專利名稱：通過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物酶在轉(zhuǎn)基因植物中增加病原體抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞的方法，其特征在于將編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列插入到植物中并且在植物中表達(dá)。本發(fā)明還涉及編碼過(guò)氧化物酶的核酸用于產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞的用途。另外，本發(fā)明涉及編碼大麥過(guò)氧化物酶的核酸序列。
由多種病原體如病毒、細(xì)菌和真菌引起的植物疾病可以一方面導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失，即在栽培植物生長(zhǎng)中大量的農(nóng)作物減產(chǎn)，另一方面還對(duì)人類食物安全性造成威脅。自上世紀(jì)起使用了化學(xué)殺真菌劑以控制真菌疾病。盡管使用這些制劑減少了植物疾病的程度，但是到目前為止還不能排除這些化合物對(duì)人類、動(dòng)物和環(huán)境的有害影響。為了將常規(guī)殺蟲劑的使用減少到最小，因此重要的是檢查多種植物對(duì)不同病原體的天然病原體防御，并且系統(tǒng)地使用遺傳工程，如通過(guò)引入外源的抗性基因或通過(guò)操作植物中內(nèi)源的基因表達(dá)，來(lái)產(chǎn)生病原體抗性植物。
抗性指的是植物預(yù)防或至少減少有害病原體的侵襲和建群的能力。
在天然存在的抗性中可以識(shí)別出不同的機(jī)制，植物用這些機(jī)制抵抗植物致病生物的建群。病原體和宿主之間的這些特異性的相互作用決定了感染過(guò)程(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，SpringerVerlag，Berlin-Heidelberg，德國(guó))。
對(duì)于品種特異性的抗性(也稱作宿主抗性)，在相容相互作用(compatible interaction)和不相容相互作用(incompatible interaction)間存在著區(qū)別。在相容相互作用中，致病性強(qiáng)的病原體和易感植物之間發(fā)生相互作用。病原體存活并且可以建立繁殖結(jié)構(gòu)，同時(shí)宿主死亡。另一方面當(dāng)病原體感染植物但是在較輕的癥狀發(fā)展之前或之后其生長(zhǎng)被抑制時(shí)，發(fā)生不相容相互作用。在后一種情況中，植物對(duì)各自病原體有抗性(Schopfer和Brennicke(1999)Pflanzenphysiologie，Springer Verlag，Heidelberg，德國(guó))。在相容相互作用和不相容相互作用中都發(fā)生了宿主對(duì)病原體的防御反應(yīng)。
基因?qū)蚣僭O(shè)(Flor(1971)Annu.Rev.Phytopathology 9275 296)已經(jīng)分別描述了相容或不相容宿主/病原體相互作用的遺傳基礎(chǔ)。品種特異性病原體識(shí)別的前提是植物的顯性或半顯性抗性基因(R基因)的產(chǎn)物和來(lái)自植物病原體的互補(bǔ)和顯性的無(wú)毒基因(Avr基因)的產(chǎn)物之間直接或間接的相互作用(Keen(1992)Annu.Rev.Genet.24447-463；Staskawicz等人(1995)Science 268661-667)。但是，如果病原體缺乏互補(bǔ)的無(wú)毒基因，那么結(jié)果是疾病發(fā)作。對(duì)于很多銹菌、黑粉菌、白粉菌以及霜霉菌侵染已經(jīng)證明了基因?qū)蚰Ｐ偷恼_性，但是沒有將其轉(zhuǎn)移到所有的宿主/寄生蟲相互作用。
但是在自然中，由于病原體快速的進(jìn)化發(fā)展，此品種特異性的抗性通常被克服(Neu等人(2003)American Cytopathol.Society，MPMI 16 No.7626-633)。相對(duì)于此，非宿主抗性提供了強(qiáng)烈的、廣泛的并且持久的保護(hù)以免受植物病原體侵害。非宿主抗性指的是病原體可以在某些植物物種中引起疾病，但是不在基因相似的植物物種中引起疾病的現(xiàn)象(Heath(2002)Can.J.Plant Pathol.24259-264)。
除了此有趣的特征，非宿主抗性的遺傳和分子生物學(xué)基礎(chǔ)到目前為止僅很少了解。有跡象表明非宿主抗性由非特異性的介質(zhì)引起，并且基因?qū)蛳嗷プ饔妙愋偷膫€(gè)體病原體蛋白質(zhì)也引起了非宿主抗性反應(yīng)(Heath(1981)Phytopathology 711121-1123；Heath(2001)Physiol.Mol.PlantPathol.5853-54；Kamoun等人(1998)Plant Cell 101413-1425；Lauge等人(2000)Plant J.23735-745；Whalen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856743-6747)。
植物病原體的植物建群僅僅很少發(fā)生的另一個(gè)原因是這樣的事實(shí)，即由于缺乏感染進(jìn)程所需的介質(zhì)和結(jié)構(gòu)，病原體不能發(fā)展感染結(jié)構(gòu)。另外，由非特異性引起或執(zhí)行的抗性屏障在病原體感染前就已經(jīng)存在，阻止了感染結(jié)構(gòu)的形成。這種抗性被稱為基礎(chǔ)抗性，或品種非特異性的抗性，通過(guò)被動(dòng)的和主動(dòng)的防御機(jī)制來(lái)維持。
通過(guò)以感染多種不同類型谷類的霉菌(禾布氏白粉菌(Blumeriagraminis))作為例子，說(shuō)明了造成植物物種或其栽培種對(duì)某些植物病原體的抗性或易感性的不同抗性機(jī)制。霉菌是子囊菌屬(Ascomycetes)的一部分，并且除了小麥和大麥外還會(huì)感染黑麥、燕麥以及多種草類。在某些情況下，造成的大麥和小麥農(nóng)作物的損失在一些情況下總計(jì)可達(dá)25％。但是通常損失在5％和15％之間。另外，霉菌還為其他病原體(感染)提供機(jī)會(huì)(灰雪霉病(gray snow mold)、麥類穎斑病(Glume blotch)、鐮孢菌枯萎癥(Fusariumhead blight))。霉感染最普遍的癥狀是主要在葉子頂端和在葉鞘上出現(xiàn)白色“霉皰狀突起(mildew pustule)”。白粉菌——禾布氏白粉菌是苛求活體營(yíng)養(yǎng)的，即它只能以活物質(zhì)為食并且不能在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。真菌以刺激其自身生長(zhǎng)的方式影響宿主的新陳代謝(Ferrari等人(2003)The Plant Journal35193-205)。霉菌僅侵襲大麥葉的表皮細(xì)胞層。真菌用入侵絲機(jī)械地和酶促地通過(guò)細(xì)胞壁侵入植物細(xì)胞，所述入侵絲是分生孢子，即無(wú)性產(chǎn)生的孢子。當(dāng)真菌的補(bǔ)給器官吸器形成時(shí)，就實(shí)現(xiàn)了對(duì)大麥葉的成功感染。吸器從植物細(xì)胞中取出養(yǎng)分，這使得未被感染的相鄰細(xì)胞要補(bǔ)償細(xì)胞養(yǎng)分的這種損失從而保持其存活。通過(guò)養(yǎng)分向損傷細(xì)胞中的流動(dòng)，真菌獲得了其自身存活一段時(shí)間的基礎(chǔ)。
霉菌作為物種包含幾種專化型(formae speciales)，?；腿Q于霉菌攻擊例如小麥還是大麥。在感染大麥的情況下稱其為大麥禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)，而在感染小麥的情況下稱其為小麥禾布氏白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)。另外，可以在多種專化型中鑒定不同的品種或致病型，宿主物種的不同的栽培種對(duì)于所述的專化型表現(xiàn)出不同的抗性。每種?；蛢H攻擊幾種植物物種并且不攻擊其他緊密相關(guān)的植物。因此稱這種為不被某些?；凸舻哪切┲参锏姆撬拗骺剐浴?br> 可以鑒別提供給大麥霉抗性的一些不同的遺傳機(jī)制。品種特異抗性基于對(duì)大麥白粉菌的抗性基因(R基因)，所述基因僅對(duì)真菌大麥禾布氏白粉菌的單獨(dú)分離菌有效，這是因?yàn)槿缟纤雒糠N單個(gè)的R基因僅識(shí)別攜帶著互補(bǔ)無(wú)毒基因的分離菌(Collins等人(2002)The Powdery MildewAccomprehensive Treatise，American Phytopathological Society，Minnesota；Peterhnsel等人(1997)Plant Cell 91397-1409)。相反的，針對(duì)幾種霉分離菌的廣泛的、品種非特異性的抗性受到單個(gè)隱性基因的調(diào)控，稱此基因?yàn)閙lo基因(Schulze-Lefert和Vogel(2000)Trends in PlantScience 5343-348)。對(duì)mlo基因效果的現(xiàn)有假設(shè)是mlo野生型蛋白質(zhì)是防御反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)子，并且此蛋白質(zhì)的缺失會(huì)因此導(dǎo)致更迅速、更強(qiáng)烈的防御反應(yīng)以引起有效的病原體防御(Collins等人(2002)，同上)。Mlo介導(dǎo)的抗性導(dǎo)致亞細(xì)胞壁添附的形成，所述亞細(xì)胞壁添附稱為乳突，直接在被稱為附著器的真菌的入侵絲下面形成。由此抑制了真菌在乳突形成階段的侵入嘗試，即沒有形成真菌養(yǎng)分補(bǔ)給及由此建立有效感染所必需的吸器。
和品種非特異性的抗性對(duì)比，在大麥對(duì)白粉菌小麥禾布氏白粉菌(Bgt)的非宿主抗性中引起了類似于用無(wú)毒型的大麥禾布氏白粉菌(Bgh)接種大麥的防御機(jī)制，所述的小麥禾布氏白粉菌攻擊小麥卻不攻擊大麥。由于非宿主抗性是強(qiáng)烈、廣泛并且長(zhǎng)期持續(xù)的，所以尤其有興趣的是鑒定負(fù)責(zé)非宿主抗性的基因。所以大麥的非宿主抗性還可以在農(nóng)學(xué)上應(yīng)用于其它宿主/病原體系統(tǒng)。因此，存在對(duì)這種植物或植物細(xì)胞的需要，即所述植物或植物細(xì)胞表達(dá)介導(dǎo)非宿主抗性的基因并因此表現(xiàn)出對(duì)真菌病原體如霉增加的抗性。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供對(duì)病原體具有增加的抗性的植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明另外的目標(biāo)是提供對(duì)不同病原體如霉具有非宿主抗性的植物或植物細(xì)胞。另外，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供促進(jìn)上述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞產(chǎn)生的方法，所述植物或植物細(xì)胞對(duì)植物病原體如霉具有增加的(非宿主)抗性。
另外，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供DNA序列，可以用所述DNA序列鑒定對(duì)病原體具有非宿主抗性的植物。
獨(dú)立權(quán)利要求的特征用來(lái)解決在說(shuō)明書中描述的這種及另外的目標(biāo)。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案通過(guò)從屬權(quán)利要求的特征來(lái)定義。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)大麥和小麥禾布氏白粉菌的相互作用引起了過(guò)氧化物酶的特異性誘導(dǎo)，所述過(guò)氧化物酶參與對(duì)霉的這一?；偷姆撬拗骺剐缘慕閷?dǎo)。
因此本發(fā)明所述的目標(biāo)基本上是通過(guò)提供產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法來(lái)解決，所述方法的特征在于將編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列插入到植物中并在植物中表達(dá)。
在本發(fā)明中，通過(guò)寡核苷酸指紋法研究來(lái)鑒定基因，與作為對(duì)照目的的大麥和bgh的相互作用相比，所述基因通過(guò)大麥和bgt的相互作用轉(zhuǎn)錄激活。此基因的表達(dá)圖式隨后通過(guò)多種分子生物學(xué)方法確定，并且確定了最強(qiáng)誘導(dǎo)的基因的全長(zhǎng)序列。隨后鑒定出此基因?yàn)檫^(guò)氧化物酶并且稱其為HvBgt1。在大麥和bgt的非宿主反應(yīng)期間僅僅24小時(shí)后HvBgt1的表達(dá)強(qiáng)烈增加，而在宿主反應(yīng)(大麥和bgh)的全部過(guò)程期間，僅觀察到了表達(dá)的少量增加(對(duì)比表5和


圖1)。
過(guò)氧化物酶是通過(guò)它將作為有機(jī)化合物分子接納體的過(guò)氧化氫還原成水的酶。過(guò)氧化物酶在細(xì)胞壁合成和生物異源物質(zhì)的解毒作用中有重要作用。在病原體感染期間產(chǎn)生了可以對(duì)植物具有副作用的活性氧類別。設(shè)想過(guò)氧化物酶酶促轉(zhuǎn)化這些活性氧類別，從而使它們無(wú)害。
因此本發(fā)明的目標(biāo)包括分離的核酸分子，其包含選自下列的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含編碼具有在SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)與在SEQ ID No.1中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交，
并且所述核酸分子編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)。
核酸序列優(yōu)選來(lái)自大麥(hordeum vulgare)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)涉及由上述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
本發(fā)明的目標(biāo)還涉及產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的植物或植物細(xì)胞的方法，其特征在于DNA序列選自下列i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或這些序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含編碼具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中描述的氨基酸序列或其片段的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，iii)與在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所描述的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交，所述DNA序列編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)，被插入到植物或植物細(xì)胞中，并在那里表達(dá)。
本發(fā)明另外的目標(biāo)涉及重組核酸分子，其在5’-3’方向包含-在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列，-有效連接到其上的上面給出的核酸序列，-任選地，有效連接到其上的在植物細(xì)胞中作用為轉(zhuǎn)錄、終止、和/或加A信號(hào)的調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明的主題還涉及依照根據(jù)本發(fā)明的方法之一產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞比野生型具有增加的病原體抗性和更高的過(guò)氧化物酶含量。
同樣，本發(fā)明的主題是在本發(fā)明中描述的核酸序列用于產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的用途。
另外本發(fā)明的主題涉及在本發(fā)明中描述的一種核酸序列用于鑒定對(duì)病原體顯示出非宿主抗性的植物的用途。
“病原體抗性”指的是減輕或削弱由病原體攻擊引起的植物的致病癥狀。癥狀可以是多種，但優(yōu)選地包括這些，即直接或間接導(dǎo)致?lián)p害了植物質(zhì)量、收成大小、用作動(dòng)物飼料或用于人類消費(fèi)的食物的適宜性，或妨礙作物的播種、栽培、收獲或加工。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“增加的病原體抗性”理解為指的是根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞受到病原體的攻擊比在其他方面同樣處理(如氣候條件和栽培條件，病原體類型等)的未轉(zhuǎn)化的野生型植物或植物細(xì)胞較不強(qiáng)烈和/或較不頻繁。病原體的侵襲優(yōu)選的至少減少到1/2，特別優(yōu)選至少減少到1/3，尤其優(yōu)選至少減少到1/5，以及最優(yōu)選至少減少到1/10，表現(xiàn)為病原體癥狀發(fā)展的減少。侵入效率為定量病原體侵襲提供了一種可能性(見實(shí)施例9)。術(shù)語(yǔ)“增加的病原體抗性”也包括已知為瞬時(shí)病原體抗性的抗性，即，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞只在有限的時(shí)期內(nèi)比各自的野生型具有增加的病原體抗性。
“病原體”可以是通常攻擊野生型植物的任何病原體，換句話說(shuō)，是真菌病原體、細(xì)菌病原體、病毒病原體和動(dòng)物病原體。優(yōu)選地，它們是真菌病原體，例如霉。但是也可以假設(shè)依照本發(fā)明所使用的序列的過(guò)表達(dá)還可以對(duì)其他病原體引起抗性。
真菌病原體或類真菌病原體(如藻界(chromista))優(yōu)選地來(lái)自根腫菌門(Plasmodiophoromycota)，卵菌門(oomycota)，子囊菌門(ascomycota)，壺菌綱(chytridiomycetes)，接合菌綱(zygomycetes)，擔(dān)子菌門(basidiomycota)，和半知菌綱(deuteromycetes)(半知菌(fungi imperfecti))。在表1中所述的真菌病原體及與它們相關(guān)的疾病以實(shí)例的方式論及，但是并不局限于此。
表1植物真菌疾病
特別優(yōu)選地，過(guò)氧化物酶賦予下列物種以抗性-根腫菌門，例如根腫病菌(Plasmodiophora brassicae)(十字花科植物根腫病)、馬鈴薯粉痂菌(Spongospora subterranea)(馬鈴薯塊莖粉痂病)、多粘霉(Polymyxa graminis)(谷類和草類的根病)；-卵菌門，例如萵苣盤梗霉(Bremia lactucae)(萵苣霜霉病)、霜霉屬(Peronospora)(霜霉病)，其在金魚草中(金魚草霜霉(P.antirrhini))、在洋蔥中(毀壞霜霉(P.destructor))、在菠菜中(散展霜霉(P.effusa))、在大豆中(東北霜霉(P.manchurica))、在煙草中(“青霉”；煙草霜霉菌(P.tabacina))、在苜蓿和三葉草中(車軸草霜霉(P.trifolium))、草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)(草霜霉病)、單軸霉屬(Plasmopara)(葡萄霜霉病)(葡萄生單軸霉(P.viticola))、和向日葵中(霍爾斯單軸霉(P.halstedii))、指疫霉菌(谷類和草類的霜霉病)、腐霉屬(種子腐爛病、苗期猝倒病以及根腐病和所有類型的植物黑根病例如由德巴利腐霉(P.debaryanum)引起的甜菜黑根病)、致病疫霉(Phytophthora infestans)(馬鈴薯和番茄晚疫病等)、白銹屬(Albugo spec.)(十字花科植物白銹病)；-子囊菌門，例如Microdochium nivale(黑麥和小麥雪霉病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(穗腐病，特別是小麥穗腐病)、尖鐮孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麥白粉病(f.sp.hordei)和小麥白粉病(f.sp.tritici))、豌豆白粉菌(Erysiphe pisi)(豌豆白粉病)、仁果癌叢赤殼菌(Nectria galligena)(果樹潰瘍)、葡萄鉤絲殼(Uncinula necator)(葡萄樹白粉病)、維管束假盤菌(Pseudopeziza tracheiphila)(葡萄樹的“Rotbrenner”)、麥角菌(Clavicepspurpurea)(麥角病，例如黑麥和草類麥角病)、小麥全蝕病菌(小麥、黑麥和其它草類的全蝕病)、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)(稻瘟病)、麥類核腔菌(Pyrenophora graminea)(大麥葉條紋病)、圓核腔菌(Pyrenophorateres)(大麥網(wǎng)斑病(net blotch of barley))、偃麥草核腔菌(Pyrenophoratritici-repentis)(小麥褐斑病(黃斑病))、蘋果黑星菌(Venturiainaequalis)(蘋果黑星病)、油菜菌核病菌(白霉)、苜蓿假盤菌(Pseudopezizamedicaginis)(苜蓿、白色核紅色三葉草褐斑病)；-擔(dān)子菌綱，如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)(大麥、黑麥、小麥雪腐病(灰雪霉病))、玉蜀黍黑粉菌(玉米黑粉病)、裸黑粉菌(Ustilagonuda)(大麥散黑粉病)、小麥散黑粉菌(Ustilago tritici)(小麥、斯卑爾脫小麥散黑粉病)、燕麥散黑粉菌(Ustilago avenae)(燕麥散黑粉病)、立枯絲核菌(馬鈴薯黑痣病)、軸黑粉菌(Sphacelotheca spp.)(高粱絲黑穗病)、亞麻柵銹菌(Melampsora lini)(亞麻銹病)、禾柄銹菌(Puccinia graminis)(小麥、大麥、黑麥、燕麥桿銹病)、隱匿柄銹菌(Puccinia recondita)(葉銹病)、散生柄銹菌(Puccinia dispersa)(黑麥葉銹病)、大麥柄銹菌(Puccinia hordei)(大麥葉銹病)、禾冠柄銹菌(Puccinia coronata)(燕麥冠銹病)、條形柄銹菌(小麥、大麥、黑麥以及多種草類的條銹病)、疣頂單孢銹菌(Uromycesappendiculatus)(菜豆銹病)、齊整小核菌(多種植物的根腐和莖腐病)；-半知菌綱(半知菌(fungi imperfecti))，如小麥穎枯殼針孢(小麥穎枯病)(小麥殼針孢)、小麥基腐病菌(小麥、大麥、黑麥眼斑病)、黑麥喙孢(Rhynchosporium secalis)(黑麥和大麥葉斑枯病)、早疫鏈格孢(Alternariasolani)(馬鈴薯、番茄早疫病)、菜莖點(diǎn)霉(Phoma betae)(甜菜黑根病)、菾菜生尾孢(Cercospora beticola)(甜菜葉斑病)、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae)(蕓苔、甘藍(lán)和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)(蕓苔萎蔫和莖腐病)、豆刺盤孢(Colletotrichum lindemuthianum)(菜豆炭疽病)、黑脛莖點(diǎn)霉(Phomalingam-black leg)(甘藍(lán)黑腿??；蕓苔莖潰瘍)、灰葡萄孢(葡萄樹、草莓、馬鈴薯、啤酒花等的灰霉病)。
最優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的植物對(duì)下列病原體有抗性致病疫霉(黑斑病、馬鈴薯晚疫病等)、Microdochium nivale(以前已知為雪腐鐮孢(Fusarium nivale)；黑麥和小麥雪腐病)、禾本科鐮孢、大刀鐮孢(小麥頸腐病)、尖鐮孢(番茄萎蔫)、禾布氏白粉菌(大麥白粉病(f.sp.hordei)和小麥白粉病(f.sp.tritici))、稻瘟病菌(稻瘟病)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotium)(白霉、油菜籽潰瘍)、穎枯殼針孢和小麥殼針孢(小麥穎枯病)、蕓苔鏈格孢(蕓苔、甘藍(lán)和其它十字花科植物的十字花科植物黑斑病)、黑脛莖點(diǎn)霉(甘藍(lán)黑腿病、株腐病、蕓苔莖潰瘍)。
在表2中所列的病原體及與它們相關(guān)的疾病以細(xì)菌病原體實(shí)例的方式論及，但是并不局限于此。
表2細(xì)菌疾病
特別優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)下列病原細(xì)菌有抗性壞腐棒桿菌(Corynebacterium sepedonicum)(馬鈴薯細(xì)菌性環(huán)腐病)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)(馬鈴薯黑腿病)、解淀粉歐文氏菌(Erwinia amylovora)(梨、蘋果和榅桲的火疫病)、瘡痂病鏈霉菌(Streptomyces scabies)(馬鈴薯瘡痂病)、丁香假單胞菌煙草致病變種(Pseudomonas syringae pv.Tabaci)(煙草野火病)、丁香假單胞桿菌菜豆致病變種(Pseudomonas syringae pv.Phaseolicola)(矮菜豆暈疫病)、丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv.Tomato)(番茄細(xì)菌葉斑病)、油菜黃單胞菌錦葵致病變種(Xanthomonas campestris pv.Malvacearum)(棉花細(xì)菌性黑枯病)、和野油菜黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas campestris pv.Oryzae)(水稻和其他草類的細(xì)菌葉枯病)。
術(shù)語(yǔ)“病毒病原體”包括所有植物病毒，例如煙草花葉病毒(tobaccomosaic virus)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus)、環(huán)斑病毒(ringspotvirus)、壞死病毒(necrosis virus)、玉米矮花葉病毒(maize dwarf mosaicvirus)等等。
在表3中列出的病原體和與它們相關(guān)的疾病以病毒病原體的實(shí)例的方式論及，但是并不局限于這些。
表3病毒疾病
根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧化物酶還可以賦予對(duì)動(dòng)物害蟲(例如昆蟲和線蟲)的抗性。昆蟲如甲蟲、毛蟲、虱或螨可以以實(shí)例的方式論及，但是不局限于此。
根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧化物酶優(yōu)選地賦予對(duì)下列屬的昆蟲的抗性鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthoptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等等。特別優(yōu)選的昆蟲屬為鞘翅目和鱗翅目、如歐洲玉米螟(European corn borer(ECB))、巴氏根葉甲(Diabrotica barberi)(長(zhǎng)角葉甲(Northern corn rootworm))、南方玉米根葉甲(Diabroticaundecimpunctata)、玉米根葉甲(Diabrotica virgifera)、小地老虎(Agrotisipsilon)、透翅切根夜蛾(Crymodes devastator)、Feltia ducens(番茄褐夜蛾，dingy cutworm)、泥背地老虎(Agrotis gladiaria)、梳爪叩頭蟲(Melanotusspp.)、Aeolus mellillus(捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(wireworm))、Aeolus mancus(麥金針蟲(wheat wireworm))、砂地金針蟲(Horistonotus uhlerii)、玉米長(zhǎng)喙象(Sphenophorus maidis)、Sphenophorus zeae(牛草長(zhǎng)象喙(timothy billbug))、早熟禾象甲(Sphenophorus parvulus)、南方玉米長(zhǎng)喙象(Sphenophoruscallosus)、食葉鰓金龜(Phyllogphaga spp.)、(蠐螬(white grubs))、Anuraphismaidiradicis(玉米根蚜(corn root aphid))、灰地種蠅(Delia platura)(玉米種蠅，seedcorn maggot)、葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea)、Stenolophuslecontei(玉米籽栗褐步甲(seedcorn beetle))和玉米籽細(xì)步甲(Cliviniaimpressifrons)。
其它是黑角負(fù)泥蟲(Oulema melanopus)、歐洲麥稈蠅(Oscinella frit)、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(Agrotis lineatus)和蚜蟲(如燕麥蚜蟲禾谷縊管蚜(Rhopalosiphum padi)、谷物蚜蟲禾谷網(wǎng)蚜(Sitobion avenae))。
在表4中列出的病原體和與它們相關(guān)的疾病以線蟲害蟲實(shí)例的方式指出，但是并不局限于這些。
表4.寄生蟲線蟲
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物特別優(yōu)選地對(duì)下列有抗性馬鈴薯金線蟲(Globodera rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.Pallida)(馬鈴薯、番茄和其它茄科草本的孢囊線蟲)、甜菜胞囊線蟲(Heterodera schachtii)(甜菜和飼用甜菜、蕓苔、甘藍(lán)等的甜菜胞囊線蟲)、燕麥胞囊線蟲(Heterodera avenae)(燕麥和其它禾谷類胞囊線蟲)、鱗球莖莖線蟲(莖和鱗莖線蟲，黑麥、燕麥、玉米、三葉草、煙草和甜菜的甜菜頭線蟲)、小麥粒線蟲(Anguina tritici)(小麥粒線蟲病，小麥(斯卑爾脫小麥、黑麥)的種癭和葉癭)、北方根結(jié)線蟲(Meloidogyne hapla)(胡蘿卜、黃瓜、萵苣、番茄、馬鈴薯、甜菜、苜蓿的北方根結(jié)線蟲)。
對(duì)于在農(nóng)業(yè)中特別重要的特定物種，根據(jù)本發(fā)明所用的過(guò)氧化物酶優(yōu)選地對(duì)下列病原體有效
對(duì)于大麥，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體和病毒病原體有效大麥禾柄銹菌(Puccinia graminis f.sp.hordei)(大麥桿銹病)、大麥禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.hordei)(大麥白粉病)、大麥黃矮病毒(BYDV)、以及致病昆蟲/線蟲玉米螟(Ostrinia nubilalis)(歐洲玉米螟)；小地老虎；麥二叉蚜(Schizaphis graminum)；麥長(zhǎng)蝽(Blissus leucopterusleucopterus)；擬綠蝽(Acrosternum hilare)；褐美洲蝽(Euschistus servus)；灰地種蠅(Deliaplatura)；麥癭蚊(Mayetiola destructor)；麥巖螨(Petrobialatens)。
對(duì)于大豆，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效Phytophthora megasperma fsp.glycinea、菜豆殼球孢、立枯絲核菌、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、尖鐮孢、菜豆間座殼大豆變種(Diaporthephaseolorum var.Sojae)(大豆擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis sojae))、大豆莖潰瘍病菌(Diaporthe phaseolorum var.Caulivora)、齊整小核菌、菊池尾孢(Cercospora kikuchii)、大豆尾孢(Cercospora sojina)、東北霜霉、束狀刺盤孢(Colletotrichum dematium)(平頭刺盤孢(Colletotrichumtruncatum))、山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola)、大豆殼針孢(Septoriaglycines)、大豆生葉點(diǎn)霉(Phyllosticta sojicola)、鏈格孢、丁香假單胞菌大豆致病變種(Pseudomonas syringae p.v.glycinea)、野油菜黃單胞菌菜豆致病變種(Xanthomonas campestris p.v.phaseoli)、Microsphaera diffussa、半裸鐮孢(Fusarium semitectum)、大豆莖褐腐病菌(Phialophora gregata)、大豆花葉病毒(soybean mosaic virus)、大豆小叢殼(Glomerella glycines)、煙草環(huán)斑病毒(tobacco ring spot virus)、煙草條點(diǎn)病毒(tobacco streak virus)、豆薯層銹菌(Phakopsorapachyrhizi)、瓜果腐霉、終極腐霉(Pythiumultimum)、德巴利腐霉、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、大豆胞囊線蟲(Heterodera glycines)、腐皮鐮孢、以及致病昆蟲/線蟲大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)；梨豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)；苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)；玉米螟(歐洲玉米螟)；小地老虎；甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)；煙芽夜蛾(Heliothis virescens)；美洲棉鈴蟲(Helicoverpa zea)；墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis)；桃短尾蚜(Myzuspersicae)；蠶豆小綠葉蟬(Empoasca fabae)；擬綠蝽；紅足黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)；特異黑蝗(Melanoplus differentialis)(特異黑蝗(differentialgrasshopper))；種蠅(Hylemya platura)；Sericothrips variabilis(大豆薊馬(soybean thrips))；棉薊馬(Thrips tabaci)；土耳其斯坦葉螨(Tetranychusturkestani)；二點(diǎn)葉螨(Tetranychus urticae)。
對(duì)于油菜，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效白銹菌(Albugo candida)、蕓苔鏈格孢、十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)、立枯絲核菌、核盤菌、蕓苔生球腔菌(Mycosphaerellabrassiccola)、終級(jí)腐霉、寄生霜霉(Peronospora parasitica)、粉紅鐮孢、鏈格孢。
對(duì)于苜蓿，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效Clavibater michiganese subsp.insidiosum、終級(jí)腐霉、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、華麗腐霉(Pythium splendens)、德巴利腐霉、瓜果腐霉、大雄疫霉(Phytophthora megasperma)、車軸草霜霉(Peronosporatrifoliorum)、苜蓿莖點(diǎn)霉(Phoma medicaginis var.Medicaginis)、苜蓿尾孢(Cercospora medicaginis)、苜蓿假盤菌、苜蓿黃斑病菌(Leptotrochilamedicaginis)、鐮刀菌、野油菜黃單胞菌苜蓿致病變種(Xanthomonascampestris p.v.alfalfa)、根腐絲囊霉(Aphanomyces euteiches)、草本匍柄霉(Stemphylium herbarum)、苜蓿匍柄霉(Stemphylium alfalfa)。
對(duì)于小麥，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效丁香假單胞菌atrofaciens致病變種(Pseudomonas syringae p.v.atrofaciens)、冰草條黑粉菌(Urocystis agropyri)、油菜單胞菌小麥致病變種(Xanthomonas campestris p.v.translucens)、丁香假單胞菌丁香致病變種、鏈格孢、多主枝孢(Cladosporium herbarum)、禾本科鐮孢、燕麥鐮孢、大刀鐮孢、小麥散黑粉菌、小麥殼二孢、麥類條斑病菌(Cephalosporiumgramineum)、禾生炭疽菌、小麥禾白粉菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麥禾柄銹菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、小麥隱匿柄銹菌(Pucciniarecondita f.sp.tritici)、條形柄銹菌(Puccinia striiformis)、偃麥草核腔菌、穎枯殼針孢、小麥殼針孢、燕麥殼針孢(Septoria avenae)、小麥基腐病菌、立枯絲核菌、禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、禾頂囊殼小麥變種(Gaeumannomyces graminis var.Tritici)、瓜果腐霉、禾根腐霉、終級(jí)腐霉、小麥根腐病菌、大麥黃矮病毒、雀麥草花葉病毒、小麥土傳花葉病毒(soilborne wheat mosaic virus)、小麥條紋花葉病毒、小麥梭斑病毒(wheatspindle streak virus)、美洲小麥條點(diǎn)花葉病毒、麥角菌、小麥腥黑粉菌(Tilletia tritici)、小麥光腥黑粉菌(Tilletia laevis)、小麥散黑粉菌、印度腥黑粉菌(Tilletia indica)、立枯絲核菌、Pythium arrhenomannes、禾生腐籬(Pythium gramicola)、瓜果腐霉、高原病毒(High Plains Virus)、歐洲小麥條點(diǎn)病毒(European wheat striate virus)、小麥禾柄銹菌(小麥稈銹病)、小麥禾布氏白粉菌(Blumeria(Erysiphe)graminis f.sp.tritici)(小麥白粉病)、以及致病昆蟲/線蟲粘蟲(Pseudaletia unipunctata)；秋夜蛾(Spodopterafrugiperda)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus)；蒼白西部地老虎(Agrotis orthogonia)(西部地老虎(Western cutworm))；ElasmopalpusZignosellus(lesser cornstalk borer)；黑角負(fù)泥蟲；車軸草葉象(Hyperapunctata)；南方玉米根葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；俄羅斯麥長(zhǎng)管蚜；麥二叉蚜；麥長(zhǎng)管蚜(Macrosiphum avenae)；紅足黑蝗；特異黑蝗；遷飛黑蝗(Melanoplus sanguinipes)；麥癭蚊；麥紅吸漿蟲(Sitodiplosismosellana)；美洲麥稈蠅(Meromyza americana)；冬作種蠅(Hylemyacoarctata)；煙褐薊馬(Frankliniella fusca)；麥莖蜂(Cephus cinctus)；郁金香癭螨(Aceria tulipae)。
對(duì)于向日葵，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效霍爾斯單軸霉(Plasmophora halstedii)、核盤菌、翠菊黃化(aster yellows)、向日葵殼針孢(Septoria helianthi)、向日葵擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis helianthi)、向日葵鏈格孢(Alternaria helianthi)、百日草鏈格孢(Alternaria zinniae)、灰葡萄孢、莖點(diǎn)霉黑莖病菌(Phoma macdonaldii)、菜豆殼球孢、二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、少根根霉、匍枝根霉、向日葵柄銹菌(Puccinia helianthi)、大麗花輪枝孢、胡蘿卜歐文氏軟腐桿菌胡蘿卜致病變種(Erwinia carotovorum p.v.Carotovora)、頂頭孢霉、隱地疫霉(Phytophthora cryptogea)、婆羅門參白銹(Albugo tragopogonis)，以及致病昆蟲/線蟲Suleima helianthana；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)；向日葵葉甲(zygogramma exclamationis)；胡蘿卜金龜(Bothyrus gibbosus)；向日葵籽癭蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)。
對(duì)于玉米，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效亞粘團(tuán)串珠鐮孢、斯氏歐文氏菌、串珠鐮孢、玉蜀黍赤霉(禾本科鐮孢)、Stenocarpella maydi(玉米色二孢)、畸雌腐霉、德巴利腐霉、禾生腐霉、華麗腐霉、終級(jí)腐霉、瓜果腐霉、黃曲霉、玉米小斑病菌0、T(異旋孢腔菌)、炭色長(zhǎng)蠕孢I、II&III(玉米圓斑病菌)、玉米大斑病菌I、II&III、Helminthosporium pedicellatum、玉蜀黍節(jié)壺菌、玉米黃葉枯病菌、玉米球梗孢(Kabatiella maydis)、高粱尾孢、玉蜀黍黑粉菌、高粱柄銹菌、多堆柄銹菌、菜豆殼球孢、草酸青霉、稻黑孢、多主枝孢、彎孢、不等彎孢、蒼白彎孢、Clavibacter michiganese subsp.nebraskense、綠色木霉、玉米矮花葉病毒A&B、小麥條紋花葉病毒、玉米褪綠矮化病毒、高粱麥角(Claviceps sorghi)、Pseudonomas avenae、菊歐文氏菌玉米致病變種、胡蘿卜軟腐歐文氏菌、Cornstunt spiroplasma、Diplodia macrospora、指疫霉菌、高粱指霜霉、菲律賓指霜霉、玉蜀黍指霜霉、甘蔗指霜霉、Spacelothecareiliana、玉米殼銹菌、玉米晚枯病菌、頂頭孢霉、玉米褪綠斑駁病毒、高原病毒(High Plains virus)、玉米花葉病毒、玉米雷亞多非納病毒、玉米條紋病毒(MSV)、玉米線條病毒、玉米粗矮病毒，以及致病昆蟲/線蟲玉米螟(歐洲玉米螟)；小地老虎；美洲棉鈴蟲；秋夜蛾；西南玉米稈草螟(Diatraeagrandiosella)；南美玉米苗斑螟；小蔗螟(Diatraea saccharalis)；Diabroticavirgifera(Western corn rootworm)；長(zhǎng)角葉甲(Diabrotica longicornisbarberi)；南方玉米根葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)；梳爪叩頭蟲；圓頭犀金龜(Cyclocephala borealis)(圓頭犀金龜、蠐螬)；南方圓頭犀金龜(Cyclocephala immaculata)(南方圓頭犀金龜、蠐螬)；日本弧麗金龜(Popillia japonica)；玉米銅色跳甲(Chaetocnema pulicaria)；玉米長(zhǎng)喙象；Anuraphis maidiradicis(玉米根蚜)；麥長(zhǎng)蝽；紅足黑蝗；遷飛黑蝗；種蠅；玉米斑潛蠅(Agromyza parvicornis)；美洲錐尾薊馬(Anaphothripsobscrurus)；竊蟻(Solenopsis molesta)；二點(diǎn)葉螨。
對(duì)于高粱，針對(duì)下面的真菌病原體、細(xì)菌病原體或病毒病原體有效玉米大斑病菌、禾生炭疽菌(Glomerella graminicola)、高粱尾孢、高粱膠尾孢、高粱生殼二孢(Ascochyta sorghina)、丁香假單胞菌丁香致病變種、油菜黃單胞菌高粱致病變種、須芒草假單胞菌、紫柄銹菌(Pucciniapurpurea)、菜豆殼球孢、高粱根腐病菌、串珠鐮孢、鏈格孢、Bipolarissorghicola、高粱生長(zhǎng)蠕孢(Helminthosporium sorghicola)、彎孢、高粱莖點(diǎn)霉(Phoma insidiosa)、燕麥假單胞菌(白沉淀假單胞菌(Pseudomonasalboprecipitans))、高粱座枝孢(Ramulispora sorghi)、高粱生座枝孢(Ramulispora sorghicola)、甘蔗黑痣菌(Phyllachora sacchari)、絲孢堆黑粉菌(Sporisorium reilianum)(絲軸黑粉菌)、高粱軸黑粉菌(Sphacelothecacruenta)、高粱堅(jiān)孢堆黑粉菌(Sporisorium sorghi)、甘蔗花葉H(Sugarcanemosaic H)、玉米矮花葉病毒A&B、高粱麥角(Claviceps sorghi)、立枯絲核菌、點(diǎn)枝頂孢菌、指疫霉菌、高粱指霜霉、菲律賓指霜霉、禾生指梗霉、禾本科鐮孢、尖鐮孢、禾根腐霉、禾生腐霉，以及致病細(xì)菌/線蟲斑禾草螟(Chilo partellus(sorghum borer))；秋夜蛾；美洲棉鈴蟲；南美玉米苗斑螟；粒膚地老虎(Feltia subterranea)；Phvllophaga crinita(蠐螬)；Eleodes spp、寬胸金針蟲Conoderus spp.和Aeolus spp.(捻轉(zhuǎn)血矛線蟲)；黑角負(fù)泥蟲；玉米銅色跳甲；玉米長(zhǎng)喙象；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis)(玉米縊管蚜)；黃偽毛蚜(Siphaflava)(蔗黃偽毛蚜)；麥長(zhǎng)蝽；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)；朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinus)；二點(diǎn)葉螨。
對(duì)于棉花，針對(duì)下面的致病昆蟲/線蟲有效煙芽夜蛾；美洲棉鈴蟲；甜菜夜蛾；棉花紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)；墨西哥棉鈴象(Anthonomus grandis grandis)；棉蚜(Aphis gossypii)(cotton aphid)；棉偽斑腿盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus)；結(jié)翅粉虱(Trialeurodes abutilonea)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris)；紅足黑蝗；特異黑蝗；棉薊馬；煙褐薊馬(Franklinkiella fusca)；朱砂葉螨；二點(diǎn)葉螨；對(duì)于稻，針對(duì)下面的致病昆蟲/線蟲有效小蔗螟；秋夜蛾；美洲棉鈴蟲；葡萄肖葉甲；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus)；米象(Sitophilusoryzae)；Nephotettix nigropictus(黑尾葉蟬)；麥長(zhǎng)蝽；擬綠蝽；對(duì)于蕓苔，針對(duì)下面的致病昆蟲/線蟲有效甘藍(lán)蚜(Brevicorynebrassicae)；蘿卜菜跳甲(phyilotreta cruciferae)；披肩粘蟲(Mamestraconjgurata)；菜蛾(Plutella xylostella)；種蠅(Delia ssp.)(根蛆)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“野生型”理解為各自的非遺傳修飾的親本生物。
根據(jù)本發(fā)明的方法在轉(zhuǎn)基因植物和/或在植物細(xì)胞中引起過(guò)氧化物酶含量的增加。含量的這一增加至少為5％，優(yōu)選至少為20％，還優(yōu)選至少為50％，特別優(yōu)選至少為100％，還特別優(yōu)選至少為5倍，尤其優(yōu)選的至少為10倍，還尤其優(yōu)選至少為50倍，以及最優(yōu)選為100倍。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“DNA片段”理解為編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的DNA區(qū)段，其中由DNA區(qū)段編碼的蛋白質(zhì)基本具有和由完整DNA序列編碼的蛋白質(zhì)相同的過(guò)氧化物酶活性，并且應(yīng)用這些片段可以實(shí)現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中增加病原體抗性。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)片段”指的是具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)區(qū)段，其中蛋白質(zhì)區(qū)段和全長(zhǎng)蛋白質(zhì)基本具有相同的過(guò)氧化物酶活性，并且應(yīng)用這些片段可以實(shí)現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物中增加病原體抗性。
在根據(jù)本發(fā)明的方法中所用的過(guò)氧化物酶的基本相同的酶活性指的是與由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3的序列所編碼的酶及其衍生物相比，所述酶活性仍然至少是50％，優(yōu)選至少是60％，特別優(yōu)選至少是70％，并且尤其優(yōu)選至少是80％，并且最優(yōu)選至少是90％。因此具有基本相同的酶活性的過(guò)氧化物酶也能在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生增加的病原體抗性。
過(guò)氧化物酶的活性可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的簡(jiǎn)單方法測(cè)定，如廣泛應(yīng)用的guajacol過(guò)氧化物酶活性測(cè)定(Chance和Maehley(1955)Method Enzymol.11764-775)或丁香醛連氮活性測(cè)定(Pandolfini等人(1992)Plant Cell Environ.15719-725)。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“核酸(分子)”在優(yōu)選的實(shí)施方案中另外包括位于編碼基因區(qū)域的3’和5’端的未翻譯的序列編碼區(qū)5’端上游該序列的至少500、優(yōu)選地200、特別優(yōu)選地100個(gè)核苷酸，以及編碼基因區(qū)域的3’端下游該序列的至少100、優(yōu)選地50、特別優(yōu)選地20個(gè)核苷酸。“分離的”核酸分子從在核酸的天然貯庫(kù)中存在的其它核酸分子中分離出來(lái)?！胺蛛x的”核酸優(yōu)選地沒有天然與該核酸來(lái)源生物的基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼的序列(例如，位于此核酸5’和3’端的序列)。在多種實(shí)施方案中，分離的過(guò)氧化物酶分子可以包含例如小于大約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然地位于核酸來(lái)源細(xì)胞的基因組DNA中該核酸分子的側(cè)翼。所有在此提及的核酸分子可以是例如RNA、DNA或cDNA。
在本方法中使用的核酸分子，例如具有SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的核苷酸序列的核酸分子，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文提供的序列信息來(lái)分離。借助于可以在如NCBI主頁(yè)(http://www.ncbi.hlm.nih.gov)下找到的比較算法，還可以在DNA或氨基酸水平上鑒定出例如同源序列或同源的保守序列區(qū)域。此序列的基本部分或完整的同源序列可以用作雜交探針，使用標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)(如在Sambrook等人中所描述的，見上)通過(guò)篩選cDNA和/或基因組文庫(kù)從可用于本方法的其它生物中分離另外的核酸序列。此外，使用以在此給出的序列或其一部分為基礎(chǔ)的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以分離包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或其一部分的完整序列的核酸分子(例如，使用基于相同序列生成的寡核苷酸引物，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可以分離包含完整序列或其部分的核酸分子)。例如，可以從細(xì)胞中分離mRNA(例如，通過(guò)Chirgwin等人(1979)Biochemistry 185294-5299中的硫氰酸胍提取方法)，并且cDNA可以從所述mRNA中用逆轉(zhuǎn)錄酶(例如Moloney-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自Gibco/BRL，Bethesda，MD，或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自SeikagakuAmerika，Inc.，St.Petersburg，F(xiàn)L)產(chǎn)生。用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的合成的寡核苷酸引物可以根據(jù)SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示序列的一種生成，或借助于SEQ ID No.2或SEQ ID No.4所示的氨基酸序列生成。根據(jù)本發(fā)明的核酸可以通過(guò)使用cDNA，或備選地使用基因組DNA作為模板，并且使用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铮ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)擴(kuò)增。以此方式擴(kuò)增的核酸可以克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中并且用DNA序列分析來(lái)鑒定。對(duì)應(yīng)于過(guò)氧化物酶核苷酸序列的寡核苷酸可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成方法產(chǎn)生，如通過(guò)自動(dòng)DNA合成儀。由這些核酸序列編碼的蛋白質(zhì)的過(guò)氧化物酶活性之后可以通過(guò)上述的酶測(cè)定法來(lái)測(cè)定。使用在此所描述的方法，還可以通過(guò)檢測(cè)根據(jù)本發(fā)明所鑒定的過(guò)氧化物酶的存在來(lái)鑒定表現(xiàn)出非宿主抗性的植物。
在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”意思是雜交在能確保特異性雜交的足夠嚴(yán)格的條件下體外進(jìn)行。嚴(yán)格體外雜交條件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知并且可以在文獻(xiàn)(如Sambrook和Russell(2001)MolecularCloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)中查到。術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”指的是這種事實(shí)，即在嚴(yán)格條件下，分子優(yōu)選地結(jié)合到某一核酸序列(靶序列)上，但是如果靶序列是例如DNA或RNA的復(fù)雜混合物的一部分，那么所述分子不結(jié)合到或至少以相當(dāng)小的程度結(jié)合到其它序列上。
嚴(yán)格條件決定于多種條件。更長(zhǎng)的序列在更高的溫度下特異性雜交。通常選擇嚴(yán)格條件，使在確定的離子強(qiáng)度和確定的pH值下雜交溫度比特定序列的解鏈溫度(Tm)低約5℃。Tm是在平衡狀態(tài)下與靶序列互補(bǔ)的分子的50％雜交到靶序列時(shí)的溫度(處于確定的pH值，確定的離子強(qiáng)度和確定的核苷酸濃度)。通常，嚴(yán)格條件是指那樣的條件，其中在7.0到8.3的pH下鹽濃度為至少大約0.01到1.0M鈉離子濃度(或另一種鹽的濃度)，并且對(duì)于短的分子(例如10到50個(gè)核苷酸)，溫度為至少30℃。此外，嚴(yán)格條件可以包括添加去穩(wěn)定化雜交分子的試劑，如甲酰胺。在本文用到的嚴(yán)格條件下的雜交中，相互具有至少60％同源性的核苷酸序列通常保持相互雜交。優(yōu)選地，按照以下方式選擇嚴(yán)格條件，即相互同源性至少為大約65％，優(yōu)選地至少為大約70％，并且特別優(yōu)選地至少為大約75％，或更高的序列通常保持相互雜交。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，在大約45℃下雜交，隨后在0.2×SSC、0.1％SDS、50℃到65℃下進(jìn)行一步或多步洗滌步驟。溫度范圍，例如在標(biāo)準(zhǔn)雜交條件下的溫度范圍決定于核酸的類型，在濃度為0.1到5×SSC(pH 7.2)的水性緩沖液中為42℃到58℃。
如果有機(jī)溶劑如50％甲酰胺存在于上述緩沖液中，在標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度為大約42℃。優(yōu)選地，DNADNA雜交分子的雜交條件為例如0.1×SSC和20℃到45℃，優(yōu)選地為30℃到45℃。優(yōu)選地，DNA:RNA雜交分子的雜交條件為例如0.1×SSC和30℃到55℃，優(yōu)選地在45℃到55℃之間。為在例如沒有甲酰胺時(shí)具有大約100個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度和G/C含量為50％的核酸確定上述雜交溫度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知如何應(yīng)用上述或下列教科書確定所需的雜交條件，所述教科書為Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，Hames和Higgins(publisher)1985，Nucleic Acids HybridizationA Practical Approach，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford；Brown(publisher)1991，Essential MolecularBiologyA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“序列同一性”指的是同一性，即在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所述的核酸序列的完整序列中，在相同的5’-3’序列中相同的核苷酸至少為80％，優(yōu)選地至少為85％，特別優(yōu)選地至少為90％，最優(yōu)選地至少為95％。
序列同一性用基于多種算法的一些程序確定。Needleman和Wunsch的算法或Smith和Waterman的算法提供了尤其可靠的結(jié)果。對(duì)于序列比較，使用了程序PileUp(Feng和Doolittle(1987)J.Mol.Evolution 25351-360；Higgins等人，(1989)CABIOS 5151-153)，或程序Gap和Best Fit(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol. Biol. 48443-453，以及Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482-489)，所述程序包含在GCG軟件包中(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，美國(guó))。
以上以百分?jǐn)?shù)描述的序列同一性值使用GAP程序跨越完整的序列區(qū)確定，使用下列設(shè)置缺口權(quán)重50，長(zhǎng)度權(quán)重3，平均匹配10000以及平均錯(cuò)配0.000。
除非另外說(shuō)明，這些設(shè)置用作序列比較的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置。
與在SEQ ID No.1和SEQ ID No.3中所給的核酸序列背離的核酸序列可以例如通過(guò)向SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的核苷酸序列中插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、添加或缺失來(lái)產(chǎn)生，由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)與SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中所述的序列相比插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸替代、添加或缺失?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)如位點(diǎn)專一誘變和PCR介導(dǎo)的誘變將突變插入到SEQ ID No.1和SEQ ID No.3的序列之一中。優(yōu)選地，在一個(gè)或幾個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處產(chǎn)生保守氨基酸替代，非必需氨基酸殘基是不影響過(guò)氧化物酶酶活性的氨基酸殘基。在“保守氨基酸替代”中，氨基酸殘基用具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代。在專業(yè)知識(shí)領(lǐng)域中已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包含具有下列側(cè)鏈的氨基酸堿性側(cè)鏈(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性的側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。因此根據(jù)本發(fā)明所用的過(guò)氧化物酶中預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基將優(yōu)選地被來(lái)自同樣側(cè)鏈家族的另一個(gè)氨基酸殘基所替代。備選地，在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如通過(guò)飽和誘變，突變可以在編碼過(guò)氧化物酶的完整序列或其一部分中隨機(jī)地插入，并且得到的突變體可以通過(guò)重組表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)來(lái)篩選過(guò)氧化物酶的活性，從而鑒定保留過(guò)氧化物酶活性的突變體。蛋白質(zhì)的過(guò)氧化物酶活性可以例如使用本文描述的測(cè)定法測(cè)定。
在本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)中，“轉(zhuǎn)基因的”或“重組的”意思是對(duì)于如核酸序列、表達(dá)盒(＝基因構(gòu)建體)、或包含根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的載體、或用分別的核酸序列、表達(dá)盒或載體轉(zhuǎn)化的生物，所有那些構(gòu)建體都用基因技術(shù)產(chǎn)生，其中a)根據(jù)本發(fā)明的核酸序列，或b)功能性地連接到根據(jù)本發(fā)明的核酸序列上的遺傳控制序列，如啟動(dòng)子，或c)a)和b)的任一種不在其天然遺傳環(huán)境中，或用基因技術(shù)進(jìn)行了修飾，修飾是例如一個(gè)或幾個(gè)核苷酸殘基的替代、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境意思是在親本生物中的天然基因組或染色體基因座，或在基因組文庫(kù)中存在。在基因組文庫(kù)的情況下，核酸序列的天然遺傳環(huán)境優(yōu)選地是至少部分保守的。此環(huán)境與核酸序列的至少一側(cè)側(cè)面相接，并且具有的序列長(zhǎng)度至少為50bp，優(yōu)選地至少為500bp，特別優(yōu)選地至少為1000bp，尤其優(yōu)選地至少5000bp。當(dāng)天然發(fā)生的表達(dá)盒(例如過(guò)氧化物酶的天然啟動(dòng)子與各自的過(guò)氧化物酶基因的天然發(fā)生的組合)用非天然、合成的(“人工的”)方法(如誘變)修飾時(shí)，它就成為了轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。相應(yīng)的方法在例如US5,365,350或WO 00/15815中描述。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞意思是本方法使用的核酸沒有在植物或植物細(xì)胞基因組中它們的天然位點(diǎn)上，由此所述核酸可以同源或異源地表達(dá)。然而，轉(zhuǎn)基因還指的是雖然根據(jù)本發(fā)明的核酸位于生物基因組中它們的天然位點(diǎn)上，但是相對(duì)于天然序列此序列已經(jīng)改變，和/或天然序列的調(diào)節(jié)序列已經(jīng)被修飾。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因理解為根據(jù)本發(fā)明的核酸在基因組的非天然位點(diǎn)上表達(dá)，即核酸同源地或優(yōu)選異源地表達(dá)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞、編碼過(guò)氧化物酶的核酸序列需要被調(diào)整以適應(yīng)生物特異性的密碼子選擇。密碼子選擇可以用所選生物的其它已知基因的計(jì)算機(jī)分析確定。
在產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的優(yōu)選方法中，將編碼根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧化物酶的核酸序列分別轉(zhuǎn)移到植物或植物細(xì)胞中。所述轉(zhuǎn)移使得過(guò)氧化物酶的表達(dá)或活性比野生型的植物或野生型的植物細(xì)胞增加，并且相應(yīng)地使得轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的病原體抗性增加。
根據(jù)本發(fā)明，所述方法一般包括下列步驟a)產(chǎn)生包含5’-3’方向上下列核酸序列的載體-在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列，-有效連接到其上的編碼根據(jù)本發(fā)明的過(guò)氧化物酶或過(guò)氧化物酶的部分的DNA序列，-有效連接到其上的在植物細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄、終止和/或加A信號(hào)的調(diào)節(jié)序列，b)將來(lái)自步驟a)的載體轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，并且任選地，整合到植物基因組中；并且c)任選地，從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生完整植物。
在插入到植物細(xì)胞或植物中后，本方法中所用的核酸可以位于單獨(dú)的質(zhì)粒上，或優(yōu)選地整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在整合到基因組的情形中，整合可以是隨機(jī)發(fā)生的，或通過(guò)用插入的拷貝替換天然基因的重組(它引起細(xì)胞過(guò)氧化物酶表達(dá)的調(diào)節(jié))，或通過(guò)使用反式(in trans)基因從而將此基因功能性地連接到功能表達(dá)單元上，所述功能表達(dá)單元包含確?；虮磉_(dá)的至少一種序列和確保功能性轉(zhuǎn)錄基因的多聚腺苷化作用的至少一種序列。
根據(jù)本發(fā)明，編碼過(guò)氧化物酶的核酸的基因表達(dá)的增加也表示對(duì)植物內(nèi)源過(guò)氧化物酶表達(dá)的操作。這可以通過(guò)例如修飾過(guò)氧化物酶編碼基因的啟動(dòng)子DNA序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種修飾導(dǎo)致內(nèi)源過(guò)氧化物酶基因的表達(dá)速率的改變，優(yōu)選增加，所述修飾可以依靠DNA序列的缺失或插入來(lái)發(fā)生。內(nèi)源過(guò)氧化物酶基因的啟動(dòng)子序列的修飾通常導(dǎo)致過(guò)氧化物酶基因表達(dá)量的改變，并且因此還導(dǎo)致在細(xì)胞或植物中可檢測(cè)到的過(guò)氧化物酶活性的改變。
增加內(nèi)源過(guò)氧化物酶活性和含量的另一種可能是上調(diào)參與內(nèi)源過(guò)氧化物酶基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，例如通過(guò)過(guò)表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)的方法，并且這些方法在本發(fā)明中公開以用于過(guò)氧化物酶。
此外，可以實(shí)現(xiàn)增加內(nèi)源過(guò)氧化物酶基因表達(dá)，因?yàn)槲崔D(zhuǎn)化的生物中不存在的調(diào)節(jié)子蛋白質(zhì)與這些基因的啟動(dòng)子相互作用。所述的調(diào)節(jié)子可以是由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白質(zhì)，例如在WO96/06166中描述。
除了要被轉(zhuǎn)移的過(guò)氧化物酶的核酸序列，用于過(guò)氧化物酶表達(dá)的重組核酸分子還包含另外的調(diào)節(jié)元件。這些載體需要包含哪些精確的調(diào)節(jié)元件決定于每種情況下使用這些載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)表達(dá)增加的轉(zhuǎn)基因植物多種上述方法，知道這些載體必須包含哪些調(diào)節(jié)元件和其它元件。
通常，作為載體的部分的調(diào)節(jié)元件允許用于轉(zhuǎn)錄并且如果需要，在植物細(xì)胞中用于翻譯。這意味著，例如根據(jù)所選擇的植物，基因只能在誘導(dǎo)后表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)，或其立即表達(dá)和/或過(guò)表達(dá)。例如，這些調(diào)節(jié)序列是誘導(dǎo)物或阻抑物結(jié)合、從而調(diào)節(jié)核酸表達(dá)的序列。除了這些新的調(diào)節(jié)序列，或代替這些序列，實(shí)際的結(jié)構(gòu)基因上游序列的天然調(diào)節(jié)仍可以存在，也可能已經(jīng)被基因修飾從而使天然調(diào)節(jié)失去功能，并且基因的表達(dá)增加。然而重組核酸分子也能以更簡(jiǎn)單的方式構(gòu)建，即在核酸序列的上游不插入額外的調(diào)節(jié)信號(hào)并且不除去天然啟動(dòng)子與其調(diào)節(jié)。而是將天然調(diào)節(jié)序列以調(diào)節(jié)不再發(fā)生和/或基因表達(dá)增加的方式突變。為了增加活性，可以將這些改變的啟動(dòng)子以部分序列的形式單獨(dú)的插入天然基因的上游。另外，基因構(gòu)建體還可以有利地包含一個(gè)或多個(gè)所稱作的增強(qiáng)子序列，所述增強(qiáng)子序列功能性地連接啟動(dòng)子并且允許核酸序列的表達(dá)增加。其它有用的序列，如另外的調(diào)節(jié)元件或終止子，也可以插入到DNA序列的3’端。
原則上，有可能使用具有其調(diào)節(jié)序列的任意天然啟動(dòng)子用于根據(jù)本發(fā)明的方法。但是也有可能并且有利地僅使用合成啟動(dòng)子或另外使用合成啟動(dòng)子。
啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或發(fā)育特異性啟動(dòng)子。啟動(dòng)子以及其它調(diào)節(jié)序列的選擇決定了區(qū)域和時(shí)間表達(dá)圖式，并且由此也決定了轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)氧化物酶的表達(dá)。
組成型啟動(dòng)子包括，例如Rsyn7啟動(dòng)子的核心啟動(dòng)子以及在WO99/43838和美國(guó)專利號(hào)6,072,050中描述的其它組成型啟動(dòng)子、CaMV 35S啟動(dòng)子(Odell等人(1985)Nature313810-812)、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人(1990)Plant Cell 2163-171)、泛蛋白啟動(dòng)子(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18675-689)、pEMU啟動(dòng)子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS啟動(dòng)子(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)、ALS啟動(dòng)子(美國(guó)申請(qǐng)?zhí)?8/409.297)，以及類似的啟動(dòng)子。當(dāng)使用組成型啟動(dòng)子時(shí)，也可以通過(guò)在不需要此基因表達(dá)的細(xì)胞或組織中抑制該基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞特異性或組織特異性的表達(dá)，抑制基因表達(dá)通過(guò)如形成結(jié)合到該基因產(chǎn)物上的抗體并且由此阻止產(chǎn)物的活性，或通過(guò)在這些細(xì)胞中作用的適當(dāng)?shù)囊种苿?shí)現(xiàn)。
優(yōu)選地，過(guò)氧化物酶基因通過(guò)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)，并且特別優(yōu)選地是通過(guò)病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。此種啟動(dòng)子包括病原體感染后誘導(dǎo)的致病相關(guān)蛋白(PR蛋白)的啟動(dòng)子，所述致病相關(guān)蛋白為例如PR蛋白、SAR蛋白質(zhì)、β-1，3葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等(例如參見，Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.89245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell 4645-656；和Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.4111-116)。
另外特別重要的啟動(dòng)子是在病原體感染部位上或其附近局部表達(dá)的啟動(dòng)子，如在Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.9335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions 2325-331；Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 832427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.293-98；Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9314972-14977；Chen等人(1996)Plant J.10955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912507-2511；Warner等人(1993)Plant J.319l-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell 1961-968中所描述的啟動(dòng)子。
此外，由于病原體通常通過(guò)創(chuàng)傷進(jìn)入，創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子也優(yōu)選地用在根據(jù)本發(fā)明的方法中。此種創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括馬鈴薯的蛋白酶抑制劑(pin II)的啟動(dòng)子(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology 14494-498)、wun1和wun2的啟動(dòng)子(美國(guó)專利Nr.5,428,148)、win1和win2的啟動(dòng)子(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.215200-208)、系統(tǒng)素的啟動(dòng)子(McGurl等人(1992)Science 2251570-1573)、WIP1的啟動(dòng)子(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.22783-792；Eckelkamp等人(1 993)FEBS Letters 32373-76)、MPI基因的啟動(dòng)子(Corderok等人(1994)Plant J.6(2)141-150)、FGAM-合酶的啟動(dòng)子(Vaghchhipawala等人(2004)Genome 47(2)404-413)、prxC2的啟動(dòng)子(Kaothien等人(2002)Plant Mol.Biol.49(6)591-599)、poxA的啟動(dòng)子(Ito等人(2000)Plant Science 155(1)85-100)、FAD7的啟動(dòng)子(Nishiuchi等人(1999)Plant Physiol.121(4)1239-1246)、TR2′的啟動(dòng)子(WO 03/093483)。
通過(guò)應(yīng)用外源化學(xué)調(diào)節(jié)子，可以使用化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)在植物中的基因表達(dá)(見在Gatz(1997)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，4889-108中的綜述)。當(dāng)希望基因表達(dá)以時(shí)間特異的方式發(fā)生時(shí)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是特別適合的。此類的實(shí)例包括苯磺酰胺激活的玉米In2-2啟動(dòng)子、疏水親電化合物誘導(dǎo)的玉米GST啟動(dòng)子、水楊酸激活的煙草PR-1a啟動(dòng)子。其它化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括類固醇應(yīng)答啟動(dòng)子(參見，例如在Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810421-10425和McNellis等人(1998)Plant J.14(2)247-257中的糖皮質(zhì)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子)、乙醇誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和四環(huán)素誘導(dǎo)的啟動(dòng)子(參見，例如Gatz等人(1991)Mol.Gen.Genet.227229-237；美國(guó)專利號(hào)5,814,618和5,789,156)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用允許產(chǎn)生僅瞬時(shí)表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的序列的植物或植物細(xì)胞。此類瞬時(shí)表達(dá)允許產(chǎn)生僅表現(xiàn)出瞬時(shí)病原體抗性的植物。例如當(dāng)病原體污染的危險(xiǎn)迫在眉睫并且因此植物只在某段時(shí)期內(nèi)需要對(duì)病原體有抗性時(shí)，需要此類瞬時(shí)抗性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知需要瞬時(shí)抗性的另外的情況。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還知道通過(guò)使用載體可以實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)以及由此產(chǎn)生的瞬時(shí)抗性，所述載體在植物細(xì)胞中不穩(wěn)定地復(fù)制并且攜帶表達(dá)過(guò)氧化物酶的各自序列。
也可以使用組織特異性的啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)在某一植物組織中增加的過(guò)氧化物酶表達(dá)。適當(dāng)?shù)慕M織特異性的啟動(dòng)子是例如允許葉特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。這些包括在Yamamoto等人(1997)Plant J.1(2)255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol 105357-367；Yamamoto等人(1994)Plant CellPhysiol.35(5)773-778；Gotor等人(1993)Plant J.3509-518；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.23(6)1129-1138Matsuoka等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20)9586-9590；Stockhaus等人(1987)Proc.Natl.Acad.G.USA 847943-7947；Stockhaus等人(1989)EMBO J.82445-2451中所描述的啟動(dòng)子。
由于作為高等植物地上器官的外組織的表皮的任務(wù)之一是阻止病原體侵入到植物中，因此表皮特異性的啟動(dòng)子的使用也是特別優(yōu)選地。恰當(dāng)?shù)谋砥ぬ禺愋詥?dòng)子包括擬南芥(Arabidopsis)的CER6(CUT1)基因的啟動(dòng)子(Hooker等人(2002)Plant Physiol.129(4)1568-1580和Kunst等人(2000)Biochem.Soc.Trans.28(6)651-654)。
其它優(yōu)選地啟動(dòng)子為在果實(shí)中特別有活性的啟動(dòng)子。這些包括，例如多聚半乳糖醛酸酶基因的啟動(dòng)子(例如馬鈴薯的)(Nicholass等人(1995)Plant Mol.Biol.28423-435)、ACC氧化酶的啟動(dòng)子(例如蘋果的)(Atkinson等人(1998)Plant Mol.Biol.38449-460)或馬鈴薯的2A11啟動(dòng)子(vanHaaren等人(1991)Plant Mol.Biol.17615-630)。
還優(yōu)選葉肉特異性啟動(dòng)子，如稻或番茄的rbcs啟動(dòng)子(Kyozuka等人(1993)Plant Physiol.102(3)991-1000)、玉米的PPCZm1啟動(dòng)子(Kausch等人(2001)Plant Mol Biol.45(1)1-15)、擬南芥的CAB2啟動(dòng)子(Thain等人(2002)Plant Physiol.130102-110)、或稻的AldP啟動(dòng)子(Kagaya等人(1995)Mol Gen Genet.248(6)668-674)。
另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用常規(guī)方法分離另外適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。因此，使用當(dāng)前的分子生物學(xué)方法如雜交實(shí)驗(yàn)或DNA蛋白質(zhì)結(jié)合研究，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠鑒定如另外的表皮特異性調(diào)節(jié)核酸元件。在此，例如，第一步從所需的生物中分離所需的組織，從所述組織中分離出調(diào)節(jié)序列、分離出完整的聚(A)+RNA，并且產(chǎn)生cDNA文庫(kù)。在第二步中，使用基于聚(A)+RNA分子從另一組織得到cDNA克隆，這些克隆依靠雜交從第一個(gè)文庫(kù)(bank)中鑒定出來(lái)，其相應(yīng)的聚(A)+RNA分子僅在所希望的組織中積累。之后使用鑒定出的cDNA，將具有組織特異性調(diào)節(jié)元件的啟動(dòng)子分離出來(lái)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以使用額外的基于PCR的方法用來(lái)分離適當(dāng)?shù)慕M織特異性啟動(dòng)子。
根據(jù)本發(fā)明的載體作為調(diào)節(jié)元件，可以另外包含如增強(qiáng)子元件。它們還可以包含抗性基因、復(fù)制信號(hào)和附加的DNA區(qū)域，所述的這些使載體在細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)中能增殖。調(diào)節(jié)元件還包含實(shí)現(xiàn)載體在宿主中穩(wěn)定化的序列。此類調(diào)節(jié)元件特別包含以下序列，即所述序列促進(jìn)載體穩(wěn)定整合到植物的宿主基因組中，或促進(jìn)載體在植物細(xì)胞中自主復(fù)制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知此類調(diào)節(jié)元件。
所稱作的終止序列是確保轉(zhuǎn)錄或翻譯恰當(dāng)終止的序列。如果要翻譯所轉(zhuǎn)移的核酸，那么終止序列一般為終止密碼子和各自的調(diào)節(jié)序列；如果轉(zhuǎn)移的核酸僅被轉(zhuǎn)錄，那么它們通常為聚腺苷酸序列。
本文用到的術(shù)語(yǔ)“載體”涉及能夠?qū)⒔Y(jié)合到其上的另一核酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！保浔憩F(xiàn)為附加的DNA區(qū)段可以連接到其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體類型是病毒載體，其中附加的DNA區(qū)段可以連接到病毒基因組中。某些載體可以在它已經(jīng)插入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制原點(diǎn)的細(xì)菌載體)。其它載體在插入到宿主細(xì)胞中時(shí)有利地整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并且從而和宿主基因組一起復(fù)制。而且，某些載體可以調(diào)控其功能性連接的基因的表達(dá)。這些載體在此稱作“表達(dá)載體”。通常，適于DNA重組技術(shù)的表達(dá)載體是質(zhì)粒類型的載體。由于質(zhì)粒是最常用的載體類型，所以在本說(shuō)明書中“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用。但是，本發(fā)明也意在包含其它類型的表達(dá)載體，如完成類似功能的病毒載體。此外，術(shù)語(yǔ)“載體”還意在包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它載體，如噬菌體、病毒(例如SV40、CMV、TMV)、轉(zhuǎn)座子、插入序列、噬粒、噬菌粒、黏粒、線性或環(huán)狀DNA。
在重組表達(dá)載體中，術(shù)語(yǔ)“有效連接到其上”意思是將目標(biāo)核苷酸序列以該核苷酸序列表達(dá)可能發(fā)生的方式連接到調(diào)節(jié)序列上，并且兩種序列都以使得序列完成預(yù)測(cè)的功能的這種方式互相連接。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)序列”意在包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如加A信號(hào))。這些調(diào)節(jié)序列在如下中進(jìn)行了描述例如GoeddelGeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)或在Gruber和Crosby，在Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，publisherGlick和Thompson，第7章，89-108。調(diào)節(jié)序列包含那些在多種類型的宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)核苷酸序列組成性表達(dá)的序列，以及那些只在某些宿主細(xì)胞中在某些條件下調(diào)節(jié)核苷酸序列直接表達(dá)的序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知表達(dá)載體的設(shè)計(jì)決定于一些因素，如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、蛋白質(zhì)表達(dá)的所希望的程度等。
用于過(guò)氧化物酶表達(dá)的重組表達(dá)載體在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中都有活性。這是有利的，因?yàn)闉榱撕?jiǎn)單起見，通常將載體構(gòu)建的中間步驟在微生物中進(jìn)行。這些克隆載體包含用于各自微生物的復(fù)制信號(hào)、以及用于選擇成功轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞的標(biāo)記基因。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于在原核生物中表達(dá)的適當(dāng)載體；它們包括例如大腸桿菌pLG338、pACYC184、pBR系如pBR322、pUC系列，如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11、或pBdCl、鏈霉菌pIJ101(Streptomyces pIJ101)、pIJ364、pIJ702、或pIJ361、芽孢桿菌pUB110(Bacillus pUB110)、pC194、或pBD214、棒桿菌pSA77(Corynebacterium pSA77)、或pAJ667。
在另一實(shí)施方案中，表達(dá)載體代表酵母表達(dá)載體或桿狀病毒(bacillovirus)表達(dá)載體。
上述提到的載體僅提供了可能適當(dāng)?shù)妮d體的少量概括。其它質(zhì)粒為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知并且在例如Cloning Vectors(publisher Pouwels，P.H.等人Elsevier，Amsterdam，New York-Oxford，1985)中描述。對(duì)于適合原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的另外的表達(dá)系統(tǒng)，參見Sambrook和Russell的第15和16章(見上)。
在本方法的另一實(shí)施方案中，過(guò)氧化物酶可以在單細(xì)胞的植物細(xì)胞如藻類中表達(dá)，見Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology 1(3)239-251和在本文中引用的文獻(xiàn)，也可以在高等植物的植物細(xì)胞中表達(dá)(例如種子植物，如作物植物)。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括在以下文獻(xiàn)廣泛描述的那些Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.，和Masterson，R.(1992)，Plant Mol.Biol.201195-1197；和Bevan，M.W.(1984)，Nucl.Acids Res.128711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，S.15-38中。
由于植物基因的表達(dá)通常并不限于轉(zhuǎn)錄水平，植物表達(dá)盒除了上述的元件還優(yōu)選地包含其它功能性連接的序列，如翻譯增強(qiáng)子，例如包含煙草花葉病毒的5’非翻譯前導(dǎo)序列的超驅(qū)動(dòng)序列，所述的超驅(qū)動(dòng)序列增加了蛋白質(zhì)/RNA的比例(Gallie等人(1987)Nucl.Acids Research 158693-8711)。
如上所述，必須將要表達(dá)的基因功能性連接到適當(dāng)?shù)膯?dòng)子上，所述啟動(dòng)子以時(shí)間特異性、細(xì)胞特異性或組織特異性的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。已經(jīng)在上文描述了適當(dāng)?shù)膯?dòng)子。
在基因表達(dá)盒的功能性連接中所用的其它優(yōu)選地序列是在基因產(chǎn)物靶向到各自的細(xì)胞隔室中所需的靶序列(見在Kermode(1996)Crit.Rev.Plant Sci.15(4)285-423中的綜述和其中引用的文獻(xiàn))，例如在進(jìn)入到液泡、細(xì)胞核、所有類型的質(zhì)體(如造粉體、葉綠體、色質(zhì)體)、胞外空間、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油質(zhì)體、過(guò)氧化物酶體以及植物細(xì)胞的其它隔室中所需的靶序列。
有利地，將過(guò)氧化物酶序列按照已知的方式擴(kuò)增和連接以插入到表達(dá)載體中。優(yōu)選地，按照Pfu DNA聚合酶或Pfu/Tag DNA聚合酶混合物的方案進(jìn)行。根據(jù)將要被擴(kuò)增的序列來(lái)選擇引物。有利地，選擇引物要使得擴(kuò)增產(chǎn)物(amplificate)包含從起始密碼子到終止密碼子的完整編碼的序列。有利地，在擴(kuò)增后分析擴(kuò)增產(chǎn)物。例如在凝膠電泳分離后進(jìn)行關(guān)于質(zhì)量和數(shù)量的分析。之后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案(如Qiagen)將擴(kuò)增產(chǎn)物純化。之后純化的擴(kuò)增產(chǎn)物的整分試樣用于隨后的克隆。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常知道適當(dāng)?shù)目寺≥d體。這些克隆載體特別包括在微生物系統(tǒng)中可復(fù)制的載體，例如尤其是在細(xì)菌、酵母或真菌中允許有效克隆以及允許植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的載體。尤其值得提及的載體是適合于T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的多種二元載體系統(tǒng)和共整合載體系統(tǒng)。通常此類載體系統(tǒng)的特征在于它們至少包含土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需的毒力基因以及T-DNA限制序列(T-DNA邊界(T-DNA border))。優(yōu)選地，這些載體系統(tǒng)還包含另外的順式調(diào)節(jié)區(qū)，如啟動(dòng)子和終止子和/或用于鑒定各自的轉(zhuǎn)化生物的選擇標(biāo)記。在共整合載體系統(tǒng)中毒力基因和T-DNA序列排列在同一個(gè)載體上，而二元系統(tǒng)則基于至少兩種載體，其一攜帶毒力基因但不攜帶T-DNA，以及另一個(gè)攜帶T-DNA而不攜帶毒力基因。因此后一載體相對(duì)較小，在大腸桿菌以及土壤桿菌中易于操作和復(fù)制。這些二元載體包括載體系列pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地為Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV和pCAMBIA。Hellens等人(2000)Trends inPlant Science 5，446-451提供了二元載體及其應(yīng)用的綜述。
對(duì)于載體制備，可以首先通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶將載體線性化，然后以任何合適的方式進(jìn)行酶促修飾。之后純化載體并且將整分試樣用于克隆。在克隆期間，通過(guò)連接酶將酶切和純化(如果需要)后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到用相似方法制備的載體片段上。某些核酸構(gòu)建體、或載體構(gòu)建體或質(zhì)粒構(gòu)建體可以具有一個(gè)或甚至幾個(gè)編碼的基因區(qū)。優(yōu)選地，將這些構(gòu)建體中編碼的基因區(qū)功能性地連接到調(diào)節(jié)序列上。調(diào)節(jié)序列尤其包括植物序列，如上述啟動(dòng)子和終止子。構(gòu)建體有利地可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中在微生物尤其是大腸桿菌和根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)中培養(yǎng)，并且在選擇條件下穩(wěn)定增殖。之后收獲并且裂解細(xì)胞并從中提取質(zhì)粒。這可用于將異源DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)植物或微生物中。
關(guān)于克隆載體的有利的用途，可以將根據(jù)本發(fā)明的方法中所用的核酸、根據(jù)本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體插入到生物中，如微生物、或優(yōu)選地如植物，并且將它們用于植物轉(zhuǎn)化，如在下面文獻(xiàn)中所公開和引用的PlantMolecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida)，第6/7章，第71-119頁(yè)(1993)；F.F. White，Vectors for Gene Transfer inHigher Plants；在Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization中，publisherKung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等人，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，Bd.1，Engineeringand Utilization中，publisherKung等人R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus(1991)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42205-225。因此在本方法中所用的核酸、根據(jù)本發(fā)明的核酸和核酸構(gòu)建體、和/或載體可以用于廣譜生物的遺傳修飾，優(yōu)選地用于植物的遺傳修飾。
有很多已知的技術(shù)可用于將DNA插入植物宿主細(xì)胞，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以不困難的找到每種情況下最適當(dāng)?shù)姆椒?。這些技術(shù)包括應(yīng)用根瘤土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rguzogenes)作為轉(zhuǎn)化劑，用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞、原生質(zhì)體融合、分離的DNA到原生質(zhì)體中的直接基因轉(zhuǎn)移、DNA的電穿孔、依靠生物射彈方法的DNA插入以及其它可能。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化都可以以這種方式產(chǎn)生。
對(duì)于植物中DNA的注射和電穿孔，本質(zhì)上對(duì)于所使用的質(zhì)粒沒有特殊的要求。類似的對(duì)于直接基因轉(zhuǎn)移也是這樣的?？梢允褂煤?jiǎn)單質(zhì)粒如pUC衍生物。但是如果要從這種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中再生出完整植株，那么需要選擇性標(biāo)記基因的存在。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知最常用的選擇性標(biāo)記，并且對(duì)于他來(lái)說(shuō)選擇適當(dāng)?shù)臉?biāo)記并不存在困難。常用的選擇性標(biāo)記是使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞對(duì)殺生物劑或?qū)股赜锌剐缘哪切┻x擇性標(biāo)記，如卡那霉素、G418、博來(lái)霉素、潮霉素、氨甲蝶呤、N-膦酰甲基甘氨酸、鏈霉素、磺酰脲、艮他霉素或膦絲菌素等。單獨(dú)選擇的標(biāo)記可以用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞(相對(duì)于缺少插入DNA的細(xì)胞)。為此目的，備選的標(biāo)記如營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記或篩選標(biāo)記(如GFP，綠色熒光蛋白)也是適當(dāng)?shù)?。?dāng)然，也可以完全省卻選擇性標(biāo)記，但是這會(huì)極大的增加對(duì)篩選的需要。如果需要無(wú)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也可用允許隨后除去標(biāo)記基因的方法，如共轉(zhuǎn)化、或序列特異性重組酶。一旦插入的DNA整合進(jìn)入植物細(xì)胞的基因組中，它通常在那里是穩(wěn)定的，并且還將保留在最初轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后代中。
如果土壤桿菌用于轉(zhuǎn)化，如上說(shuō)明的，必須將要插入的DNA克隆到特定的質(zhì)粒(居間載體或二元載體)中。由于居間載體中與T-DNA的序列同源的序列，居間載體可以通過(guò)同源重組整合到土壤桿菌的Ti或Ri質(zhì)粒中。質(zhì)粒還包含T-DNA轉(zhuǎn)移所必需的致病區(qū)(vir region)。居間載體不能在土壤桿菌中復(fù)制?？梢砸揽枯o助質(zhì)粒將居間載體轉(zhuǎn)移到根瘤土壤桿菌中(接合作用)。二元載體可以在大腸桿菌以及土壤桿菌中復(fù)制。它們包含用左右T-DNA邊界區(qū)域圍住的選擇性標(biāo)記基因和接頭或多聚接頭。它們可以直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(Holsters等人(1978)，Molecular and General Genetics163，181-187)。作為宿主細(xì)胞起作用的土壤桿菌應(yīng)當(dāng)包含攜帶致病區(qū)的質(zhì)粒。致病區(qū)對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中是必需的。還可以存在T-DNA。以這種方式轉(zhuǎn)化的土壤桿菌用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
在EP 120 515中已經(jīng)廣泛分析和充分描述了T-DNA用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的用途。
對(duì)于DNA到植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移，有利地可以用根瘤土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌培養(yǎng)植物外植體。之后在包含用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇的抗生素或殺生物劑的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，可以從感染的植物材料(如葉切片、柄節(jié)、根，還有原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的植物細(xì)胞)中再生完整植株。根據(jù)常規(guī)的再生方法，應(yīng)用已知的培養(yǎng)基進(jìn)行植物的再生。以這種方式得到的植物或植物細(xì)胞可以通過(guò)已建立的方法如DNA印跡法或PCR來(lái)分析插入DNA的存在。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知使用生物射彈方法或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化來(lái)插入外源DNA的其它可能性(見L.Willmitzer(1993)Transgenic Plants在Biotechnology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise中(publisherH.J.Rehm等人)，第2卷，627-659，VCH Weinheim，德國(guó))。
其間，通過(guò)Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)依靠根瘤土壤桿菌不僅很好的建立了雙子葉植物或其細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，還建立了單子葉植物或其細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(見Chan等人(1993)，Plant Mol.Biol.22，491-506等等)。
單子葉植物或其細(xì)胞轉(zhuǎn)化的備選系統(tǒng)包括依靠生物射彈方法轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.104，37-48；Vasil等人((1993)Bio/Technology 11，1553-1558；Ritala等人(1994)Plant Mol.Biol.24，317-325；Spencer等人(1990)，Theor.Appl.Genet.79，625-631)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、部分透化的細(xì)胞的電穿孔以及通過(guò)玻璃纖維插入DNA。
轉(zhuǎn)化細(xì)胞在植物中以通常方式生長(zhǎng)(另外見McCormick等人(1986)，Plant Cell Reports 5，81-84)。得到的植物可以正常培養(yǎng)，或與具有相同的轉(zhuǎn)化遺傳密碼或不同的遺傳密碼的植物進(jìn)行品種間雜交。得到的雜種個(gè)體具有相應(yīng)的表型特征。應(yīng)當(dāng)培養(yǎng)2代或更多代以確保表型特征穩(wěn)定的保留和傳遞。同樣，應(yīng)當(dāng)收獲種子以確保已經(jīng)將各自的表型或其它特征保留。
類似的，根據(jù)常規(guī)方法可以鑒定轉(zhuǎn)基因系，所述轉(zhuǎn)基因系對(duì)于新的核酸分子是純合的，并且可以分析它們關(guān)于病原體反應(yīng)性的存在或缺乏的表型行為以及將所述的表型行為與半合子系的行為比較。
當(dāng)然，包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的植物細(xì)胞還可以另外以細(xì)胞培養(yǎng)物的形式(包含原生質(zhì)體、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物等)培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明的方法可以有利地與賦予病原體抗性(例如針對(duì)昆蟲、真菌、細(xì)菌、線蟲等的抗性)、脅迫抗性或植物特征的另一種改進(jìn)的另外的方法組合。實(shí)施例和其它在Dunwell JM(2000)J Exp Bot.51487-496中提及。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因植物包含完整的植物以及植物的所有部分，其中根據(jù)本發(fā)明的植物過(guò)氧化物酶蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。這包括植物和植物器官的所有部分，例如葉、莖、種子、根、塊莖、花藥、纖維、根毛、柄、胚、愈傷組織、子葉(cotelydons)、葉柄、農(nóng)作物材料、植物組織、繁殖組織、來(lái)自轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞培養(yǎng)物和/或可以用來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的部分。
根據(jù)所用的載體系統(tǒng)，還可以根據(jù)本發(fā)明生成轉(zhuǎn)基因植物，其中要轉(zhuǎn)移的核酸作為獨(dú)立的復(fù)制系統(tǒng)包含在植物細(xì)胞或植物中。用于植物轉(zhuǎn)移的載體之后必須具有相應(yīng)的DNA序列，所述的DNA序列會(huì)促進(jìn)在細(xì)胞中用于轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒的復(fù)制。
在植物或植物細(xì)胞中的過(guò)氧化物酶蛋白質(zhì)的特異性表達(dá)根據(jù)本發(fā)明可以通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法證實(shí)和跟蹤。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道這些技術(shù)并且能容易地選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法，如用于檢測(cè)過(guò)氧化物酶特異性RNA或用于測(cè)定過(guò)氧化物酶特異性RNA積累的量的RNA印跡分析，或用于檢測(cè)編碼過(guò)氧化物酶的DNA序列的DNA印跡或PCR分析。用于此目的的探針或引物序列既可以與在SEQ ID No.1或3中給出的序列相同，也可以表現(xiàn)出與這些序列微小的不同。
當(dāng)然，上述技術(shù)還可以用于鑒定由于存在本發(fā)明所鑒定的過(guò)氧化物酶而具有非宿主抗性的另外的植物。
用于根據(jù)本發(fā)明的方法的植物原則上可以是任何要使其對(duì)病原體侵襲產(chǎn)生抗性的植物。優(yōu)選地，其為單子葉或雙子葉農(nóng)業(yè)植物、食用植物或飼料植物。
單子葉植物的實(shí)例是屬于下列屬的植物燕麥(Avena)、小麥(Triticum)、黑麥(Secale)、大麥(Hordeum)、稻(Oryza)、黍?qū)?Panicum)、狼尾草(Pennisetum)、Setaria(狗尾草)、高粱(Sorghum(millet))、玉米(Zea)等。
雙子葉農(nóng)業(yè)植物包括棉花、豆科植物(如豆類)，并且特別是苜蓿、大豆、油菜、蕓苔、番茄、甜菜、馬鈴薯、向日葵、觀賞植物及樹。另外的農(nóng)業(yè)植物可以包含水果(特別是蘋果、梨、櫻桃、葡萄、柑橘、菠蘿和香蕉)、油椰、茶樹、可可和咖啡樹、煙草、劍麻、以及藥用植物蘿芙木(Rauwolfia)和洋地黃(Digitalis)。特別優(yōu)選谷類小麥、黑麥、燕麥、大麥、稻、玉米和黍以及雙子葉植物甜菜、蕓苔、大豆、番茄、馬鈴薯和煙草。另外的農(nóng)業(yè)植物可以從美國(guó)專利號(hào)6,137,030中收集。
優(yōu)選的植物為金盞花、向日葵、擬南芥、煙草、辣椒、大豆、番茄、茄子、胡椒、胡蘿卜、馬鈴薯、玉米、萵苣和甘藍(lán)的類型、谷類、苜蓿、燕麥、大麥、黑麥、小麥、小黑麥、黍、稻、苜蓿、亞麻、棉花、大麻、Brassicacaes如油菜或蕓苔、甜菜、甘蔗、堅(jiān)果和果酒物種(wine species)或樹，如楊樹或紫杉。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)涉及根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物以及來(lái)自它的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、部分、轉(zhuǎn)基因繁殖材料用于產(chǎn)生食物和飼料、藥物或精細(xì)化學(xué)品的用途。
將來(lái)自大麥的過(guò)氧化物酶鑒定為介導(dǎo)大麥對(duì)小麥禾布氏白粉菌隔離群的非宿主抗性的基因及其在轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中用來(lái)介導(dǎo)病原體抗性的用途將分別在下文中解釋。下列實(shí)施例應(yīng)不解釋為限制。在本專利申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)、專利申請(qǐng)、專利和公布的專利申請(qǐng)的內(nèi)容在此引用作為參考。
實(shí)施例實(shí)施例1常規(guī)克隆方法克隆方法如限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段的純化、核酸到硝化纖維素膜和尼龍膜的轉(zhuǎn)移、DNA片段的連接、大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、細(xì)菌的培養(yǎng)和重組DNA的序列分析按照在Sambrook等人(2001)(見上)中所描述的進(jìn)行。
實(shí)施例2重組DNA的序列分析根據(jù)Sanger(Sanger等人(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)的方法使用ABI的激光熒光DNA序列分析儀進(jìn)行重組DNA分子的測(cè)序。
實(shí)施例3通過(guò)寡核苷酸指紋圖譜法鑒定大麥的HvBgt1
用寡核苷酸指紋法(Radelof等人(1998)Nucleic Acids Res.26(23)5358-64)鑒定大麥過(guò)氧化物酶基因HvBgt1為Bgt誘導(dǎo)的基因。這一方法允許鑒定即使是非常低表達(dá)的基因的表達(dá)圖式。
在用小麥霉感染的大麥植物的mRNA生成的文庫(kù)中鑒定HvBgt1(Bgt；葉組織的收獲時(shí)間6、24、48和72 h.p.i)。使用BASF公司開發(fā)的軟件HyStac，比較在此文庫(kù)中的個(gè)體簇的多度和作為參考的兩個(gè)另外的大麥文庫(kù)(用大麥霉(Bgh)接種的大麥和未接種的大麥)的多度。這一分析表明對(duì)于HvBgt1，在大麥+Bgt文庫(kù)中多度增加了大約10倍。
實(shí)施例4大麥品系的培養(yǎng)和霉感染大麥野生型品系Ingrid MLOBc用于實(shí)驗(yàn)。種子由Dr.PatrickSchweizer，IPK Gatersleben提供。
在將種子放在土壤上后，4℃培育24小時(shí)以用于分層的目的。之后將植物在受控制的生長(zhǎng)條件下放置在溫室(Agrarzentrum Limburgerhof，BASFAG)中。平均溫度是23℃，濕度在40％到70％之間。晝夜節(jié)律分別是10小時(shí)和14小時(shí)。播種7天后，用Bgh或Bgt接種植物。用于本實(shí)驗(yàn)的病原體大麥禾布氏白粉菌的隔離群FA6h由ETH Zurich at Heckenholz的研究工作站提供。病原體小麥禾布氏白粉菌是在the Agrarzentrum ofBASF AG在小麥變種Kanzler上培養(yǎng)的田間隔離群。對(duì)于感染，用Bgh嚴(yán)重感染的大麥植物或Bgt嚴(yán)重感染的小麥植物分別保持在需要被感染的大麥或擬南芥植物上面，并且將霉抖落使分生孢子轉(zhuǎn)移到植物上。
實(shí)施例5被感染的大麥植物的總RNA的分離在4天的時(shí)期后，每隔24小時(shí)收獲被感染的大麥材料和未被感染的對(duì)照，用鋁箔包住并且在干冰中深度冷凍。葉子材料儲(chǔ)存在-80℃下。在將葉子材料破碎為小片后，根據(jù)制造商的說(shuō)明借助于RNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen，Hilden，德國(guó))分離總RNA。用2×0.6ml的無(wú)RNA酶的水進(jìn)行純化的RNA的洗脫。用EPPENDORF BioPhotometer 6131確定濃度，并且隨后用2體積的98％的乙醇和1/10體積的醋酸鈉(3M，pH 5.2)沉淀RNA，并將其調(diào)整到大約2μg/μl的濃度。
實(shí)施例6通過(guò)定量PCR分析確定過(guò)氧化物酶的表達(dá)分離自葉子材料的RNA樣品用于定量PCR。首先，將仍殘余在RNA樣品中的任何DNA消化。用來(lái)自AMBION(Huntingdon，美國(guó))的DNA-freeTM按照下述準(zhǔn)備消化RNA 50μl10x DNA酶I緩沖液6μlDNA酶I(2U/μL) 2μlH2O加到60μl2μl將混合物在37℃下溫育30分鐘。之后加入9μl的DNA酶滅活試劑并且充分混合溶液。在室溫下進(jìn)行2分鐘額外的溫育時(shí)間后，將溶液在10,000g下離心1分鐘以沉淀DNA酶滅活試劑。將RNA轉(zhuǎn)移到新的容器中并且儲(chǔ)存在-20℃下。
在DNA酶消化后，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用APPLIEDBIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國(guó))的TaqMan Reverse Transcription Reagents進(jìn)行測(cè)定RNA6μl25mM MgCl24.4μldNTP-Mix(10mM) 4μl50μM隨機(jī)六聚體1μl10x RT緩沖液 2μlRNA酶抑制劑0.4μlMultiscribe RT(50U/μL)1.5μl無(wú)核酸酶的H2O 0.7μl混合物在25℃下溫育10分鐘，之后在37℃下溫育60分鐘。最后，在95℃下將混合物熱滅活5分鐘。
轉(zhuǎn)錄的DNA用20μl的H2O稀釋并且將其中的2.5μl用于定量PCR。將18S rRNA確定為內(nèi)標(biāo)。對(duì)所有樣品進(jìn)行重復(fù)三次測(cè)定。將混合物移液到96孔板中。首先單獨(dú)移液cDNA，之后單獨(dú)向SYBR GreenMaster Mix中添加引物和相應(yīng)量的水，并且將溶液混合。
cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip162，200nM0.09μl反向引物，Gip163，200nM0.14μl無(wú)核酸酶的H2O添加到25μl 9.77μlGip162CGAGGCCCTTGTGACATACATGip163ACTTAGGTGTCGTTACTTGGACCAT感染前各自的對(duì)照值作為參考樣品(0小時(shí))。對(duì)Bgh感染后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)取得的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄量的測(cè)定。
18S rRNA的準(zhǔn)備cDNA 2.5μl2x SYBR GreenMaster Mix 12.5μl正向引物，Gip63，200nM 0.12μl反向引物，Gip64，200nM 0.13μl無(wú)核酸酶H2O9.75μlGip63CGTCCCTGCCCTTTGTACACGip64AACACTTCACCGGACCATTCA平板在室溫和2,500轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)下離心1分鐘并且將樣品在來(lái)自APPLIED BIOSYSTEMS(Applera Deutschland GmbH，Darmstadt，德國(guó))的ABI PRISM 7000裝置中直接測(cè)量。使用APPLIED BIOSYSTEMS公司的ABI PRISM 7000 SDS程序進(jìn)行評(píng)估。
在表5和
圖1中說(shuō)明了使用定量PCR測(cè)定的表達(dá)數(shù)據(jù)。測(cè)量進(jìn)行了2次并且對(duì)單獨(dú)的測(cè)量值重復(fù)三次測(cè)定。所顯示的是各自的平均值以及相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)差。
表5在非宿主相互作用(大麥和Bgt)和宿主相互作用(大麥和Bgh)中HvBgt1的表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程的說(shuō)明對(duì)于每種相互作用測(cè)量的0小時(shí)值作為比較值或校準(zhǔn)物。
結(jié)果顯示了三種系統(tǒng)對(duì)照、非宿主相互作用和宿主相互作用之間HvBgt1表達(dá)的顯著性差異。記錄到對(duì)照中測(cè)量起始后直到48小時(shí)，轉(zhuǎn)錄量顯著增加了大約28倍，之后直到72小時(shí)的時(shí)間后這種增加幾乎保持恒定。另一方面，在非宿主相互作用(大麥Bgt)中，24小時(shí)后察覺到幾乎110倍的增加，之后這種增加在72小時(shí)后緩慢下降到10倍量。相比，在宿主相互作用(大麥Bgh)中，全部時(shí)間內(nèi)只察覺到了最大僅為3倍的轉(zhuǎn)錄量的增加。
實(shí)施例7通過(guò)RACE-PCR對(duì)大麥HvBgt1的全長(zhǎng)序列的分離將從感染的葉子材料中分離的RNA用于RACE-PCR。根據(jù)制造商的說(shuō)明用Invitrogen(Karlsruhe，德國(guó))的GeneRacerTM-Kit產(chǎn)生RACE cDNA文庫(kù)。作為基因特異性的引物(GSP)，引物M207用作5’RACE引物，并且引物M208用作嵌套引物。
M207GCTTATTCAGCAGCCAACAAAGTAACM208CTGTTTCACAAGTTTATGGTCCAAGTAA樣品PCR的準(zhǔn)備10x聚合酶緩沖液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(Hv-RACE文庫(kù)) 1μlGSP，M 207(10pmol)4μlGeneRacer X′Primer(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl)1μLH2O 33μlPCR程序 樣品嵌套PCR的準(zhǔn)備10x聚合酶緩沖液 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN1.5μl模板(PCR準(zhǔn)備) 5μlGSP，M207(10pmol) 4μl
GeneRacer X′nested primer，M 208(10pmol) 4.5μl聚合酶(5U/μl) 1μlH2O33μlPCR程序 基因HvBgt1的全長(zhǎng)序列在一些部分步驟中擴(kuò)增，隨后測(cè)序，并且之后在計(jì)算機(jī)芯片上匯編。由于序列的一部分通過(guò)3’RACE用聚腺苷酸延伸擴(kuò)增并且序列的另一部分通過(guò)5’RACE來(lái)擴(kuò)增，所以新的序列可以通過(guò)重疊群(contig)與原始序列連接。完整序列大約是1,000bp。序列所有可能的ORF依靠計(jì)算機(jī)程序ContigExpress(INFORMAX，Maryland，美國(guó))顯示。發(fā)現(xiàn)了一個(gè)延伸945bp長(zhǎng)的ORF。在起始的上游搜索另外的終止密碼子以檢驗(yàn)該基因是否是完整的。在5’方向的3個(gè)三聯(lián)體后發(fā)現(xiàn)了終止密碼子。
為了得到作為全長(zhǎng)克隆的基因，選擇允許完整基因擴(kuò)增(末端-末端PCR)的引物。之后將PCR片段從瓊脂糖凝膠中純化出來(lái)并且克隆到pCR4-TOPO載體中。HvBgt1的全長(zhǎng)核酸序列在SEQ ID No.1中說(shuō)明，并且氨基酸序列在SEQ ID No.2中說(shuō)明。
實(shí)施例8在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中與HvBgt1同源的基因的鑒定和克隆在得到大麥過(guò)氧化物酶(HvBgt1)的全長(zhǎng)序列后，用此序列進(jìn)行擬南芥基因組的BLAST搜索。鑒定了2種同源基因AtBgt1-1和AtBgt1-2。將這兩種基因用來(lái)自擬南芥cDNA的適當(dāng)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增，并且克隆到植物表達(dá)載體pCambia中，所述載體具有組成啟動(dòng)子以促進(jìn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)。
首先，使用Superscript First Strand Synthesis System forRT-PCR(INVITROGEN，Karlsruhe，德國(guó))將總RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，所述總RNA來(lái)自未被感染的擬南芥植物和用鏈格孢和蕓苔生鏈格孢(Alternaria brassicola)感染的擬南芥植物的混合物。
為了用鉑Pfx聚合酶(INVITROGEN，Karlsruhe，德國(guó))通過(guò)PCR從cDNA中擴(kuò)增出基因的全長(zhǎng)序列，根據(jù)AtBgt1-1或AtBgt1-2序列設(shè)計(jì)引物。AtBgt1-2要被擴(kuò)增的片段大小應(yīng)當(dāng)是1015bp。根據(jù)下列方案用兩種引物Fra335和Fra336進(jìn)行AtBgt1-2序列的擴(kuò)增10x聚合酶緩沖液，STRATAGENE(La Jolla，美國(guó)) 5μldNTP Mix(10mM)，INVITROGEN(Karlsruhe，德國(guó)) 1μlcDNA1μlFra335(20pmol) 1μlFra336(20pmol) 1μlTaq聚合酶(5U/μl) 1μlH2O 40μlFra335AGAAGTATGTTAAAGGTGGTGTTGTTGFra336TGACGAAGAGGTGATTATTGAGCPCR程序
在PCR片段從凝膠中純化后，將此序列亞克隆到pCRBlunt-II-TOPO載體(INVITROGEN，Karlsruhe，德國(guó))中，并且轉(zhuǎn)化到TOP10大腸桿菌細(xì)胞中。通過(guò)藍(lán)白篩選選擇出包含構(gòu)建體的菌落。從這些菌落中接種微量培養(yǎng)物以分離質(zhì)粒DNA。每種片段用三個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序(DNA Laboratory，BASF AG，Ludwigshafen，德國(guó))?？寺★@示為100％匹配序列，并且將片段用EcoRI從TOPO載體上切下并用凝膠電泳分離。將片段從凝膠中純化出來(lái)并且連接到用EcoRI切開的載體pCambia中。
實(shí)施例9大麥細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化、真菌病原體發(fā)育的過(guò)表達(dá)和評(píng)估用HvBgt1-DNA與GFP表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)化大麥cv Pallas的葉節(jié)。之后用Bgh接種葉子并且依靠光學(xué)顯微術(shù)和熒光顯微術(shù)在48小時(shí)后分析結(jié)果。GFP表達(dá)細(xì)胞的侵入依靠檢測(cè)活細(xì)胞中的吸器和通過(guò)評(píng)估在這些相同的細(xì)胞中真菌的發(fā)育來(lái)估計(jì)。在所有6個(gè)實(shí)驗(yàn)中，與用外源對(duì)照DNA(人甲狀腺激素受體，TR)轟擊的細(xì)胞相比，用HvBgt1轟擊大麥cv Pallas使得Bgh成功侵入的細(xì)胞量減少。
對(duì)于大麥細(xì)胞的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，使用了已經(jīng)描述的關(guān)于在大麥葉的表皮細(xì)胞中生物射彈插入DNA的方法(Schweizer P等人(1999)Mol PlantMicrobe Interact 12647-54)。用HvBgt1-DNA和作為轉(zhuǎn)化標(biāo)記的載體pGFP的質(zhì)粒DNA(GFP被pUBI啟動(dòng)子調(diào)控)一起來(lái)包被直徑為1.1μm的鎢顆粒(顆粒密度25mg/ml)。每次噴射使用下列量的DNA或報(bào)道基因質(zhì)粒用于包被1μgpGFP和2μg DNA。
對(duì)于微載體的制備，55mg的鎢顆粒(M17，直徑1.1μm；Bio-Rad，Munich，德國(guó))用1ml高壓滅菌的蒸餾水洗滌兩次并用1ml無(wú)水乙醇洗滌一次，干燥并且重懸浮在1ml 50％的甘油中(大約50mg/ml的貯存液)。將此溶液用50％的甘油稀釋到25mg/ml，使用前充分混合并且懸浮在超聲浴中。對(duì)于微載體的包被，將(每次噴射)1μg質(zhì)粒，2μgHvBgt1 DNA(1μL)，12.5μl鎢顆粒懸液(25mg/ml)，12.5μl 1M Ca(NO3)2溶液(pH 10)滴加到一起，同時(shí)持續(xù)攪拌，允許室溫下放置10分鐘，迅速離心并且從上清中移出20μl。包含鎢顆粒的剩余物重懸浮在超聲浴中并且在實(shí)驗(yàn)中使用。
對(duì)于轉(zhuǎn)化，使用長(zhǎng)度約4cm的大麥初生葉節(jié)。將組織放在培養(yǎng)皿(6.5直徑)中的0.5％phytagar(GibcoBRLTMLife TechnologiesTM，Karlsruhe，Germany)和20μg/ml的苯并咪唑上，并且在顆粒轟擊前在邊緣用具有尺寸為2.2cm×2.3cm的矩形剪切塊的模板直接覆蓋。將培養(yǎng)皿一個(gè)接一個(gè)放在真空室的底部(chweizer P等人(1999)Mol Plant Microbe Interact12647-54)，穿過(guò)真空泵在穿孔板上(底部上面5cm，巨載體下11cm，見下)插入作為擴(kuò)散器(diffusor)的尼龍網(wǎng)眼(網(wǎng)眼寬度0.2mm，Millipore，Eschborn)以分散任何的顆粒團(tuán)并且減緩顆粒流。粘貼在頂部的巨載體(塑料無(wú)菌濾器附件，13mm，Gelman Sciences，Swinney，英國(guó))用每次噴射5.8μl的DNA包被的鎢顆粒(微載體，見下)裝填。通過(guò)膜真空泵(Vacuubrand，Wertheim，德國(guó))將室中的壓力減少至0.9巴，并且用9巴的氦氣壓將鎢顆粒噴射到植物組織的表面。之后立即向室中通風(fēng)。對(duì)于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的標(biāo)記，用質(zhì)粒pGFP(基于pUC18的載體，具有插入的GFP基因的CaMV 35S啟動(dòng)子/終止子盒；Schweizer P等人(1999)Mol Plant MicrobeInteract 12647-54；Dr.P.Schweizer(Institute for Plant Genetics(IPK)，Gatersleben，德國(guó))提供)噴射葉子。在每次噴射另一質(zhì)粒前，用水徹底清洗巨載體。轟擊后，在培養(yǎng)皿輕微開啟、室溫和日光照射下培育4小時(shí)的時(shí)間后，用100個(gè)分生孢子/mm2的白粉病真菌(大麥禾布氏白粉菌，品種A6)接種葉子，并且在進(jìn)行感染跡象分析前在同樣的條件下培育額外的36到48小時(shí)。
用熒光顯微術(shù)和光學(xué)顯微術(shù)測(cè)定結(jié)果(例如侵入效率，定義為顯示出成熟吸器和二級(jí)延伸菌絲的被攻擊細(xì)胞的百分比)。用100個(gè)分生孢子/mm2接種導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞大約為50％的感染頻率。對(duì)于每個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)，要估計(jì)最少100個(gè)相互作用區(qū)域。當(dāng)用藍(lán)光刺激時(shí)鑒定轉(zhuǎn)化(GFP表達(dá))的細(xì)胞。鑒定了三類不同的轉(zhuǎn)化細(xì)胞1.包含大麥可識(shí)別吸器的被侵入的細(xì)胞。具有多于一個(gè)吸器的細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞評(píng)估。
2.已經(jīng)被真菌附著器攻擊卻不含吸器的細(xì)胞。被Bgh重復(fù)攻擊但是不含吸器的細(xì)胞按一個(gè)細(xì)胞評(píng)估。
3.未被Bgh攻擊的細(xì)胞。
本評(píng)估排除了氣孔細(xì)胞和氣孔次級(jí)細(xì)胞。依靠光學(xué)顯微術(shù)，或用0.1％的calcofluor(w/v在水中)將真菌熒光染色30秒來(lái)分析Bgh的表面結(jié)構(gòu)。在用calcofluor染色后，依靠熒光顯微術(shù)可以容易地評(píng)估真菌的發(fā)育。盡管在HvBGt1-DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中真菌發(fā)育了初級(jí)和附著芽管，但是它沒有發(fā)育吸器。吸器發(fā)育是次級(jí)菌絲形成的先決條件。
相對(duì)侵入效率(RPE)計(jì)算為用HvBgt1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中侵入效率和用對(duì)照DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中的侵入效率之間的比。百分比RPE(％-RPE)計(jì)算為RPE減去1并乘以100。
％-RPE＝100×(RPE-1)％-RPE值(與對(duì)照的平均侵入效率的偏差)用來(lái)測(cè)定用HvBgt1 DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的易感性。
在5個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中，關(guān)于Bgh侵入效率，在用對(duì)照DNA轉(zhuǎn)染和水轉(zhuǎn)染之間沒有觀察到差異。
為了排除HvBgt1 DNA影響感染細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率和生存率的可能性，對(duì)比了對(duì)照實(shí)驗(yàn)和HvBgt1 DNA實(shí)驗(yàn)間GFP表達(dá)細(xì)胞的數(shù)量。有趣的是，HvBgt1的過(guò)表達(dá)對(duì)總數(shù)目或受感染的GFP表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目沒有影響。
實(shí)施例10用HvBgt1對(duì)擬南芥的轉(zhuǎn)化，以及真菌抗性分析在Bechtold等人的真空滲入法(Bechtold N等人(1993)CR Acad SciParis，Life Sciences 3161194-1199)的改良方法(Steve Clough和AndrewBent(1998)Plant J 16(6)735-743)的基礎(chǔ)上，用根瘤土壤桿菌菌株(EHA105)轉(zhuǎn)化野生型的擬南芥植物(Columbia)。使用適用于根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化的二元表達(dá)載體如pCambia。
土壤桿菌轉(zhuǎn)化的初級(jí)轉(zhuǎn)化體的種子根據(jù)卡那霉素抗性進(jìn)行篩選。將抗生素抗性的幼苗種植在土壤中，并且用作完全發(fā)育的植物用于生物化學(xué)分析。
為了分析轉(zhuǎn)基因擬南芥植物對(duì)病原體真菌的抗性，用活體營(yíng)養(yǎng)的真菌寄生霜霉和二孢白粉菌進(jìn)行接種。
a)寄生霜霉用分生孢子孢子懸液(大約106個(gè)孢子/ml)噴霧5到8周齡的植物。將接種的植物用塑料袋覆蓋并且在大約16℃下冰箱中保持黑暗和潮濕過(guò)夜。第二天，輕輕打開塑料袋，并且隨后完全移除。接種6天后，再次用塑料袋覆蓋過(guò)夜，這能誘導(dǎo)孢子形成。在第二天，檢測(cè)葉子分生孢子梗的出現(xiàn)。在后面的幾天中，真菌的細(xì)胞間生長(zhǎng)導(dǎo)致在葉子中引起較輕的缺綠癥直到強(qiáng)壞死。將這些癥狀定量并且測(cè)試了顯著性。
b)二孢白粉菌在擬南芥植物上培養(yǎng)活體營(yíng)養(yǎng)的霉真菌。對(duì)于4周齡的表述轉(zhuǎn)基因HvBgt1的擬南芥植物的感染，用細(xì)小的刷子將分生孢子載體從葉子表面除去，并且刷到轉(zhuǎn)基因植物的葉子上。植物在20℃下培育7天。接種7天后，分生孢子載體在葉子上可見，并且在隨后的幾天后出現(xiàn)缺綠癥和壞死。將這些癥狀定量并且測(cè)試顯著性。
c)結(jié)果相比非轉(zhuǎn)基因野生型植物，表達(dá)HvBgt有義序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物在大多數(shù)情況下表現(xiàn)出對(duì)寄生霜霉和對(duì)二孢白粉菌顯著增加的抗性。
相比非轉(zhuǎn)基因野生型植物，表達(dá)AtBgt1或HvBgt1反義序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物表現(xiàn)出對(duì)寄生霜霉和對(duì)二孢白粉菌顯著增加的易感性。
1在非宿主相互作用(大麥(Ingrid)和Bgt)和宿主相互作用(大麥(Ingrid)和Bgh)中HvBgt1表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程的說(shuō)明。
在表5中所示的相對(duì)表達(dá)數(shù)據(jù)用相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)差說(shuō)明。結(jié)果顯示了在分析過(guò)程中非宿主相互作用中轉(zhuǎn)錄物的增加。
序列表<110>巴斯福植物科學(xué)有限公司<120>通過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物酶在轉(zhuǎn)基因植物中增加病原體抗性的方法<130>B 7661<160>12<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>945<212>DNA<213>大麥(Hordeum vulgare)<400>1atggcctcta cttcgtccct atcagtggtg ttgctcttgt gcctggccgt ggcggcgtcg 60gcgcagctgt cgccgacgtt ctaccaaacg acgtgcccga acgctctgtc caccatcaag 120gccgccgtga cggccgccgt gaacaatgag aaccgcatgg gcgcgtcgct gctccggctg 180cacttccacg actgcttcgt ccaaggttgt gacgcgtctg ttctgctgtc tggcatggaa 240caaaacgcgg cgccgaacgt catgtccctg cgaggcttcg aagtcataga cagcatcaag 300gcgaagctcg agaccatgtg caagcagacc gtctcctgcg ccgacatcct caccgtcgct 360gcccgcgatt ccgtcgtcgc cttgggaggg ccatcgtgga cggttccgct aggaaggagg 420gactccacca atgcaaacga agcagcggcg aactccgacc tacctccccc gttcttcgac 480ctcgtcaacc tcacccaatc cttcggcgac aagggcttca ccgtcaccga catggtcgcg 540ctctccggtg cccacaccat cggacaggcg cagtgccaga acttcaggga taggctctac 600aacgagacta acatcaactc cggcttcgcg acgtcgctca aggccaactg cccccggccg 660accggctccg gcgaccgcaa cctggccaat ctggacgtgt ctaccccgta ctcattcgac 720
aacgcctact acagcaacct caagtcccag aaggggctcc tgcactctga ccaggtgctc 780ttcaccggca cgggcggcgg cacggacaac atcgtcaaca acttcgcgag caacccagct 840gcgttcagcg gcgcctttgc ctcggccatg gtgaagatgg ggaacctcag cccattgact 900ggctctcagg ggcaggtcag gctgagctgc tccaaggtga attaa 945<210>2<211>314<212>PRT<213>大麥<400>2Met Ala Ser Thr Ser Ser Leu Ser Val Val Leu Leu Leu Cys Leu Ala1 5 10 15Val Ala Ala Ser Ala Gln Leu Ser Pro Thr Phe Tyr Gln Thr Thr Cys20 25 30Pro Asn Ala Leu Ser Thr Ile Lys Ala Ala Val Thr Ala Ala Val Asn35 40 45Asn Glu Asn Arg Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu His Phe His Asp50 55 60Cys Phe Val Gln Gly Cys Asp Ala Ser Val Leu Leu Ser Gly Met Glu65 70 75 80Gln Asn Ala Ala Pro Asn Val Met Ser Leu Arg Gly Phe Glu Val Ile85 90 95Asp Ser Ile Lys Ala Lys Leu Glu Thr Met Cys Lys Gln Thr Val Ser100 105 110
Cys Ala Asp IIe Leu Thr Val Ala Ala Arg Asp Ser Val Val Ala Leu115 120 125Gly Gly Pro Ser Trp Thr Val Pro Leu Gly Arg Arg Asp Ser Thr Asn130 135 140Ala Asn Glu Ala Ala Ala Asn Ser Asp Leu Pro Pro Pro Phe Phe Asp145 150 155 160Leu Val Asn Leu Thr Gln Ser Phe Gly Asp Lys Gly Phe Thr Val Thr165 170 175Asp Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly Gln Ala Gln Cys180 185 190Gln Asn Phe Arg Asp Arg Leu Tyr Asn Glu Thr Asn Ile Asn Ser Gly195 200 205Phe Ala Thr Ser Leu Lys Ala Asn Cys Pro Arg Pro Thr Gly Ser Gly210 215 220Asp Arg Asn Leu Ala Asn Leu Asp Val Ser Thr Pro Tyr Ser Phe Asp225 230 235 240Asn Ala Tyr Tyr Ser Asn Leu Lys Ser Gln Lys Gly Leu Leu His Ser245 250 255Asp Gln Val Leu Phe Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Asp Asn Ile Val260 265 270Asn Asn Phe Ala Ser Asn Pro Ala Ala Phe Ser Gly Ala Phe Ala Ser275 280 285
Ala Met Val Lys Met Gly Asn Leu Ser Pro Leu Thr Gly Ser Gln Gly290 295 300Gln Val Arg Leu Ser Cys Ser Lys Val Asn305 310<210>3<211>951<212>DNA<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3atgttaaagg tggtgttgtt gatgatgata atgatgttgg cgtcacagtc cgaggctcag 60ctgaaccgtg acttttacaa ggaaagctgt ccatcattgt tccttgtcgt gagacgagtc120gtgaaacggg ccgtggccag agagcctcgc atgggtgctt ctctccttcg tttgttcttc180catgattgtt ttgtcaatgg gtgtgacgga tccttactgt tggatgacac accgtctttt240ttgggagaga aaacctcagg acccagcaat aactctgtga gggggttcga agtgatcgac300aaaatcaagt ttaaggttga gaaaatgtgc ccgggcatcg tctcatgcgc agacattcta360gccatcactg ctcgggactc cgttctcctc ctaggtggac cggggtggag cgtgaaactt420ggaagaagag actctacgac ggcgaacttc gcggccgcga actccggagt catccctcct480ccgatcacta cccttagcaa cctcataaac cgtttcaaag cacaaggttt gtccacacgt540gacatggtcg ccctctctgg tgctcacacc attggacgag cccaatgtgt tacattcaga600aaccgaatct acaacgcaag caatatcgac acctctttcg ccatctctaa acggaggaac660tgtcctgcca ccagtggctc cggagacaac aagaaagcca atcttgacgt ccgctctccc720gataggttcg accacggctt ctacaagcaa cttctgagca aaaaaggttt gcttacgtca780gaccaagtcc tctttaataa tggtcctacc gactcgctcg tcatagctta cagccacaat840ctcaatgcct tctaccgcga ctttgcaagg gcaatgatta agatgggaga catcagcccc900
ctcaccggat ccaatggtca gatccgccaa aactgtcgga ggcccaactg a951<210>4<211>316<212>PRT<213>擬南芥<400>4Met Leu Lys Val Val Leu Leu Met Met Ile Met Met Leu Ala Ser Gln1 5 10 15Ser Glu Ala Gln Leu Asn Arg Asp Phe Tyr Lys Glu Ser Cys Pro Ser20 25 30Leu Phe Leu Val Val Arg Arg Val Val Lys Arg Ala Val Ala Arg Glu35 40 45Pro Arg Met Gly Ala Ser Leu Leu Arg Leu Phe Phe His Asp Cys Phe50 55 60Val Asn Gly Cys Asp Gly Ser Leu Leu Leu Asp Asp Thr Pro Ser Phe65 70 75 80Leu Gly Glu Lys Thr Ser Gly Pro Ser Asn Asn Ser Val Arg Gly Phe85 90 95Glu Val Ile Asp Lys Ile Lys Phe Lys Val Glu Lys Met Cys Pro Gly100 105 110Ile Val Ser Cys Ala Asp Ile Leu Ala Ile Thr Ala Arg Asp Ser Val115 120 125Leu Leu Leu Gly Gly Pro Gly Trp Ser Val Lys Leu Gly Arg Arg Asp130 135 140
Ser Thr Thr Ala Asn Phe Ala Ala Ala Asn Ser Gly Val Ile Pro Pro145 150 155 160Pro Ile Thr Thr Leu Ser Asn Leu Ile Asn Arg Phe Lys Ala Gln Gly165 170 175Leu Ser Thr Arg Asp Met Val Ala Leu Ser Gly Ala His Thr Ile Gly180 185 190Arg Ala Gln Cys Val Thr Phe Arg Asn Arg Ile Tyr Asn Ala Ser Asn195 200 205Ile Asp Thr Ser Phe Ala Ile Ser Lys Arg Arg Asn Cys Pro Ala Thr210 215 220Ser Gly Ser Gly Asp Asn Lys Lys Ala Asn Leu Asp Val Arg Ser Pro225 230 235 240Asp Arg Phe Asp His Gly Phe Tyr Lys Gln Leu Leu Ser Lys Lys Gly245 250 255Leu Leu Thr Ser Asp Gln Val Leu Phe Asn Asn Gly Pro Thr Asp Ser260 265 270Leu Val Ile Ala Tyr Ser His Asn Leu Asn Ala Phe Tyr Arg Asp Phe275 280 285Ala Arg Ala Met Ile Lys Met Gly AspIle Ser Pro Leu Thr Gly Ser290 295300Asn Gly Gln Ile Arg Gln Asn Cys Arg Arg Pro Asn305 310 315
<210>5<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5agaagtatgt taaaggtggt gttgttg27<210>6<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6tgacgaagag gtgattattg agc23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7cgaggccctt gtgacataca t 21<210>8<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>8acttaggtgt cgttacttgg accat 25<210>9<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9cgtccctgcc ctttgtacac20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10aacacttcac cggaccattc a 21<210>11<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11gcttattcag cagccaacaa agtaac 26<210>12<211>28
<212>DNA<2l3>人工的<220>
<223>引物<400>12ctgtttcaca agtttatggt ccaagtaa28
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生分別具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的方法，其特征在于將選自由i)包含由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或這些序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)DNA序列，其包含編碼具有在SEQ ID No.2或SEQ ID No.4中給出的氨基酸序列或其片段的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，iii)與在SEQ ID No.1或SEQ ID No.3中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性的DNA序列，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交，構(gòu)成的組并且編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列插入到植物或植物細(xì)胞中并且在其中表達(dá)。
2.分離的核酸分子，其含有選自由下列DNA序列構(gòu)成的組的核酸序列i)包含由SEQ ID No.1或此序列的片段編碼的核苷酸序列的DNA序列，ii)包含編碼具有在SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其片段的核苷酸序列的DNA序列，iii)包含核苷酸序列的DNA序列，所述的核苷酸序列與在SEQ IDNo.1中所給出的核苷酸序列有至少80％的序列同一性，和/或iv)包含核苷酸序列的DNA序列，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與i)到iii)的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的核酸分子，其中所述核酸序列來(lái)自大麥。
4.重組過(guò)氧化物酶蛋白質(zhì)，其由在權(quán)利要求1中給出的核酸序列編碼。
5.在5’-3’方向上包含下列元件的重組核酸分子-在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)序列，-有效連接到其上的權(quán)利要求1給出的DNA序列，-任選地，有效連接到其上的在植物細(xì)胞中作為轉(zhuǎn)錄、終止、和/或加A信號(hào)的調(diào)節(jié)序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組核酸分子，其特征在于DNA序列在組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選在35S CaMV或泛蛋白啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5的重組核酸分子，其特征在于DNA序列在組織特異性啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的重組核酸分子，其特征在于組織特異性啟動(dòng)子是表皮特異性啟動(dòng)子、葉肉特異性啟動(dòng)子或葉特異性啟動(dòng)子。
9.根據(jù)權(quán)利要求5的重組核酸分子，其特征在于DNA序列在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組核酸分子，其特征在于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是病原體誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于該方法包括下列步驟a)產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求5到10的任意一項(xiàng)的重組核酸分子，b)將步驟a)的重組核酸分子轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，并且任選地整合到植物基因組中，以及c)從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生植物。
12.轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其含有在權(quán)利要求1中所描述的核酸序列，或根據(jù)權(quán)利要求5到10的任意一項(xiàng)的重組核酸分子或通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1或11的方法得到。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，它比野生型細(xì)胞具有增加含量的根據(jù)權(quán)利要求4的蛋白質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，它比野生型細(xì)胞具有增加的病原體抗性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，它對(duì)霉、銹菌和/或殼針孢真菌具有增加的抗性。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，它對(duì)霉的專化型具有增加的抗性。
17.轉(zhuǎn)基因植物，其含有根據(jù)權(quán)利要求12到16的任意一項(xiàng)的植物細(xì)胞或根據(jù)權(quán)利要求11產(chǎn)生、以及這些植物的部分、這些植物的轉(zhuǎn)基因收獲產(chǎn)物和轉(zhuǎn)基因繁殖材料，如原生質(zhì)體、植物細(xì)胞、愈傷組織、種子、塊莖、插條以及此植物的轉(zhuǎn)基因后代。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物，優(yōu)選地屬于下列屬燕麥、小麥、黑麥、大麥、稻、黍?qū)?、狼尾草、狗尾草、高粱、玉米等的植物?br> 19.根據(jù)權(quán)利要求17的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物，優(yōu)選地是棉花、豆科植物如豆類并且特別是苜蓿、大豆、油菜、蕓苔、番茄、甜菜、馬鈴薯、觀賞植物、向日葵、煙草及樹。
20.在權(quán)利要求1中給出的DNA序列用于產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的用途。
21.權(quán)利要求1中給出的DNA序列用于鑒定對(duì)病原體表現(xiàn)出非宿主抗性的植物的用途。
22權(quán)利要求1中給出的DNA序列用作谷類中非宿主抗性標(biāo)記的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物和/或植物細(xì)胞的方法，其特征在于將編碼具有過(guò)氧化物酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列插入植物中并且在其中表達(dá)。本發(fā)明還涉及編碼過(guò)氧化物酶的核酸在產(chǎn)生具有增加的病原體抗性的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞中的用途。本發(fā)明還涉及來(lái)自大麥的編碼過(guò)氧化物酶的核酸序列。
文檔編號(hào)A01H5/02GK1973045SQ200580020556
公開日2007年5月30日 申請(qǐng)日期2005年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月24日
發(fā)明者M·弗蘭克, R－M·史密特, S·施托伊德 申請(qǐng)人:巴斯福植物科學(xué)有限公司