專利名稱：一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，利用小麥品種南大2419和小麥品種望水白及其雜交后代提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率，屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域和應(yīng)用基因組研究領(lǐng)域。
二、技術(shù)背景小麥作為世界上的主要糧食作物之一，有著最大的種植面積和消費(fèi)人口。長(zhǎng)期以來，育種工作者廣泛開展了小麥的遺傳改良研究，促進(jìn)了小麥生產(chǎn)的不斷發(fā)展。但是，社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，對(duì)小麥生產(chǎn)提出了更高要求，常規(guī)育種方法雖然在新品種的選育方面發(fā)揮了重大作用，但在有效的實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代育種目標(biāo)方面存在較大局限性。以遺傳轉(zhuǎn)化為核心內(nèi)容的現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用，及其與常規(guī)育種技術(shù)的緊密結(jié)合，為小麥遺傳改良向更高水平發(fā)展展現(xiàn)了廣闊的前景。當(dāng)前，隨著生物基因組研究的進(jìn)展，大量功能基因被克隆，通過對(duì)單個(gè)或多個(gè)基因的遺傳轉(zhuǎn)化改變植物的生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)性、產(chǎn)量與品質(zhì)已成為現(xiàn)實(shí)。
然而，小麥屬于比較難轉(zhuǎn)化的禾谷類作物之一，遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展比較緩慢。目前，主要有三個(gè)小麥遺傳轉(zhuǎn)化的方法基因槍法、花粉管通道法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。早期引人注目的是Vasil(1992)首次用基因槍法獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株，隨后，通過該法進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化陸續(xù)有成功的報(bào)道，但轉(zhuǎn)化效率較低0.2％(Weeks et al.，1993)；1.3％(Becker et al.，1994)；1.2％(Nehra etal.，1994)；0.15％(Zhou et al.，1995)；1.5％(Altpeter et al.，1996)；0.9％(Barro et al.，1997)；0.25-1.2％(Wirtzens et al.，1998)；0.2-1％(Iser et al.，1999)；5％(Pastori，2001)；3.9±1.6％(Gaunt S etal.，2003)，另外，基因槍介導(dǎo)法也存在多拷貝插入、遺傳穩(wěn)定性差以及價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)?；ǚ酃芡ǖ婪ㄊ浅晒Λ@得轉(zhuǎn)基因小麥的另外一個(gè)方法，該法的研究主要集中在國(guó)內(nèi)(閻新甫等，1994；成卓敏等，1996；郭太寶等，1996；倪建福等，1999；王立新等，2001；劉學(xué)春等，2002)，雖然學(xué)術(shù)界對(duì)此法尚存爭(zhēng)議，但它不需要昂貴的設(shè)備和復(fù)雜的離體培養(yǎng)過程，在轉(zhuǎn)移多基因控制的數(shù)量性狀上是一個(gè)值得研究的轉(zhuǎn)化體系。第三種方法是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，與基因槍法、花粉管通道法相比較，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成本低，可以轉(zhuǎn)化較大片段的DNA序列，單拷貝整合率高而且外源基因在轉(zhuǎn)基因植株后代中呈孟德爾遺傳。1983年，第一株通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因煙草問世，很快這一方法就成為雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的主導(dǎo)方法。與此同時(shí)，一些科學(xué)家專門為驗(yàn)證農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥的可行性而設(shè)計(jì)了農(nóng)桿菌的感染實(shí)驗(yàn)，證明了小麥細(xì)胞的可轉(zhuǎn)化性(Grave，1988；Mooney，1991)。接著，Hess等(1992)報(bào)道直接將農(nóng)桿菌接種到小麥小穗并獲得具有抗生素抗性和經(jīng)Southern Blot雜交證明的轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株，外源基因在T1和T2的部分個(gè)體中仍能被檢測(cè)到。然而，Langridge等(1992)在用同樣的方法得到的T1和T2中卻未能檢測(cè)到外源基因的存在。直到1997年，在這一方面才取得了突破性進(jìn)展Cheng等(1997)經(jīng)過多年的研究初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)體系，獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株。夏光敏(Xia，1999)也以繼代兩個(gè)月到兩年的小麥愈傷組織為受體，以AglI農(nóng)桿菌菌株為供體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功的獲得了轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化效率為3.7％-5.9％，略高于前一實(shí)驗(yàn)的0.14％-4.3％。2003年，Hu T(2003)等進(jìn)行了大量的轉(zhuǎn)基因小麥試驗(yàn)，獲得了3000多株轉(zhuǎn)基因小麥植株，平均的轉(zhuǎn)基因效率僅為4.4％。目前報(bào)道的小麥轉(zhuǎn)化效率沒有超過6％(以上轉(zhuǎn)化效率均指獲得的轉(zhuǎn)基因植株的數(shù)量占轉(zhuǎn)化的愈傷組織總數(shù)的百分比)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于水稻(秈稻)的96％(劉梅，2004)和玉米的30％(Ishida Y，1996)。正是因?yàn)樾←湹霓D(zhuǎn)化效率很低，轉(zhuǎn)基因小麥在育種上的應(yīng)用受到了很大的限制。另外，目前為止，成功獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株的報(bào)道也僅僅局限在少數(shù)幾個(gè)基因型中，對(duì)于有著最大種植面積的小麥來講，遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足育種工作者的需求，是影響生物技術(shù)育種在小麥中應(yīng)用的另外一個(gè)限制因素。
在基因組研究中，基因的功能分析需要進(jìn)行以轉(zhuǎn)基因?yàn)榛A(chǔ)的功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，基因鑒別體系如各種增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和基因陷阱或DNA插入突變都要依靠高度有效的轉(zhuǎn)化體系。在小麥中，高效轉(zhuǎn)化體系的建立是上述基因鑒別體系的基礎(chǔ)，而目前太低的的轉(zhuǎn)化率無法用于發(fā)展一種建立在轉(zhuǎn)化基礎(chǔ)上的基因標(biāo)簽體系。
綜上所述，小麥基因的發(fā)現(xiàn)和功能分析離不開高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，利用小麥生物技術(shù)育種創(chuàng)造高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗小麥新品種或具有潛在工業(yè)價(jià)值的新品種也離不開高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是針對(duì)目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率低和受體基因型狹窄的現(xiàn)狀，通過長(zhǎng)期的遺傳基因研究和對(duì)大量基因型的篩選，獲得了適合進(jìn)行小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，利用該受體材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化可以獲得較高的遺傳轉(zhuǎn)化效率。
技術(shù)方案本發(fā)明涉及一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其實(shí)施方案如下將小麥品種南大2419與小麥品種望水白雜交，F(xiàn)1代自交；從F2代起到F7代各單株只收一粒進(jìn)行繁殖，F(xiàn)8代混收，育成各種遺傳組成不同的純系；在F8代純系中選擇株高120-130cm，中抗(病穗率為40-50％)赤霉病的材料作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化育種的受體材料。
上述方法獲得的材料作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化育種，可以直接利用其他小麥品種(品系)或者其他物種中的抗病、抗逆、抗蟲、優(yōu)質(zhì)等基因，對(duì)材料進(jìn)行遺傳改良，快速獲得生產(chǎn)上可以直接利用的品種或者做為育種資源提供優(yōu)良的基因。
上述材料作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的育種方法，可以利用材料的成熟胚、幼胚、根、根尖、子房、花藥、芽、芽尖、莖、葉片作為受體作為遺傳轉(zhuǎn)化；或者利用材料的成熟胚、幼胚、根、根尖、子房、花藥、芽、芽尖、莖、葉片獲得的愈傷組織作為受體的遺傳轉(zhuǎn)化。遺傳轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、子房注入法、聚異二醇法在內(nèi)的外源基因轉(zhuǎn)移的方法；遺傳轉(zhuǎn)化所用載體包括適合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的各種DNA片段和質(zhì)粒。
利用上述方法獲得的材料與親本回交育種，可以獲得新的適合遺傳轉(zhuǎn)化并且農(nóng)藝性狀較好的材料，拓寬了小麥生物技術(shù)育種的受體基因型。
利用上述方法獲得的材料與其他小麥品種或近緣物種進(jìn)行雜交育種，近緣物種包括小麥屬、山羊草屬、冰草屬、披堿草屬、鵝觀草屬、偃麥草屬、賴草屬、新麥草屬、大麥屬、黑麥屬、簇毛麥屬、旱麥草屬、無芒草屬、異形花屬、棱軸草屬，在拓寬了小麥生物技術(shù)育種的受體基因型的同時(shí)，可以將遠(yuǎn)緣雜交育種和生物技術(shù)育種相結(jié)合，提高育種效率。
有益效果本發(fā)明涉及一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，利用小麥品種南大2419和小麥品種望水白及其雜交后代提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明通過長(zhǎng)期研究和大量基因型的篩選，終于將小麥品種南大2419與小麥品種望水白雜交獲得了新的可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的小麥基因型材料，拓寬了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體基因型，為育種工作者提供了新的選擇，可以直接作為轉(zhuǎn)基因受體材料。
本發(fā)明方法所獲得的轉(zhuǎn)基因受體材料可以通過遺傳轉(zhuǎn)化利用其它物種或者小麥近緣物種的優(yōu)良基因改良其抗病、抗蟲、抗逆等農(nóng)藝性狀，這是常規(guī)育種所不具有的優(yōu)勢(shì)。另外，也可以通過與育種材料雜交，獲得遺傳轉(zhuǎn)化效率高的后代材料，對(duì)此進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，快速獲得優(yōu)良品種，提高育種效率，使小麥轉(zhuǎn)基因育種品種在生產(chǎn)上的應(yīng)用成為可能。
本發(fā)明將小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率由目前的5％左右提高到31.4％，解決了限制小麥生物技術(shù)育種和功能基因組研究的一個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)問題，為生物技術(shù)育種在小麥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，高效轉(zhuǎn)化體系的獲得使得利用各種增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和基因陷阱或DNA插入突變進(jìn)行小麥基因大規(guī)模識(shí)別研究與應(yīng)用成為可能。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1(一)用來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的植物材料的獲得
1.將小麥品種南大2419與小麥品種望水白雜交，F(xiàn)1代自交。從F2代起到F7代各單株只收一粒進(jìn)行繁殖。F8代混收，育成各種遺傳組成不同的純系。
2. 2004年5月在各種遺傳組成不同的純系中選擇株高120-130cm左右，中抗(病穗率為40-50％)赤霉病的材料，編號(hào)為N2、N3、N4和對(duì)照品種揚(yáng)麥158、Bobwhite開花15天左右時(shí)，用剪刀剪取各個(gè)株系和對(duì)照品種的麥穗(包括穗基部以下10cm左右的莖稈)，將莖稈底部浸入蒸餾水中，4℃處理三天。
小麥品種南大2419、小麥品種望水白、揚(yáng)麥158、Bobwhite(國(guó)外推廣品種，國(guó)內(nèi)育種者公知公用，本單位可對(duì)外提供，見參考文獻(xiàn)Weeks et al.，1993；Becker et al.，1994；Zhou eh al.，1995)為公知公用品種。
3.取在4℃處理三天的麥穗，室溫下用鑷子剝?nèi)∽蚜＃?0％酒精消毒10分鐘，無菌水沖洗3-4遍，2％NaClO消毒20分鐘，無菌水沖洗5-6遍，于超凈工作臺(tái)上無菌操作剝?nèi)∮着?大小約為1-2mm)，盾片向上于MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于25℃暗培養(yǎng)，約3天后開始形成愈傷組織。MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D(2mg/L)+瓊脂粉(8g/L)+蔗糖(30g/L)，pH＝5.8。
4. 25℃暗培養(yǎng)一個(gè)月后，將愈傷組織繼代到相同的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在這個(gè)時(shí)期，所篩選的基因型材料N3與對(duì)照品種揚(yáng)麥158相比較，愈傷組織的狀態(tài)沒有明顯差異，其胚性愈傷組織占總愈傷組織的百分?jǐn)?shù)均為80％左右。25℃暗培養(yǎng)1個(gè)周后，挑取其中的胚性愈傷組織在超凈工作臺(tái)上無菌條件切成直徑約2-3mm的小塊，置于MS分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，25℃光照培養(yǎng)(12小時(shí)光照/天)，獲得可以直接用來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的顆粒狀小塊愈傷組織。MS分化培養(yǎng)基MS+KT(1mg/L)+瓊脂粉(8g/L)+蔗糖(30g/L)，pH＝5.8。
(二)遺傳轉(zhuǎn)化所用載體(在植物中表達(dá)的crt基因的雙元轉(zhuǎn)化—表達(dá)載體pBIAC)的構(gòu)建用于構(gòu)建雙元轉(zhuǎn)化—表達(dá)載體的質(zhì)粒pBI121的是由T-DNA改造而來，其中除T-DNA 25bp重復(fù)序列(LB和RB)，胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子(P-nos)和終止子(T-nos)外，還有在原核生物(細(xì)菌)中作為選擇標(biāo)記使用的nptI和在真核生物(植物)中作為選擇標(biāo)記使用的nptII，用于選擇的抗生素分別為卡那霉素和G418。另外在載體中還有在真核生物表達(dá)的花椰菜花葉病毒的啟動(dòng)子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA。目的基因crt基因(登錄號(hào)AAW0279801)通過限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI的酶切位點(diǎn)插入在pBI121質(zhì)粒的p35S和uidA之間的多克隆酶切位點(diǎn)上，得到重組質(zhì)粒pBIC。
為提高nptII基因在單子葉植物中的表達(dá)效率，本發(fā)明用在單子葉植物中表達(dá)效率較高的ActI啟動(dòng)子代替重組質(zhì)粒pBIC中nptII基因本身的的啟動(dòng)子P-nos，得到用于本發(fā)明遺傳轉(zhuǎn)化的載體pBIAC。
本發(fā)明所用ActI啟動(dòng)子是用水稻基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得，所用引物為
ActIFCATGAAGCTTCGAGGTCATTCATATGCTTGAGActIRGTACCTGCAGTCTTCTACCTACAAAAAAGCTCCGPCR反應(yīng)體積為25μl，其中10×buffer 2.5μl，25mM MgCl21.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，Taq酶5U/μl 0.2μl，模板DNA 20ng，加水至25μl。
PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min后，94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸展0.5min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。
本發(fā)明所用限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI是常用限制性內(nèi)切酶，均可從生物技術(shù)公司購(gòu)買，所用雙元載體pBI121為公知公用載體(Jefferson，R.A.，Kavanash，T.A & Bevan，1987)。
(三)遺傳轉(zhuǎn)化所用菌體的準(zhǔn)備方法，包括1.利用氯化鈣懸浮法制備農(nóng)桿菌Agl I感受態(tài)細(xì)胞，具體方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(第三版)。
2.利用熱擊法將重組質(zhì)粒pBIAC轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌Agl I感受態(tài)細(xì)胞中，加入甘油于超低溫冰箱保存待用，具體方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》(第三版)。
3.從超低溫冰箱里取出凍存的含有pBIAC質(zhì)粒的農(nóng)桿菌Agl I，涂板于LB固體培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)36小時(shí)。
4.挑取LB固體培養(yǎng)基上的單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，25℃，150rpm震蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6。
5.取OD600＝0.6的農(nóng)桿菌菌液于超凈工作臺(tái)上分裝到1.5mL的無菌離心管中，每管分裝800μL，4000rpm，25℃離心10分鐘使菌體沉淀，然后，倒掉LB液體培養(yǎng)基，用適量浸染培養(yǎng)基懸浮菌體，使得菌液濃度保持OD600＝0.6，獲得可以用來進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌懸浮液。LB固體培養(yǎng)基NaCl(10g/L)+酵母提取物(5g/L)+酪氨酸水解物(10g/L)+瓊脂粉(15g/L)+卡那霉素(50mg/L)+利福平(50mg/L)；LB液體培養(yǎng)基NaCl(10g/L)+酵母提取物(5g/L)+酪氨酸水解物(10g/L)+卡那霉素(50mg/L)+利福平(50mg/L)；浸染培養(yǎng)基1/2MS+AS(100μmol/L)pH＝5.2。
本發(fā)明所用菌株Agl I是進(jìn)行單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化所常用菌株(Xia，1998)，可以直接從生物公司購(gòu)買，本單位亦可對(duì)外提供。
(四)以愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括將在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3天的小塊顆粒狀愈傷組織浸泡于農(nóng)桿菌懸浮液中，于超凈工作臺(tái)上25℃靜置半小時(shí)，倒掉菌液，將浸染后的愈傷組織置于無菌濾紙上吸去多余的菌液，放置到被浸染培養(yǎng)基濕潤(rùn)的濾紙上，25℃共培養(yǎng)3天。
(五)遺傳轉(zhuǎn)化后的篩選方法，包括1.將共培養(yǎng)3天后的愈傷組織用含有頭孢霉素(200-500mg/L)的無菌水沖洗3-5遍，置于篩選培養(yǎng)基I上篩選1個(gè)星期，于篩選培養(yǎng)基II上篩選1個(gè)星期，于篩選培養(yǎng)基III上篩選2個(gè)月左右。
2.在篩選20天左右時(shí)，可明顯觀察出所篩選的基因型材料N3和揚(yáng)麥158抗性植株再生方面的差異。在篩選培養(yǎng)基III上篩選2個(gè)月左右之后，將植株置于生根培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)一周，移栽。篩選培養(yǎng)基IMS分化培養(yǎng)基+頭孢霉素(200-500mg/L)；篩選培養(yǎng)基IIMS分化培養(yǎng)基+頭孢霉素(200-500mg/L)+G418(40-50mg/L)；篩選培養(yǎng)基IIIMS分化培養(yǎng)基+頭孢霉素(200-500mg/L)+G418(20-30mg/L)。生根培養(yǎng)基MS+IAA(1mg/L)+瓊脂粉(8g/L)+蔗糖(30g/L)，pH＝5.8。不同基因型材料得到抗性植株百分率如表1所示表12004年不同基因型材料的抗性植株再生統(tǒng)計(jì)

(六)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)，包括1.取移栽成活的轉(zhuǎn)基因植株的葉片利用SDS方法提取基因組DNA，提取方法參照Ma et al.，(1995)。提取的DNA經(jīng)λDNA定量后，作為PCR擴(kuò)增和Southern雜交的模板。
2.PCR檢測(cè)的目標(biāo)片段是位于載體上的T-nos，根據(jù)T-nos基因設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)所用的引物。
3.PCR反應(yīng)體積為25μl，其中10×buffer 2.5μl，25mM MgCl21.5μ1，2.5mM dNTPs 2μl，Taq酶5U/μl 0.2μl，模板DNA 20ng，加水至25μl。
4.PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min后，94℃變性1min，65℃退火1min，72℃延伸展0.5min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。
5.在PTC-225擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8％的非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在紫外透射儀上照相，記錄結(jié)果。67株遺傳轉(zhuǎn)化后的植株中只有65株擴(kuò)增得到特異的目標(biāo)帶，其中兩個(gè)N3的抗性植株沒有擴(kuò)增到目標(biāo)帶。根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，初步計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化效率，采用獲得的轉(zhuǎn)基因植株數(shù)量占轉(zhuǎn)化的愈傷組織的總數(shù)的百分?jǐn)?shù)作為標(biāo)準(zhǔn)來計(jì)算的轉(zhuǎn)化效率，其中轉(zhuǎn)化效率較高的材料N3和N4是小麥品種南大2419和小麥品種望水白的雜交后代；與其他基因型以及對(duì)照品種揚(yáng)麥158的比較數(shù)據(jù)如表2所示。
表22004年不同基因型材料的遺傳轉(zhuǎn)化效率

從表2可以看出，從小麥品種南大2419和小麥品種望水白的雜交后代中篩選出的適合做遺傳轉(zhuǎn)化的材料包括N3和N4的遺傳轉(zhuǎn)化效率最高可以分別達(dá)到58.9％和45.7％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前被普遍用來做遺傳轉(zhuǎn)化的材料揚(yáng)麥158和Bobwhite的遺傳轉(zhuǎn)化效率-2.9％和0.6％。
(七)轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交檢測(cè)，包括1.基因組DNA的酶切，電泳和轉(zhuǎn)膜按上文所述提取的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切消化過夜。每30μl反應(yīng)包括15μg DNA，3μl 10×緩沖液，33mM DTT，4mM Spermdine，30U限制性內(nèi)切酶。酶切后的DNA在0.9％的瓊脂糖凝膠上用1×NEB(12.1g/L Tris，0.336g/L EDTANa2，1.7g/L NaAc·3H2O，PH＝8.1)電泳緩沖液進(jìn)行電泳分離。轉(zhuǎn)膜前將凝膠浸入0.25N HCl輕輕搖晃處理約10分鐘，用蒸餾水漂洗后，在0.4NNaOH中用毛細(xì)管虹吸法轉(zhuǎn)印DNA至Hybond-N+尼龍膜上，轉(zhuǎn)印12小時(shí)，最后將膜置于2×SSC中搖蕩洗滌20min后晾干，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 2.Southern雜交過程雜交前，轉(zhuǎn)印膜先在65℃雜交液(0.5M pH 7.2的磷酸鈉，7％的SDS和1％的BSA和200μg預(yù)變性的鮭魚精DNA)中預(yù)雜交3-6小時(shí)。探針是利用酶切的方法回收載體上的GUS編碼區(qū)，它的標(biāo)記采用隨機(jī)引物延伸法(Feinberg andVogelsstein，1983)。標(biāo)記好的探針用0.4N NaOH變性10分鐘，然后將制備好的探針加入預(yù)雜交液，65℃雜交24小時(shí)。
3.雜交后的洗膜，爆光和洗片雜交后將膜分別在含有0.1％SDS的2×，1×，0.5×SSC洗膜液中65℃洗滌15-20分鐘，根據(jù)膜上的信號(hào)強(qiáng)度，在X射線膠片上于-70℃爆光3天，用x光片機(jī)自動(dòng)洗片。
Southern雜交后結(jié)果在用來進(jìn)行Southern雜交的30個(gè)樣品中，有16個(gè)樣品有明顯的Southern雜交信號(hào)，Southern雜交的結(jié)果與PCR擴(kuò)增結(jié)果不完全一致。造成這種結(jié)果的主要原因可能以下幾個(gè)第一個(gè)原因可能是由于PCR擴(kuò)增有部分假陽(yáng)性，假陽(yáng)性率達(dá)到46.7％，則材料N3實(shí)際的遺傳轉(zhuǎn)化效率為58.9％×(1-46.7％)＝31.4％，第二個(gè)原因可能是由于嵌合體的存在，使得植株的某些部位并沒有外源基因的整合，從而造成沒有雜交信號(hào)或者信號(hào)相當(dāng)弱的現(xiàn)象。第三個(gè)原因可能是由于本試驗(yàn)所用載體比較大，大約有14Kb，在外源DNA進(jìn)入植物細(xì)胞或者整合到細(xì)胞染色體上的過程中，只有部分T-DNA進(jìn)入到植物細(xì)胞中或者只有部分T-DNA整合到植物染色體中，而T-nos在T-DNA的不同位置上有兩個(gè)拷貝，使得利用PCR擴(kuò)增T-nos時(shí)能夠擴(kuò)出目標(biāo)條帶，而在利用Gus的編碼區(qū)作為探針雜交檢測(cè)時(shí)沒有雜交信號(hào)的出現(xiàn)。另外，據(jù)研究報(bào)道，在小麥中利用抗生素G418篩選載體上的抗生素標(biāo)記基因NPTII是最為有效的方法(張文蔚，2004)，G418的適宜濃度是25-50mg/L(葉興國(guó)等，2001)，當(dāng)濃度為25mg/L時(shí)即很少有假陽(yáng)性植株存活，(Cheng et al.，1996；B.T.Campbell et al.，2000；劉偉華等，2003)。本次實(shí)驗(yàn)我們使用的G418濃度達(dá)到了50mg/L，應(yīng)該可以達(dá)到理想的篩選效果，假陽(yáng)性率達(dá)到46.7％的可能性很小，因此，我們認(rèn)為，第一個(gè)原因存在的可能性比較小，材料N3的實(shí)際轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該超過31.4％。
由此可見，我們篩選出的基因型材料N3的遺傳轉(zhuǎn)化效率至少可達(dá)到31.4％以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過目前報(bào)道的5％左右的轉(zhuǎn)化效率。
實(shí)施例22005年5月，再次取N2，N3，N4和揚(yáng)麥158的幼胚進(jìn)行組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化，除遺傳轉(zhuǎn)化載體中的目的片由tom7基因(登陸號(hào)AY667409)代替crt基因之外，其余具體實(shí)驗(yàn)方法均與具體實(shí)施方式
(一)相同。在含有G418的培養(yǎng)基上篩選兩個(gè)月后，得到的抗性植株占轉(zhuǎn)化的愈傷組織總數(shù)的百分率如表3所示表32005年不同基因型材料的抗性植株再生統(tǒng)計(jì)

將2005的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3與2004年同期實(shí)驗(yàn)紀(jì)錄結(jié)果表1相比較，2004年材料揚(yáng)麥158、N2、N3和N4的抗性植株占轉(zhuǎn)化的愈傷組織的總數(shù)的百分率分別為2.6；0.9；64.1和45.7；而2005年材料揚(yáng)麥158、N2、N3和N4的抗性植株占轉(zhuǎn)化的愈傷組織的總數(shù)的百分率分別為7.5；5.8；72.3和47.9。由此可見，2004年的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可以重復(fù)的，而且轉(zhuǎn)化效率不受載體上的目的基因限制，本發(fā)明的一種提高遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
權(quán)利要求
1.一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的方法，其特征在于將小麥品種南大2419與小麥品種望水白雜交，F(xiàn)1代自交；從F2代起到F7代各單株只收一粒進(jìn)行繁殖；F8代單株混收，育成各種遺傳組成不同的純系；在F8代純系中選擇株高120-130cm，中抗赤霉病，赤霉病病穗率為40-50％的材料作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。
2.利用權(quán)利要求1所述方法獲得的材料作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的育種方法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述利用權(quán)利要求1所述方法獲得的材料作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的育種方法，其特征在于利用權(quán)利要求1所述的材料的成熟胚、幼胚、根、根尖、子房、花藥、芽、芽尖、莖、葉片等作為受體的遺傳轉(zhuǎn)化；或者利用權(quán)利要求1所述的材料的成熟胚、幼胚、根、根尖、子房、花藥、芽、芽尖、莖、葉片等獲得的愈傷組織作為受體的遺傳轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述利用權(quán)利要求1所述方法獲得的材料作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的育種方法，其特征在于遺傳轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法、子房注入法、聚異二醇法在內(nèi)的外源基因轉(zhuǎn)移的方法；遺傳轉(zhuǎn)化所用載體包括適合進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的各種DNA片段和質(zhì)粒。
5.利用權(quán)利要求1所述方法獲得的材料與親本回交育種的方法。
6.利用權(quán)利要求1所述方法獲得的材料與其他小麥品種或品系或近緣物種雜交育種的方法。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述近緣物種包括小麥屬、山羊草屬、冰草屬、披堿草屬、鵝觀草屬、偃麥草屬、賴草屬、新麥草屬、大麥屬、黑麥屬、簇毛麥屬、旱麥草屬、無芒草屬、異形花屬、棱軸草屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率的育種方法，屬于生物技術(shù)育種領(lǐng)域。本發(fā)明是針對(duì)目前小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率低和受體基因型狹窄的現(xiàn)狀，通過對(duì)長(zhǎng)期研究和大量基因型的篩選，終于將小麥品種南大2419和小麥品種望水白雜交，F(xiàn)1代自交，從F2代起到F7代各單株只收一粒進(jìn)行繁殖，在F8代純系中選擇株高120－130cm,中抗(病穗率為40－50％)赤霉病的材料作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化的育種受體材料。將小麥的遺傳轉(zhuǎn)化效率由目前的5％左右提高到至少31.4％，解決了限制小麥生物技術(shù)育種和功能基因組研究的一個(gè)關(guān)鍵的技術(shù)問題，為生物技術(shù)育種在小麥中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H1/06GK1751563SQ20051009490
公開日2006年3月29日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者馬正強(qiáng), 賈海燕 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)