一種pEGF基因工程乳酸乳球菌的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明對一種pEGF基因工程乳酸乳球菌基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，優(yōu)化內(nèi)容包括了培養(yǎng)基成分優(yōu)化、發(fā)酵時間優(yōu)化以及接種量優(yōu)化。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分為：每1L培養(yǎng)基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏1g，酵母浸粉1g，維生素C0.1g，硫酸鎂0.25g，硝酸鈉2g，硫酸亞鐵0.4g。對于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH為7.0，最佳發(fā)酵時間為27h，最佳接種量為10%。本發(fā)明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，菌體濃度達到2×109CFU/ml，明顯高于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，顯著提高了發(fā)酵效果。同時，本發(fā)明的優(yōu)化基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基大大降低了pEGF基因工程乳酸乳球菌的發(fā)酵成本。
【專利說明】一種pEGF基因工程乳酸乳球菌的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明屬于微生態(tài)學(xué)，微生物發(fā)酵領(lǐng)域，更具體涉及一種可顯著提高PEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0002]技術(shù)背景
豬表皮生長因子(porcine epidermal growth factor，pEGF)是表皮生長因子的一種，是豬乳中含量最豐富的生長因子之一。在豬初乳和常乳中表皮生長因子濃度含量很高，且其受體在豬小腸的分布研究得最多，EGF與其受體結(jié)合可發(fā)揮生理功能。有研究表明豬表皮生長因子具有多種生物學(xué)功能，如可刺激表皮和內(nèi)皮細胞的增殖；可刺激胃腸道的生長以及誘導(dǎo)小腸消化酶的表達。對于初生的仔豬和早期斷奶仔豬，PEGF能夠影響其生產(chǎn)性能、免疫應(yīng)答和小腸的發(fā)育，誘導(dǎo)小腸消化酶的表達。此外，PEGF具有促進靜止期的初級母卵泡變成活化卵泡，從而加速卵子的排出，因此具有提高哺乳動物的窩產(chǎn)仔數(shù)的功能。
[0003]乳酸乳球菌是一類能夠代謝糖類，產(chǎn)生50%以上乳酸的細菌通稱，包括乳酸乳球菌屬、乳球菌屬、雙歧桿菌屬、明串珠菌屬等至少23個屬。其本身具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，促進營養(yǎng)成分在腸道的消化吸收，降低血清中的膽固醇含量，緩解高血壓以及抗腫瘤作用。乳酸乳球菌為兼性厭氧菌是全球公認的食品級微生物，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過基因重組對其改造，有目的、有選擇地使乳酸乳球菌產(chǎn)生有益的異源基因的產(chǎn)物，制成微生態(tài)制劑和活菌疫苗等保健品或藥品，是乳酸乳球菌分子生物學(xué)研究的一個重要方向。
[0004]隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，我們可以通過對乳酸乳球菌質(zhì)粒編碼特性的研究來構(gòu)建我們所需要的質(zhì)粒載體，通過一系列分子生物學(xué)手段例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合、電轉(zhuǎn)化等，將其轉(zhuǎn)移到乳酸乳球菌中，使我們所需要的目的基因得以表達，從而使基因工程乳酸乳球菌集菌體、自身分泌物、外源蛋白于一體。將基因工程乳酸乳球菌應(yīng)用到飼料中，可以作為一種新型的飼料添加劑，其能夠產(chǎn)生抗微生物(尤其致病菌)物質(zhì)，還能夠調(diào)節(jié)動物機體腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，增強動物機體免疫力，從而促進動物生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供了一種可以顯著提高PEGF基因工程乳酸乳球菌生物量的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基。
[0006]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基有如下組分組成:
1)低蛋白乳清粉6.5^15g/L;
2)無水葡萄糖5~20g/L;
3)蛋白胨5~15g/L;
4)牛肉膏r1g/L;
5)酵母浸出粉5g/L;
6)維生素C 0.1~0.5g/L;
7)硫酸鎂(Π).25g/L;
8)硝酸鈉(T2g/L;
9)硫酸亞鐵(T0.4g/L;10)所述發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的pH值為5.8-7.0;所述發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間為24^39h ;所述發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的接種量為2%~10% ;所述發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)；所述發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37°C。
[0007]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有低蛋白乳清粉6.5~15g/L;較佳地，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L。
[0008]本發(fā)明中,所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有無水葡萄糖5~20g/L ;較佳地,所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有無水葡萄糖5g/L。
[0009]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有蛋白胨5~15g/L ;較佳地，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有蛋白胨15g/L。
[0010]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有牛肉膏f 10g/L ;較佳地，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有牛肉膏l(xiāng)g/L。
[0011]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有酵母浸出粉f5g/L;較佳地，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有酵母浸粉lg/L。
[0012]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有維生素C0.1~0.5g/L ;較佳地,所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有維生素C0.lg/L。
[0013]本發(fā)明優(yōu)選地，所 述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有硫酸鎂0.25g/L ;所述的硝酸鈉2g/L ;所述的硫酸亞鐵0.4g/L。
[0014]本發(fā)明優(yōu)選地,所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基pH值為7.0 ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)時間為27h ；所述的接種量為10% ;所述的培養(yǎng)方式為厭氧靜置培養(yǎng)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37°c。
[0015]本發(fā)明更優(yōu)選地，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基由如下組分組成:每IL培養(yǎng)基含低蛋白乳清粉6.5g,葡萄糖5g,蛋白胨15g,牛肉膏Ig,酵母浸粉Ig,維生素C0.1g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉2g,硫酸亞鐵0.4g。
[0016]本發(fā)明中，溶解所述發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的介質(zhì)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地為水；所述水為本領(lǐng)域常規(guī)所述，如蒸餾水、雙蒸水等。
[0017]本發(fā)明中，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)，只需將其包含的各組分簡單混合，然后按照本領(lǐng)域常規(guī)微生物培養(yǎng)基的制備條件制備即可；所述的常規(guī)制備條件為121 °C，高壓濕熱滅菌15min。
[0018]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0019]本發(fā)明所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的積極進步效果在于:本發(fā)明的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基可提供PEGF基因工程乳酸乳球菌良好生長，顯著提高了 pEGF基因工程乳酸乳球菌的發(fā)酵生物量；同時，本發(fā)明的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基大大降低了 pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)基的成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]附圖1 pEGF基因工程乳酸乳球菌的生長曲線。
[0021]附圖2 pEGF表達量測定。
【具體實施方式】
[0022]下面通過實驗實例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實例范圍之中。
[0023]實施例1:pEGF基因工程乳酸乳球菌的活化
液體活化培養(yǎng)基的制備:M17培養(yǎng)基3.76g，無水葡萄糖lg，蒸餾水100ml，121°C，高壓濕熱滅菌，15min,超凈臺中冷卻后，加入100 μ I紅霉素溶液,紅霉素溶液濃度為lmg/ml,4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0024]活化培養(yǎng)基平板的制備:M17培養(yǎng)基3.76g，無水葡萄糖lg，瓊脂粉15g，蒸餾水100ml，12rC，高壓濕熱滅菌，15min，加入100 μ I紅霉素溶液，紅霉素溶液濃度為lmg/ml，每塊平板倒入20-25ml培養(yǎng)基，超凈工作臺中冷卻凝固后，封口，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025]將保存于40%甘油中的菌種拿于室溫下，在超凈工作臺中用高壓滅菌過的接種環(huán)挑取菌種，然后劃在平板上，封口，37°C下倒置培養(yǎng)24小時。
[0026]24小時后，用滅菌的接種環(huán)挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，所述的培養(yǎng)基為上述液體活化培養(yǎng)基，37°C下靜置培養(yǎng)24小時。
[0027]24小時后，用移液器移取10% (v/v)的菌液，重新接種于一瓶液體活化培養(yǎng)基中，37°C下靜置培養(yǎng)24小時，即得到種子液，收集菌液，4°C保存，備用。
[0028]實施例2:pEGF基因工程乳 酸乳球菌生長曲線的測定
將pEGF基因工程乳酸乳球菌活化后，以10% (v/v)的接種量接種到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下:蛋白乳清粉6.5g,葡萄糖1g,蛋白胨1g,牛肉膏5g，酵母浸粉2.5g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉Ig,氯化鈉2g,硫酸亞鐵0.4g,維生素C 0.3g,蒸餾水 100mL, ρΗ7.0。
[0029]裝液量為10ml的三角牌裝80ml培養(yǎng)基，在37°C下靜置培養(yǎng)，每隔3個小時，采用血球平板計數(shù)法測定不同時間的菌落單位數(shù)，以培養(yǎng)時間為橫坐標、菌落單位數(shù)為縱坐標繪制生長曲線圖(圖1)。
[0030]由生長曲線確定pEGF基因工程乳酸乳球菌的最佳培樣時間為27h。
[0031]實施例3:調(diào)整培養(yǎng)基各成分比例對pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵生物量的影響 在以下實驗中，采用兩因子，每次優(yōu)化兩種培養(yǎng)基成分比例，其余成分不便，37°C下靜
置培養(yǎng)27h，用血球平板計數(shù)法測定菌落單位數(shù)。
[0032]3.1其他成分不變，設(shè)置低蛋白乳清粉濃度6.5g/L、10g/L、15g/L和葡萄糖濃度5g/L、10g/L、20g/L，每個組合重復(fù)3次，求平均值，(如表1)。結(jié)果表明，當(dāng)?shù)偷鞍兹榍宸蹪舛葹?.5g/L，葡萄糖濃度為5g/L時，菌落單位數(shù)達到最高。
[0033]表1細菌生物量IgCFU
【權(quán)利要求】
1.一種PEGF基因工程乳酸乳球菌的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于:優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基由如下組分組成: 1)低蛋白乳清粉6.5^15g/L; 2)無水葡萄糖5~20g/L; 3)蛋白胨5~15g/L; 4)牛肉膏r1g/L; 5)酵母浸出粉5g/L;
6)維生素C 0.1~0.5g/L; 7)硫酸鎂(Π).25g/L;
8)硝酸鈉(T2g/L; 9)硫酸亞鐵(T0.4g/L; 10)所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的pH值為5.8-7.0 ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)時間為24~39h ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基的接種量為29TlO% ;所述pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)方式為厭氧靜置培養(yǎng)；所述PEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)溫度為37°C ;所述的pEGF基因工程乳酸菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中添加lml/L的紅霉素溶液；所述的紅霉素溶液濃度為10mg/ml。
2.如權(quán)利要求1所述的PEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有低蛋白乳清粉6.5g/L ;所述的無水葡萄糖5g/L。
3.如權(quán)利要求2所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有蛋白胨15g/L;所述的牛肉膏l(xiāng)g/L。
4.如權(quán)利要求3所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有酵母浸出粉lg/L ;所述的維生素C 0.lg/L。
5.如權(quán)利要求4所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中含有硫酸鎂0.25g/L ;所述的硝酸鈉2g/L ;所述的硫酸亞鐵0.4g/L。
6.如權(quán)利要求5所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中包括以下組分:每IL培養(yǎng)基含低蛋白乳清粉6.5g，葡萄糖5g，蛋白胨15g，牛肉膏Ig,酵母浸粉Ig,維生素C0.1g,硫酸鎂0.25g,硝酸鈉2g,硫酸亞鐵0.4g。
7.如權(quán)利要求6所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基最佳發(fā)酵時間為27h ;所述的發(fā)酵培養(yǎng)基最佳接種量為10% ;所述發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7.0。
8.如權(quán)利要求7所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基中添加100 μ I的紅霉素溶液；所述的紅霉素溶液濃度為10mg/ml ;所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基裝液量為10ml瓶裝80ml。
9.如權(quán)利要求8所述的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，所述的發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)方式為靜置培養(yǎng)；所述培養(yǎng)溫度為37°C。
10.如權(quán)利要求1~9所述任一項的pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)基在pEGF基因工程乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/20GK104031962SQ201410183934
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月5日
【發(fā)明者】潘康成, 周堯, 賈賢奇 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)