擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)基配制、篩選培養(yǎng)和抗性苗檢測(cè)。采用本發(fā)明的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基都無需進(jìn)行高溫高壓滅菌，減少了工作量和能源消耗，簡(jiǎn)化了擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)環(huán)節(jié)，降低了擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的培養(yǎng)成本；本發(fā)明的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，操作簡(jiǎn)單，只要按不同的培養(yǎng)基配方配制后，再加上抑菌劑即可，實(shí)用性強(qiáng)，推廣性好；本發(fā)明的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法與常規(guī)方法比較，可以降低成本10％以上。
【專利說明】擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物組培方法，具體涉及一種擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]擬南芥(Arabidopsis thaliana)屬十字花科擬南芥屬，具有顯花植物的全部特征，并且有基因組小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、形體小、生長(zhǎng)周期短、繁殖系數(shù)高、白花授粉等優(yōu)點(diǎn)，被稱為“植物界的果蠅”、分子生物學(xué)研究的模式物種。擬南芥基因組小，許多基因是單拷貝的，所以基因比較容易克隆和分析。因此，在植物基因工程和作物遺傳改良上愈來愈受到重視。許多作物的基因功能驗(yàn)證都選用了擬南芥這種模式物種。
[0003]選用擬南芥進(jìn)行基因功能驗(yàn)證試驗(yàn)中，侵染后收獲的大量擬南芥種子必須經(jīng)過多次的抗生素篩選才能獲得抗性植株。在這過程中大量的工作都集中在培養(yǎng)基的配制和接種上，尤其是培養(yǎng)基的配制，需要添加一些能抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素，這些抗生素不耐高溫高壓，只能通過過濾滅菌后才能加入培養(yǎng)基中。通常情況下是，培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基經(jīng)過高溫高壓滅菌后，冷卻到40°C -50°C，再加入經(jīng)過過濾滅菌后的抗生素，然后分裝到培養(yǎng)容器，冷卻凝固后備用。以上工作程序繁鎖、工作量大。如果能找到一種無需高溫高壓、又能抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)、同時(shí)還不影響擬南芥正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，就可以解決以上問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明的目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的。
[0006]本發(fā)明的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)基配制、篩選培養(yǎng)、抗性苗檢測(cè)，其特征在于:
[0007]1、抑菌劑的配制:稱2.4g的富馬酸二甲酯用20ml無水乙醇溶解后，加20%的次氯酸鈉溶液100ml，加20g丙酸鈣，再加成熟蒜頭汁液20ml，用蒸餾水定容到200ml ;即為抑菌劑；
[0008]2.培養(yǎng)容器消毒:將培養(yǎng)瓶及瓶蓋在抑菌劑與水的體積比為1%。~2%。( V / V )的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫?br> [0009]3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:選擇攜帶HYG基因的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中，制備轉(zhuǎn)化菌液；所述導(dǎo)入方法和轉(zhuǎn)化菌液制備方法參照申請(qǐng)?zhí)枮?01110435405.4的發(fā)明專利“一種提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗GUS瞬時(shí)表達(dá)率方法”;培植擬南芥植株，當(dāng)側(cè)苔形成I~2個(gè)角果時(shí)，將擬南芥植株的地上部分浸入OD600 = 0.8的轉(zhuǎn)化菌液中，侵染20~40s，然后用薄膜覆蓋，于黑暗處放置過夜后，揭開薄膜，繼續(xù)培養(yǎng)擬南芥植株，當(dāng)植株的角果枯黃、欲開裂時(shí)，收獲種子，干燥條件下保存待用；
[0010]4.篩選培養(yǎng)基配制:篩選培養(yǎng)基為MS+30mg/L潮霉素+0.4~0.5ml/L抑菌劑+30.0g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;配制培養(yǎng)基時(shí)，先不加潮霉素和抑菌劑，按配方配齊其他原料后，定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，冷卻到40~50°C，然后，按培養(yǎng)基配方添加潮霉素和抑菌劑，混勻后用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基;
[0011]5.篩選培養(yǎng):將步驟3收獲的種子，在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡lOmin，用無菌水沖洗3次后，將擬南芥種子重懸于無菌水中，散播到篩選培養(yǎng)基上；4°C黑暗春化3d，然后在培養(yǎng)室溫度為22~25°C，光照12h，光照強(qiáng)度為12001x條件下培養(yǎng)；當(dāng)獲得的抑菌培養(yǎng)植株長(zhǎng)出2片真葉時(shí)移栽到土壤中，培養(yǎng)至成熟，單株收獲種子；
[0012]6.抗性苗檢測(cè):取篩選后成活的抗性苗葉片材料，進(jìn)行DNA提取、PCR檢測(cè)，呈現(xiàn)陽性的植株為成功導(dǎo)入HYG基因的轉(zhuǎn)基因植株。
[0013]本發(fā)明的應(yīng)用效果:
[0014]1、本發(fā)明的培養(yǎng)基中不同抑菌劑濃度對(duì)擬南芥種子污染的影響:我們?cè)O(shè)計(jì)了 6種抑菌劑濃度的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，以抑菌劑濃度為0.4ml/L和0.5ml/L為好，種子污染率均為O。抑菌劑濃度為0.6ml/L，雖然污染率為0，但是它的苗生長(zhǎng)明顯受到抑制，根短，苗弱。抑菌劑濃度在0.3ml/L以下，種子出現(xiàn)不同程度的污染。因此，適合的抑菌劑濃度范圍為0.4ml/L-0.5ml/L。
[0015]表1培養(yǎng)基中不同抑菌劑濃度對(duì)擬南芥種子污染的影響
[0016]
【權(quán)利要求】
1.一種擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，包括抑菌劑的配制、培養(yǎng)容器消毒、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、篩選培養(yǎng)基配制、篩選培養(yǎng)、抗性苗檢測(cè)，其特征在于: (1)抑菌劑的配制:稱2.4g的富馬酸二甲酯用20ml無水乙醇溶解后，加20%的次氯酸鈉溶液100ml，加20g丙酸鈣，再加成熟蒜頭汁液20ml，用蒸餾水定容到200ml ； (2)培養(yǎng)容器消毒:將培養(yǎng)瓶及瓶蓋在抑菌劑與水的體積比為1%。~2%。的水溶液中浸泡不少于10h，保存?zhèn)溆茫? (3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化:選擇攜帶HYG基因的植物表達(dá)載體,導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105中，制備轉(zhuǎn)化菌液；培植擬南芥植株，當(dāng)側(cè)苔形成I~2個(gè)角果時(shí)，將擬南芥植株的地上部分浸入轉(zhuǎn)化菌液中，侵染20~40s，然后用薄膜覆蓋，于黑暗處放置過夜后，揭開薄膜，繼續(xù)培養(yǎng)擬南芥植株，當(dāng)植株的角果枯黃、欲開裂時(shí)，收獲種子，干燥條件下保存待用； (4)篩選培養(yǎng)基配制:篩選培養(yǎng)基為MS+30mg/L潮霉素+0.4~0.5ml/L抑菌劑+30.0g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8 ;配制培養(yǎng)基時(shí)，先不加潮霉素和抑菌劑，按配方配齊其他原料后，定容、加熱至瓊脂粉完全溶解，冷卻到40°C~50°C，然后，按培養(yǎng)基配方添加潮霉素和抑菌劑，混勻后用lmol/L的NaOH或lmol/L的HCl調(diào)pH值至5.8，分裝到培養(yǎng)容器中，封口，冷卻凝固后備用；所述MS培養(yǎng)基為1962年，Murashige和Skoog公開的MS培養(yǎng)基； (5)篩選培養(yǎng):將收獲的種子，在10%的次氯酸鈉溶液中浸泡10分鐘，用無菌水沖洗3次后，將擬南芥種子重懸于無菌水中，散播到篩選培養(yǎng)基上；4°C黑暗春化3d，然后在培養(yǎng)室溫度為22°C~25°C，光照12h，光照強(qiáng)度為12001x條件下培養(yǎng)；當(dāng)獲得的抑菌培養(yǎng)植株長(zhǎng)出2片真葉時(shí)，移栽到土壤中，培養(yǎng)至成熟，單株收獲種子； (6)抗性苗檢測(cè):取篩選后成活的抗性苗葉片材料，進(jìn)行DNA提取、PCR檢測(cè)，呈現(xiàn)陽性的植株為成功導(dǎo)入HYG基因的轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化后的抑菌培養(yǎng)方法，其特征在于篩選培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+30mg/L潮霉素+0.5ml/L抑菌劑+30.0g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂粉，pH5.8。
【文檔編號(hào)】C12N15/84GK103952439SQ201410184023
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年5月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月4日
【發(fā)明者】林慶良, 許莉萍, 陳曉英, 高世宇 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)