潛力。圖1表明S187在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的位置。具體實(shí)施例方式一、分離海洋鏈霉菌S187及對(duì)其進(jìn)行研究的工作步驟如下第一步菌種的分離2006年8月間從大連小平島海域水下20米處取得海泥樣品，樣品保存于冰盒中并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。樣品采用分散與差速離心(DDC)的方法，采用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基M5作為分離培養(yǎng)基，于28'C下培養(yǎng)一周，分離得到海洋鏈霉菌S187，采用Bennett培養(yǎng)基作為純化培養(yǎng)基。第二步抗菌活性抗菌活性測(cè)定培養(yǎng)基細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂，白色假絲酵母為麥芽汁瓊脂，霉菌采用察氏瓊脂。細(xì)菌于37'C培養(yǎng)24小時(shí)，真菌于32X:下培養(yǎng)48小時(shí)，采用瓊脂塊法初篩和發(fā)酵液復(fù)篩法進(jìn)行抗菌活性測(cè)定，并記錄抑菌圈的大小。供試菌株金黃色葡萄球菌(1.89)，大腸桿菌(1.797)，銅綠假單胞菌(1.2031)，白色假絲酵母(2.538)，黑曲霉(3.2915)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(括號(hào)內(nèi)為菌種編號(hào))，枯草芽孢桿菌由韓國(guó)明知大學(xué)徐胄源教授贈(zèng)送。第三步菌種鑒定提取海洋鏈霉菌S187基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16SrDNA并純化測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的Blastn程序進(jìn)行同源性比較，采用MEGA3.1軟件，用Neighbor-Joining法建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。菌株的培養(yǎng)特征和生理生化特征根據(jù)放線(xiàn)菌分類(lèi)和鑒定手冊(cè)進(jìn)行。通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)唯一與海洋鏈霉菌S187有99%同源性的鏈霉菌為5^e;tow^cesc/m"gw/ze"w's(DSM41843)，而S.Awgw/^ra/s分離自韓國(guó)鹽湖，除了16SrDNA序列外，無(wú)其他相關(guān)的研究報(bào)道。形態(tài)比較結(jié)合生理生化試驗(yàn)表明，S187與S^zw"gvv/^"^有很大區(qū)別，推測(cè)海洋鏈霉菌S187是51c/zw"gw/zera^的海洋變種。第四步聚酮合酶I(PKSI)基因的擴(kuò)增。利用兼并引物5'-CCSCAGSAGCGCSTSCTSCTSGA-3'/5'-GTSCCSGTSCCGTGSGCCTCSA-3'對(duì)聚酮合酶基因進(jìn)行擴(kuò)增，成功得到陽(yáng)性片段，進(jìn)行轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)并測(cè)序，將序列提交到GenBank得到序列號(hào)EU057563。二、海洋鏈霉菌S187采用瓊脂塊法抗菌實(shí)驗(yàn)第一步放線(xiàn)菌和供試菌株的培養(yǎng)將海洋鏈霉菌S187在Bennett培養(yǎng)基中28。C下培養(yǎng)一周，可見(jiàn)菌體生成白色孢子。取含有孢子和基底菌絲的瓊脂塊在TSB培養(yǎng)基中進(jìn)行液體培養(yǎng)，供試敏感細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色假絲酵母為麥芽汁培養(yǎng)基，霉菌采用察氏培養(yǎng)基，細(xì)菌于37t:培養(yǎng)24小時(shí)，真菌于32"下培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。第二步將供試敏感菌株接種到各自相應(yīng)的培養(yǎng)基中，方法為將固體培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至6CTC左右時(shí)加入100微升的相應(yīng)的供試菌株，混勻，冷卻至培養(yǎng)基凝固。第三步用lml槍頭取下圓柱形已培養(yǎng)好的放線(xiàn)菌，倒置于己凝固的培養(yǎng)基中。細(xì)菌于37匸培養(yǎng)24小時(shí)，真菌于32。C下培養(yǎng)48小時(shí)。觀察抑菌圈的大小。下表列出了海洋鏈霉菌S187采用瓊脂塊法初篩的抑菌圈直徑(毫米)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、海洋鏈霉菌S187采用發(fā)酵液法抗菌實(shí)驗(yàn)第一步放線(xiàn)菌和供試菌株的培養(yǎng)將海洋鏈霉菌S187在TSB液體培養(yǎng)基中28'C下培養(yǎng)一周，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分。將供試敏感菌株液體培養(yǎng)，細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，白色假絲酵母為麥芽汁培養(yǎng)基，霉菌采用察氏培養(yǎng)基，細(xì)菌于37"C培養(yǎng)24小時(shí)，真菌于32'C下培養(yǎng)48小時(shí)，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)。第二步將供試菌株接種到各自相應(yīng)的培養(yǎng)基中，方法為將固體培養(yǎng)基加熱溶化，冷卻至6(TC左右時(shí)加入100微升的相應(yīng)的供試菌株，混勻，冷卻至培養(yǎng)基凝固。第三步用lml槍頭在己凝固的培養(yǎng)基打圓柱形孔，收集放線(xiàn)菌發(fā)酵液，10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取上清液300微升加入圓柱形孔中。細(xì)菌于37。C培養(yǎng)24小時(shí)，真菌于32'C下培養(yǎng)48小時(shí)。觀察抑菌圈的大小。發(fā)酵液抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>四、海洋鏈霉菌S187的聚酮合成酶序列及分析從S187中成功擴(kuò)增出I型聚酮合酶基因PKS187，通過(guò)blastP進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，PKS187與很多鏈霉菌來(lái)源的重要抗生素的PKS基因片段具有較高的同源性，這些抗生素包括各種抗真菌、抗細(xì)菌藥物，抗結(jié)核藥物，以及抗腫瘤藥物。與其同源性最高的是最新發(fā)現(xiàn)的合成具有神經(jīng)再生功能的抗生素meridamycin的聚酮合成酶，進(jìn)一步證實(shí)了其產(chǎn)生新型聚酮類(lèi)化合物的可能性。這些序列分析的結(jié)果為進(jìn)一步分析海洋鏈霉菌S187的其它生理活性提供了線(xiàn)索。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)表明，PKS187與EpoDCPce〃w/aw2AAF62883)，AbmECRce/Zw/oswmABK32259)及JerD(戶(hù)ce〃w/o犯wABK32290)處于一個(gè)分支，而與其它鏈霉菌來(lái)源的PKSI片段進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，顯示了該序列的新穎性，為進(jìn)一步研究這段PKSI基因的水平轉(zhuǎn)移奠定了基礎(chǔ)。本研究分離的序列也為以后篩選完整的PKSI基因簇和進(jìn)一步的組合生物合成奠定基礎(chǔ)。五、海洋鏈霉菌S187和5^e;to附少c^c/zw"gw/^"w^的比較下面分別比較了海洋鏈霉菌S187和5^印tom少cayc/m"gw/zm^在抗菌活性、形態(tài)特性和生理生化特征方面的差別，結(jié)果表明，海洋鏈霉菌S187和S/re/7to/^casc^"gw/ze"^;s存在明顯差別，海洋鏈霉菌S187為一新的鏈霉菌菌株。1、海洋鏈霉菌S187對(duì)六種模式菌株都有很好的抗菌活性，而5^ptom;;c^cMmgw/zera!'s對(duì)六種模式菌均沒(méi)有活性。2、海洋鏈霉菌S187和51c/zw"gw/zm^在Bennett培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征示于下表。根據(jù)形態(tài)觀察，海洋鏈霉菌S187是一株鏈霉菌。在Bennett培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩周后，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)色素；而5*.c^"gvv/^"s&有褐色的基內(nèi)菌絲，灰色的氣生菌絲和白色的孢子產(chǎn)，并產(chǎn)生黑色素。在耐鹽性方面，海洋鏈霉菌S187只能在含0%-6%NaCl的Bennett培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在含9%和12%的Bennett培養(yǎng)基上，海洋鏈霉菌S187的生長(zhǎng)受到抑制，而51.c/m"gw/2m^在含0。/。-12。/。NaCl的Bennett的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。3、下表是海洋鏈霉菌S187和S.c/2w"gw/2e附&的生理生化試驗(yàn)結(jié)果。所做的四種生理生化實(shí)驗(yàn)中，海洋鏈霉菌S187和S.c/2""gvv/^"s/s有兩點(diǎn)顯著區(qū)別，海洋鏈霉菌S187不能水解淀粉，但是能產(chǎn)生H2S;5*.c/mwgw/^m/s能水解淀粉，但不能產(chǎn)生H2S。在唯一碳源實(shí)驗(yàn)中，海洋鏈霉菌S187比S.c/z"wgw/^m/s能更好的利用葡萄糖，D-甘露糖和鼠李糖，但是不能利用木糖和甘露醇，但是S.dzw"gw/ze似/s能利用實(shí)驗(yàn)中用到的所有唯一碳源生長(zhǎng)，能被海洋鏈霉菌S187作為唯一碳源利用最好的是鼠李糖和醋酸鹽，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，果糖，D-甘露糖和棉子糖次之，相反，S.dra"gvv/^"Ws在葡萄糖酸鹽和果糖上生長(zhǎng)的最好，在蔗糖，麥芽糖，肌醇，山梨醇，甘露醇，棉子糖和醋酸鹽上生長(zhǎng)次之。海洋鏈霉菌S187在28。C時(shí)要比在2(TC時(shí)生長(zhǎng)的更好，而海洋鏈霉菌S187在28。C和2(TC生長(zhǎng)都很好，表明海洋鏈霉菌S187對(duì)低溫有更好的耐受性，這與其從海泥中分離的環(huán)境是一致的。權(quán)利要求1、一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187；其特征是分離自海泥樣品中，預(yù)處理方法為分散與差速離心法(DDC)，分離培養(yǎng)基為寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基M5，純化培養(yǎng)基為Bennett培養(yǎng)基，海洋鏈霉菌S187有黃色的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲以及白色的孢子，不產(chǎn)可溶性色素。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187;其特征在于具有廣譜抗菌活性，對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有抗菌活性。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187;其特征在于從其基因組中擴(kuò)增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，并能產(chǎn)生聚酮化合物。全文摘要一株具有廣譜抗菌活性的海洋鏈霉菌S187，其屬于微生物學(xué)中放線(xiàn)菌領(lǐng)域。海洋鏈霉菌S187分離自近海水域水下20米處海泥樣品中，瓊脂塊法初篩證明該菌株對(duì)大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，白色假絲酵母和黑曲霉都有很強(qiáng)的抗菌活性，發(fā)酵液復(fù)篩的結(jié)果證實(shí)了良好的拮抗大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌的活性。通過(guò)對(duì)其16SrDNA的分析表明，唯一與海洋鏈霉菌S187有高達(dá)99％的同源性的放線(xiàn)菌為韓國(guó)學(xué)者分離的鹽湖菌種Streptomyceschungwhensis(DSM41843)，但為第一次從海洋樣品中得到分離。從鏈霉菌S187的基因組中成功擴(kuò)增出I型聚酮合酶(PKSI)基因，預(yù)示其具有產(chǎn)生聚酮化合物的潛在能力。文檔編號(hào)A01N63/00GK101302482SQ200710158478公開(kāi)日2008年11月12日申請(qǐng)日期2007年11月20日優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日發(fā)明者矯文策,袁文杰,趙心清申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)