專利名稱：一種軟米育種方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，更具體地涉及植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
軟米是我國云南省特有的優(yōu)質(zhì)米，也是目前世界上正在興起的一種新型稻米(宣文敏，農(nóng)業(yè)與技術(shù)，2002(3)67-69，74)。軟米米質(zhì)界于糯性與粘性之間。天然軟米最大的特點是稻米直鏈淀粉含量較低，一般小于10％(趙則勝等，中國特種稻，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，199549；宋文昌等，特種稻栽培與利用，科學(xué)出版社，199711-12)，這樣的軟米是制作我國馳名的“過橋米線”的專用稻米，同時還能被用于制作飯團(tuán)等快餐食品的原料。隨著人們生活節(jié)奏的加快和生活方式的改變，用于制作快餐食品重要原料軟米的市場需求量也將會增加。
天然軟米主要分布在云南省的德宏傣族自治州和保山地區(qū)的部分縣，在臨滄地區(qū)的耿馬、云和、雙江、永德等地也有少量栽培。軟米地方品種的株高一般約175cm，高的可達(dá)205cm，雖莖稈粗壯，但葉較披散而色較淡，而且產(chǎn)量較低，每畝約250kg。天然的軟米品種被異地種植后，往往難于保持其原有的優(yōu)良品質(zhì)(董保柱，云南農(nóng)業(yè)科技，2000，513-15)。上海農(nóng)科院作物所曾經(jīng)開展過軟米引種研究，最終因為云南軟米在上海地區(qū)無法保持其原有的優(yōu)良品質(zhì)而終止了此項研究。
近年來根據(jù)市場需要，我國有些省份已相繼利用雜交育種技術(shù)培育出一些優(yōu)質(zhì)的軟米新品種。但是采用常規(guī)方法進(jìn)行水稻育種，不僅操作煩瑣、盲目性太大、所需時間長，而且有些不良的農(nóng)藝性狀有時很難去除，育種目標(biāo)與結(jié)果往往比較難做到一致。自20世紀(jì)70年代隨著基因工程技術(shù)的建立與完善，使利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良作物品質(zhì)已成為可能。如在常規(guī)育種中結(jié)合采用轉(zhuǎn)基因方法培育優(yōu)質(zhì)軟米，不僅可以在較短時間內(nèi)達(dá)到目的，而且大多不改變受體水稻的其它農(nóng)藝性狀，效果顯著。
稻米直鏈淀粉主要由編碼“結(jié)合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的蠟質(zhì)基因(Waxy)催化合成的(Okagaki等，Genetics，1988，1201137-1143)。目前已有報道表明導(dǎo)入水稻蠟質(zhì)基因(Waxy)反義片段能夠有效降低稻米直鏈淀粉含量(Shimada H，et al，Theor ApplGenet，1993，86(6)665-672；Terada R，et al，Plant Cell Physiol，2000，41(7)881-888；王新其等，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，18(增刊)69-73；陳秀花等，科學(xué)通報，2002，47(9)684-688；劉巧泉等，Transgenic Res，2003，1271-82；李建粵等，科學(xué)通報，2004，49(24)2556-2561；沈革志等，植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2004，30(6)637-643)?，F(xiàn)有的利用反義蠟質(zhì)基因降低水稻稻米直鏈淀粉含量的報道，都是利用p13W4或p13W8兩種只帶有一份反義蠟質(zhì)基因的載體(圖1a和b)轉(zhuǎn)化水稻，達(dá)到降低稻米直鏈淀粉含量的目的。但是分析這些已有的報道，從所有轉(zhuǎn)基因后代中，稻米直鏈淀粉含量位于云南特種軟米范圍的后代比例都較低。這是由于目前人們使用的轉(zhuǎn)化載體都是將一份蠟質(zhì)基因反義片段構(gòu)建在一個T-DNA區(qū)段上，利用含有這些載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻獲得的轉(zhuǎn)基因后代，往往是單拷貝整合的后代比多拷貝整合的后代數(shù)量多。
李建粵等采用p13W4和p13W8兩種載體(來自中科院上海植物生理與生態(tài)研究所王宗陽研究員)轉(zhuǎn)化不同的水稻品種，獲得轉(zhuǎn)基因后代。在單獨使用含有p13W4根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化上師大2號品系時，由5塊抗性愈傷分化獲得轉(zhuǎn)基因苗。利用PCR(圖3)和Southern blot(圖4)檢測轉(zhuǎn)基因T0代植株，4個轉(zhuǎn)基因后代外源基因呈單拷貝整合，其中有一個植株為雙拷貝整合(圖4中第4泳道)。從T0代植株上收獲T1代種子，采用比色法分析轉(zhuǎn)基因T1代種子和未轉(zhuǎn)基因種子糙米直鏈淀粉含量。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)反義蠟質(zhì)基因的對照糙米直鏈淀粉平均含量為14.7％，4個單拷貝植株糙米直鏈淀粉平均含量分別為12.9％、13.0％、14.2％和13.7％，糙米直鏈淀粉含量比對照有不同程度的降低，但降低幅度相對較小；由雙拷貝整合的植株T1代種子糙米直鏈淀粉含量平均為6.8％，比對照降低53.4％，與對照差異經(jīng)統(tǒng)計分析達(dá)極顯著的水平。然而，這種利用一份蠟質(zhì)基因的載體轉(zhuǎn)化所獲得的雙拷貝、多拷貝整合的后代數(shù)量畢竟比較少，用于育種則帶有偶然的成分，使育種的過程的不可預(yù)測性增加。
另外，隨著商業(yè)化植物轉(zhuǎn)基因品種的不斷出現(xiàn)，基因工程食品的安全性問題越來越引起人們的關(guān)注?；蚬こ淌称钒踩詥栴}主要是由于抗生素或耐除草劑等抗性選擇標(biāo)記基因存留于轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的，獲得不帶有抗性選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，對于轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用極為重要?，F(xiàn)有的利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化法培育轉(zhuǎn)基因后代，均需要利用抗性選擇標(biāo)記基因來篩選轉(zhuǎn)化子，而且獲得無抗性選擇標(biāo)記基因，同時目的基因呈雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株的概率比較小，即便獲得目的基因呈雙拷貝整合的轉(zhuǎn)基因植株，由于兩個拷貝整合在水稻基因組的不同位點，篩選兩個T-DNA整合位點都純合的轉(zhuǎn)基因后代也比較困難。
為了更有效地利用反義蠟質(zhì)基因培育直鏈淀粉含量介于云南軟米范圍的特種水稻，有必要重新建立一種利用反義蠟質(zhì)基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化粳稻和秈稻進(jìn)行育種的方法。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種軟米育種方法及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有的雜交育種操作煩瑣、盲目性大、所需時間長、不良性狀難以去除、育種目標(biāo)與結(jié)果難以一致的缺陷；以及現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因方法只轉(zhuǎn)化一份蠟質(zhì)基因反義片段，多份拷貝整合的后代數(shù)量少、篩選兩個只有目的基因的T-DNA整合位點都純合的轉(zhuǎn)基因后代比較困難、后代稻米直鏈淀粉含量仍較高、帶有耐抗生素基因等抗性選擇標(biāo)記基因帶來基因工程食品安全性問題的缺陷。
技術(shù)方案 本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供一種軟米育種方法，包括如下步驟 (1)水稻組織經(jīng)培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)化受體組織； (2)受體組織和帶有雙份反義蠟質(zhì)基因和報告基因的載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)； (3)培養(yǎng)組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基獲得再生植株； (4)轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)檢測確定為共轉(zhuǎn)化的T0代轉(zhuǎn)化子； (5)從T0代轉(zhuǎn)化子收獲T1代種子，利用報告基因檢測T1代種子獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的后代； (6)收獲T2代種子，并對T2代植株進(jìn)行導(dǎo)入載體的檢測，從中篩選獲得反義蠟質(zhì)基因為雙份整合的純合轉(zhuǎn)基因后代。
上述的軟米育種方法的優(yōu)選方案為，所說的步驟(2)中雙份反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)化載體為具有圖2(c)所示結(jié)構(gòu)表達(dá)載體。
上述的軟米育種方法的另一優(yōu)選方案為，所說的步驟(1)中經(jīng)組織培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)化受體組織的水稻材料為授粉后的幼胚或由水稻成熟種子誘導(dǎo)成的愈傷組織。幼胚的選擇優(yōu)選授粉后12-15天的幼胚；所說的幼胚組織培養(yǎng)的時間為3到5天，優(yōu)選為4天。成熟種子誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織優(yōu)選經(jīng)過一次繼代培養(yǎng)。
上述的軟米育種方法的另一優(yōu)選方案為，所說的步驟(2)中的根癌農(nóng)桿菌還帶有潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因及gus報告基因。
上述的軟米育種方法的另一優(yōu)選方案為，所說的步驟(4)中轉(zhuǎn)基因植株的檢測是利用PCR檢測或者Southern blot方法分析植株的DNA。
上述的軟米育種方法的另一優(yōu)選方案為，所說的步驟(5)中的檢測是采用稻米中報告基因的檢測來獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的種子，報告基因優(yōu)選為gus基因。所說的步驟(6)中利用PCR檢測T2代植株反義蠟質(zhì)基因為雙份整合的純合轉(zhuǎn)基因后代。
本發(fā)明的內(nèi)容之二是提供所述軟米育種方法的應(yīng)用，即利用上述步驟(1)至(5)轉(zhuǎn)化水稻，優(yōu)選以帶有雙份反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)化載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化禾本科植物。
上述的軟米育種方法的應(yīng)用的一種特例為，以所說的帶有雙份反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)化載體p13AW-2的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻，優(yōu)選轉(zhuǎn)化稻米直鏈淀粉含量小于15％的粳稻或者秈稻品系或品種獲得軟米新品種。
有益效果 (1)利用雜交育種技術(shù)可以培育出一些優(yōu)質(zhì)的軟米新品種，但采用常規(guī)方法進(jìn)行水稻育種，不僅操作煩瑣、盲目性太大、所需時間長，而且有些不良的農(nóng)藝性狀有時很難去除，育種目標(biāo)與結(jié)果往往比較難做到一致，本發(fā)明提供的軟米育種方法使有效地利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在較短時間內(nèi)達(dá)到改良稻米品質(zhì)的目的已成為可能。
(2)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行軟米育種，都是利用反義蠟質(zhì)基因p13W4或p13W8兩種單份反義蠟質(zhì)基因載體(圖1)轉(zhuǎn)化水稻。本發(fā)明提供的軟米育種的方法，是以含雙份反義蠟質(zhì)基因的表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)共轉(zhuǎn)化粳稻和秈稻，可更有效降低稻米直鏈淀粉含量，得到軟米品種。
(3)利用p13W4載體單獨轉(zhuǎn)化水稻或利用p13W8載體共轉(zhuǎn)化水稻的方法所獲得的稻米，其所有轉(zhuǎn)基因后代中，單拷貝整合的后代比多拷貝整合的后代數(shù)量多，造成后代的稻米直鏈淀粉含量位于云南特種軟米范圍的比例都較低，本發(fā)明的軟米育種方法使轉(zhuǎn)基因后代中保持高比例的低直鏈淀粉稻米。
(4)利用共轉(zhuǎn)化法將分別含有抗性選擇標(biāo)記基因載體和只含有反義蠟質(zhì)基因載體(p13W8，圖1b)轉(zhuǎn)化水稻，可以培育出直鏈淀粉含量比對照降低的轉(zhuǎn)基因后代，但獲得雙拷貝轉(zhuǎn)基因植株的概率比較小，而且即便獲得雙拷貝整合的轉(zhuǎn)基因植株，由于兩個拷貝整合在水稻基因組的不同位點，篩選兩個T-DNA整合位點都純合的轉(zhuǎn)基因后代也比較困難。本發(fā)明提供的方法可以有效地獲得雙份反義蠟質(zhì)基因整合的轉(zhuǎn)基因植株，且兩份反義蠟質(zhì)基因整合在水稻基因組的同一染色體上，并呈緊密連鎖，便于篩選純合子。
(5)天然的軟米品種被異地種植后，往往難于保持其原有的優(yōu)良品質(zhì)，利用本發(fā)明的育種方法轉(zhuǎn)化本地適種的品種，可以解決這一問題。
(6)軟米地方品種的產(chǎn)量較低，每畝約250kg，利用本發(fā)明的育種方法轉(zhuǎn)化一些高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品種可以大幅提高軟米產(chǎn)量。
(7)本發(fā)明的育種方法不但可以適用于粳稻品種或種系，也適用于秈稻品種或種系。
(8)最為重要的是，本發(fā)明提供的育種方法采用從T0代共轉(zhuǎn)化子植株上收獲T1代種子，利用稻米gus報告基因的檢測來獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的種子；再利用PCR檢測T2代植株得到反義蠟質(zhì)基因為雙份的純合轉(zhuǎn)基因后代的檢測鑒定方法，無須通過抗性標(biāo)記進(jìn)行篩選，所獲的軟米品種不帶有耐抗生素或耐除草劑等抗性選擇標(biāo)記基因以及不含有來自于花椰菜花葉病毒的35S啟動子，在育種過程中避免了基因工程食品安全性問題的困擾，對于轉(zhuǎn)基因作物的推廣應(yīng)用意義重大。
本文所用的術(shù)語“軟米”是指原產(chǎn)我國云南省特有的優(yōu)質(zhì)米，其米質(zhì)界于糯性與粘性之間，稻米的直鏈淀粉含量較低，一般小于10％。
本文所用的術(shù)語“蠟質(zhì)基因(Waxy)”是指編碼“結(jié)合于淀粉粒上的淀粉合成酶”(GBSS)的基因。
本文所用的術(shù)語“p13AW-2表達(dá)載體”是指具有圖2所示結(jié)構(gòu)特征的表達(dá)載體。
本文所用的術(shù)語“PCR方法”是指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的基因擴(kuò)增方法。
本文所用的術(shù)語“Southern blot方法”是指DNA印跡雜交的方法。
本文所用的術(shù)語“CaMV 35S基因終止子”是指來自于花椰菜花葉病毒的35S終止子。
本文所用的術(shù)語“gus基因”是指β-葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)基因。
本文所用的術(shù)語“T-DNA”是指根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蚪M中可轉(zhuǎn)移并整合到寄主植物細(xì)胞染色體上去的特定DNA片段，亦即一種轉(zhuǎn)位單元。



圖1是兩種能夠用于降低稻米直鏈淀粉含量的雙元載體p13W4(a)和p13W8(b)T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)圖。圖中，232Wx-pro、232Int.l水稻232Waxy基因的啟動子和第一內(nèi)含子；Wx frag水稻232Waxy基因的反義DNA片段(756bp)；LB、RBT-DNA的左右邊界；Nos-terNos基因終止子；35S-pro、35S-terCaMV 35S基因啟動子和終止子；HPt潮霉素抗性基因；gusβ-葡萄糖醛酸糖苷酶基因；XhXhoI；EEcoRI；SaSacI；BBamHI；XXbaI；SSalI；PPstI；HHindIII。
圖2是無抗性標(biāo)記基因和35S啟動子的雙份反義蠟質(zhì)基因載體p13AW-2(c)T-DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)圖。圖中，Wx-pro、Int.l水稻W(wǎng)axy基因的啟動子和第一內(nèi)含子；Wx frag水稻W(wǎng)axy基因的反義DNA片段；LB、RBT-DNA的左右邊界；Terminator基因終止子。
圖3是轉(zhuǎn)基因水稻PCR檢測結(jié)果。M標(biāo)準(zhǔn)DNA；1p13W4載體；2未轉(zhuǎn)基因?qū)φ账荆?-7轉(zhuǎn)基因水稻。
圖4是轉(zhuǎn)基因水稻Southern blot分析結(jié)果。1p13W4載體；2-6轉(zhuǎn)基因水稻；7未基因?qū)φ账尽?br>
具體實施例方式 下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
下列實施例中涉及的細(xì)菌轉(zhuǎn)化、PCR方法和Southern blot方法等主要參考《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克J等，分子克隆實驗指南(第二版)，科學(xué)出版社，1992)。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 本實施例是描述利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將p13AW-2表達(dá)載體導(dǎo)入粳稻品種培育粳型軟米的方法。
水稻品種上師大2號、超2-10等粳稻品系或品種。
根癌農(nóng)桿菌菌種和質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105來自于中國科學(xué)院上海植物生理和生態(tài)研究所，質(zhì)粒p13AW-2來自于上海師范大學(xué)。
培養(yǎng)基和化學(xué)試劑培養(yǎng)基N6D2，N6D2C，N6D2S1，N6D2S2，MSRCH和1/2MS0H的成分和化學(xué)試劑見文獻(xiàn)(劉巧泉等，植物生理學(xué)報，1998，24(3)259-271)。
水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化受體組織的預(yù)處理取授粉后12-15天的幼胚，按照文獻(xiàn)(顏昌敬主編，1991，農(nóng)作物組織培養(yǎng)，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社)的方法，經(jīng)表面消毒后接種于N6D2培養(yǎng)基上，于26℃黑暗條件下培養(yǎng)4天。也可以取水稻的成熟種子，經(jīng)滅菌后切取半粒保留胚部分的1/2種子接種于N6D2培養(yǎng)基上。由成熟胚制備轉(zhuǎn)化受體組織的方法參照文獻(xiàn)(李建粵等，科學(xué)通報，2004，49(24)2556-2561)。
根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和水稻轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化方法主要參考文獻(xiàn)(Hiei Y等，Plant J，1994，6271-282)的方法，并有改動。將分別帶有p13AW-2載體和帶有潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因及gus報告基因載體的根癌農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)至OD600為0.4-0.55左右時離心收集菌體并重現(xiàn)懸浮于AAM培養(yǎng)基(Hiei Y等，Plant J，1994，6271-282)，再將兩種根癌農(nóng)桿菌以9∶1的比例混合。水稻受體組織浸入AAM混合菌液30-60分鐘，取出吸干多余菌液，轉(zhuǎn)移至N6D2C培養(yǎng)基，于26℃黑暗共培養(yǎng)3-4天。取出組織吸干菌液，轉(zhuǎn)入N6D2S1培養(yǎng)基培養(yǎng)。
植株再生培養(yǎng)組織轉(zhuǎn)入N6D2S2培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2周后，將生長旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)至再生培養(yǎng)基MSRCH上，光照14h/d培養(yǎng)，分化獲得小苗。再轉(zhuǎn)入1/2MS0H培養(yǎng)基使植株生根后，移入溫室培育獲得T0代植株。
轉(zhuǎn)基因植株檢測轉(zhuǎn)基因水稻利用PCR檢測和Southern blot分析其總DNA，確定T0代中的共轉(zhuǎn)化子。
從T0代共轉(zhuǎn)化子植株上收獲T1代種子，采用稻米gus報告基因的檢測可以獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的種子。再利用PCR檢測T2代植株可得到反義蠟質(zhì)基因為雙份的純合轉(zhuǎn)基因后代。
從每個單株的穗子頂端取30-50粒種子，采用比色法(Juliano，B.O.，Cereal Sci.Today，1971，16334)分析轉(zhuǎn)基因T1代種子和未轉(zhuǎn)基因種子糙米直鏈淀粉含量。每個樣品重復(fù)檢測三次，并采用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析。將稻米直鏈淀粉含量低于10％的，介于我國云南特種軟米范圍內(nèi)單植后代留種。以同樣的方法檢測含有兩份反義蠟質(zhì)基因純合的轉(zhuǎn)基因后代種子的直鏈淀粉含量。
繼續(xù)繁殖一代，觀察轉(zhuǎn)基因后代稻米直鏈淀粉含量性狀的穩(wěn)定性。
實施例2 本實施例是描述利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將p13AW-2表達(dá)載體導(dǎo)入秈稻品種培育秈型軟米的方法。
水稻品種選取直鏈淀粉含量約為15％秈稻品種嘉早312和嘉早935。
根癌農(nóng)桿菌菌種和質(zhì)粒、培養(yǎng)基和化學(xué)試劑等方法按照實施例1。水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化受體組織的預(yù)處理、根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、植株再生等方法按照陳秀花等人的報道(陳秀花等，江蘇農(nóng)業(yè)研究，2001，22(1)1-6)。水稻轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株檢測等方法按照實施例1。
按照上述方法轉(zhuǎn)化秈型水稻品種，同樣可以大幅度降低稻米直鏈淀粉含量，培育秈型軟米。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨引用作為參考那樣。
權(quán)利要求
1.一種軟米育種方法，包括如下步驟
(1)水稻組織經(jīng)培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)化受體組織；
(2)受體組織和帶有雙份反義蠟質(zhì)基因和報告基因的載體的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；
(3)培養(yǎng)組織轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選后，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基獲得再生植株；
(4)轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)檢測確定為共轉(zhuǎn)化的T0代轉(zhuǎn)化子；
(5)從T0代轉(zhuǎn)化子收獲T1代種子，利用報告基因檢測T1代種子獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的后代；
(6)收獲T2代種子，并對T2代植株進(jìn)行導(dǎo)入載體的檢測，從中篩選獲得反義蠟質(zhì)基因為雙份整合的純合轉(zhuǎn)基因后代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(2)中雙份反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)化載體為帶有圖2(c)所示結(jié)構(gòu)的表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(1)中經(jīng)組織培養(yǎng)制備轉(zhuǎn)化受體組織的水稻材料為授粉后的幼胚或由成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(1)中幼胚組織培養(yǎng)的時間為3到5天或者成熟種子誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷經(jīng)一次繼代培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(2)中的根癌農(nóng)桿菌還帶有潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因及gus報告基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(4)中轉(zhuǎn)基因植株的檢測是利用PCR檢測或者Southern blot方法分析植株的DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(5)中的檢測是采用稻米中g(shù)us報告基因的檢測來獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的種子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的軟米育種方法，其特征在于，所說的步驟(6)中的檢測是利用PCR檢測植株DNA。
9.權(quán)利要求1所述的軟米育種方法的應(yīng)用，即利用上述步驟(1)至(5)轉(zhuǎn)化禾本科植物，其特征在于，利用帶有雙份反義蠟質(zhì)基因的轉(zhuǎn)化載體的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的軟米育種方法的應(yīng)用，其特征在于，以所說的帶有雙份反義蠟質(zhì)基因轉(zhuǎn)化載體p13AW-2的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化稻米直鏈淀粉含量小于15％的粳型或秈型水稻品系或品種獲得軟米新品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種軟米育種方法，特別是指利用摘要附圖中(c)所示的基因序列轉(zhuǎn)化水稻品系或品種。包括以帶有雙份反義蠟質(zhì)基因表達(dá)載體及報告基因載體的根癌農(nóng)桿菌共轉(zhuǎn)化受體組織，轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)檢測確定為共轉(zhuǎn)化T0代，通過后代稻米GUS活性檢測獲得無抗性選擇標(biāo)記基因的種子，再采用PCR方法對T2代進(jìn)行導(dǎo)入載體的檢測，篩選獲得反義基因為雙份整合的純合轉(zhuǎn)基因后代的方法。利用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化禾本科植物如水稻，可快速獲得不含抗性選擇標(biāo)記基因的低直鏈淀粉含量的新型軟米品種。
文檔編號A01H1/04GK1957679SQ200510110050
公開日2007年5月9日 申請日期2005年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者李建粵, 楊麗君, 尹中明, 周永國, 沈忠偉 申請人:上海師范大學(xué)