專利名稱：一種適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
香石竹(Dianthus Caryophyllus)別名麝香石竹、康乃馨。為石竹科石竹屬多年生宿根草本植物，原產(chǎn)歐洲南部。它莖葉清秀，花朵富麗高雅，色彩絢麗嬌艷，觀賞價值極高，而且單朵花期長，宜制作花束、花籃，是世界著名的四大切花之一。
香石竹不易用種子繁殖，有性生殖又易產(chǎn)生品種間雜交，不能保持親本的優(yōu)良品質(zhì)，生產(chǎn)中往往采用扦插進(jìn)行繁殖。然而，由于扦插繁殖系數(shù)低、速度慢，難以滿足市場需要，尤其是對于一些新培育出和新引進(jìn)的品種，由于數(shù)量少，傳統(tǒng)的繁殖方法更不能滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。同時，由于長期的田間無性繁殖，病毒侵染嚴(yán)重，直接影響切花的商品價值。采用組織培養(yǎng)方法繁殖香石竹，可有效地提高其品性，增加繁殖系數(shù)。
植物組織培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今國內(nèi)外農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的一項高新技術(shù)，利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖，繁殖速度非?？欤铱梢灾苣晟a(chǎn)，不受季節(jié)限制，操作簡單，成本低廉。此技術(shù)應(yīng)用到花卉領(lǐng)域，也為花卉的快速繁殖提供了便利。
目前，有關(guān)香石竹組培快繁的報道多是誘導(dǎo)不定芽(馬均等，2003年，林業(yè)科技，28(4)27-27；唐蓉等，2000年，試驗研究，41-3；周菊花等，1992年，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，8(3)79-83；Fisher，M.等，1993年，Scientia Horticulture，53231-237；Van Altvorst，A.C.等，1992年，Scientia Horticulture，51223-235)或不定根(殷麗青等，1995年，上海農(nóng)學(xué)院學(xué)報，13(3)222-226)等某一個階段的研究，而對于一個品種完整而系統(tǒng)地研究報道較少。
植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，雖然量極少，但在植物組織培養(yǎng)中起著十分重要和明顯的調(diào)控作用。植物生長調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞分裂素、生長素及赤霉素等多種，它們在植物組織培養(yǎng)中具有不同的作用，其中以細(xì)胞分裂素類和生長素類最為常用。細(xì)胞分裂素有促進(jìn)細(xì)胞分裂與分化，延遲組織衰老，增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)側(cè)芽生長及顯著改變其他激素作用的特點(diǎn)，常用的有激動素(KT)和6-芐基腺嘌呤(6-BA)。生長素的主要作用在于誘導(dǎo)愈傷組織的形成，體細(xì)胞胚的產(chǎn)生以及試管苗的生根。常用的有2，4-二氯苯基乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)。在植物組織培養(yǎng)中，植物細(xì)胞分裂素和植物生長素的適當(dāng)配比決定著試管苗的生長和分化。提高細(xì)胞分裂素濃度有利于芽的產(chǎn)生，增加生長素濃度有利于組織和器官的生長。為了使試管苗既有較高的增殖速度又能保持較好的長勢，需要探索細(xì)胞分裂素和生長素的優(yōu)選組合。
有關(guān)香石竹組培的試驗中，周菊花等的報道中指出莖段誘導(dǎo)芽的最適6-BA濃度為3mg/L(周菊花等，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，1992，8(3)79-83)，但高濃度的6-BA培養(yǎng)較易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。添加其它成分比如青霉素等(胡繼金，園藝學(xué)報，1991，18(1)87-90)則可以降低香石竹組培過程中的玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生。
目前未見以低濃度6-BA的培養(yǎng)基組合物來促進(jìn)香石竹莖段誘導(dǎo)芽方面的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物及其應(yīng)用，以克服現(xiàn)有的香石竹莖段誘導(dǎo)芽需要高濃度激素、易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象、需添加青霉素使培養(yǎng)成本昂貴、易造成污染、不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷。
技術(shù)方案本發(fā)明的目的之一是提供一種適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其組成包括(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2)6-芐基腺嘌呤0.05～1.2mg/L。
上述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的一種優(yōu)選方案是，所說的6-芐基腺嘌呤濃度為0.8～1.2mg/L。
上述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的另一種優(yōu)選方案是，所說的6-芐基腺嘌呤濃度為1mg/L。
上述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物中，所說的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或者LS培養(yǎng)基。
本發(fā)明的另一目的是提供香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的應(yīng)用，包括將所說的培養(yǎng)基組合物用于石竹科石竹屬植物試管苗的增殖培養(yǎng)。所說的石竹科石竹屬植物可為香石竹；特別是香石竹品種0409櫻花、0413白玉蘭、0418虞美人或者0420瑪麗。
有益效果香石竹莖段誘導(dǎo)芽的現(xiàn)有技術(shù)中多是采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加高濃度激素如3mg/L 6-BA作為最適的培養(yǎng)基且多與NAA聯(lián)用，本發(fā)明的適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加6-芐基腺嘌呤0.05～1.2mg/L，優(yōu)選的6-芐基腺嘌呤濃度為0.8～1.2mg/L。基礎(chǔ)培養(yǎng)基可使用MS或者LS。
(1)與現(xiàn)有技術(shù)相比，以本發(fā)明的培養(yǎng)基加單一的低濃度的激素6-BA對莖段外植體進(jìn)行培養(yǎng)，芽的誘導(dǎo)效果顯著誘導(dǎo)率高，可達(dá)82.5％。
(2)芽體粗壯，增殖出的苗生長旺盛，30天后平均芽體長度可達(dá)2.09cm，莖葉生長都比較整齊健壯。
(3)增殖后的試管苗經(jīng)生根、移栽到珍珠巖和蛭石配成的基質(zhì)中，成活率達(dá)90％以上。
(4)單一低濃度的6-BA降低了香石竹組培過程中的玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生，玻璃化苗的比例低于5％。
(5)單一低濃度的激素有利于降低培養(yǎng)原料成本、減少廢水廢物的處理成本。
(6)單一低濃度的激素可以減少大規(guī)模生產(chǎn)造成的環(huán)境激素污染，有利于廢水廢物處理過程的簡化。
(7)本發(fā)明的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，為探索植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA對香石竹莖段誘導(dǎo)芽的影響，以及增殖和移栽等全過程提供了合適的組培快繁條件，為今后香石竹的工廠化生產(chǎn)提供一套可行的措施。
本文所用的術(shù)語“植物組織培養(yǎng)技術(shù)”是指將植物的離體器官(如根、莖、葉、花、果實(shí)、種子等)、組織(如花藥、胚珠、胚乳等)、細(xì)胞(如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞花粉等)以及去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體，放在離體無菌條件下，在人工控制的環(huán)境下，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上(含有營養(yǎng)物質(zhì)和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等)對其進(jìn)行克隆，使其生長、分化并成長為完整植株的過程。由于培養(yǎng)物是在離體條件下的試管內(nèi)進(jìn)行，亦可稱為離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。
本文所用的術(shù)語“MS培養(yǎng)基”是指Murashige和Skoog研制的培養(yǎng)基，成分如表1所示。
表1 MS培養(yǎng)基成分


本文所用的術(shù)語“LS培養(yǎng)基”是指Linsmaier和Skoog研制的，大量元素除CaCl2.2H2O用400ml/L外和MS培養(yǎng)基相同，微量元素、鐵鹽和MS培養(yǎng)基一樣，有機(jī)物成分改為肌醇100mg/L、鹽酸硫胺素VB10.4mg/L、水解酪蛋白1000-3000mg/L、蔗糖3％，瓊脂1％的培養(yǎng)基。
本文所用的術(shù)語“芽誘導(dǎo)率”是指植物組織培養(yǎng)中外植體誘導(dǎo)出芽的比率，等于出芽的外植體個數(shù)與接種的外植體總數(shù)的比值。
本文所用的術(shù)語“玻璃化”是指植物組織培養(yǎng)中特有的一種生理性病變，是培養(yǎng)環(huán)境中的一些物理、化學(xué)和生化因子共同作用使植物組織新陳代謝紊亂所致。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
培養(yǎng)基及其配制、香石竹莖段外植體的選擇、滅菌、接種和培養(yǎng)等方法主要參照楊永花的方法(楊永花等，甘肅農(nóng)業(yè)科技，2000，545-46)進(jìn)行。
下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1本實(shí)施例是香石竹莖段外植體誘導(dǎo)芽的過程，比較誘導(dǎo)芽的誘導(dǎo)率和莖段誘導(dǎo)芽的質(zhì)量，篩選出最佳的培養(yǎng)基配方。
1)無菌材料的獲得試驗材料供試的香石竹品種為“0420”瑪麗，由上海花卉良種場提供。
選擇供試品種生長健壯的植株，切取3cm左右的莖段，用肥皂水浸泡7-8min，流水沖洗過夜。將洗干凈的外植體材料在超凈臺上用75％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗2-3次，再用2％的NaClO并加1-2滴吐溫-20消毒15-20min，無菌水沖洗6-7次。再切取1cm左右的莖段做最終接種外植體。
2)莖段外植體誘導(dǎo)芽先用無菌濾紙輕輕吸去切取好的莖段表面的水分，然后接種于MS培養(yǎng)基加不同濃度細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的產(chǎn)生。每一處理三瓶，每瓶接種10個莖段，30d后統(tǒng)計莖段誘導(dǎo)率，期間觀察誘導(dǎo)出的芽的生長狀況。
3)培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件如表2所示，以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加不同濃度6-BA或者KT激素的培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3.0％，瓊脂濃度為0.7％，pH值為5.8。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度1500-2000lx，光照時間16h/d。
表2MS培養(yǎng)基加6-BA/KT對莖段培養(yǎng)誘導(dǎo)形成芽


注芽誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)出的芽數(shù)/出芽的外植體個數(shù)試驗結(jié)果表2結(jié)果表明，把香石竹莖段外植體接種在含有細(xì)胞分裂素6-BA或KT的培養(yǎng)基中，均可形成芽。6-BA在0.05～1.0mg/L，KT在0.05～0.5mg/L范圍內(nèi)隨濃度的升高，對芽的誘導(dǎo)形成的促進(jìn)作用越明顯，濃度超過1.0mg/L和0.5mg/L時則表現(xiàn)出抑制作用。同時還可看出，使用的細(xì)胞分裂素KT≥1.0mg/L時誘導(dǎo)產(chǎn)生的芽開始出現(xiàn)玻璃化，并且隨著KT濃度的升高，玻璃化現(xiàn)象越嚴(yán)重。
綜上可知細(xì)胞分裂素6-BA對香石竹芽的誘導(dǎo)效果顯著地高于細(xì)胞分裂素KT，降低6-BA的濃度可以減輕玻璃化現(xiàn)象，莖段誘導(dǎo)不定芽的適宜培養(yǎng)基為MS+6-BA0.05-1.2mg/L。其中6-BA濃度為1mg/L時莖段的誘導(dǎo)率最高且芽體粗壯。
實(shí)施例2本實(shí)施例是將四個香石竹品種的莖段接種在表2所示附加0.05，0.1，0.5和1.0mg/L6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，測試培養(yǎng)基應(yīng)用于不同品種的適用性。
1.試驗材料供試的四個香石竹品種分別為“0409”櫻花，“0413”白玉蘭，“0418”虞美人和“0420”瑪麗，由上?；ɑ芰挤N場提供。
2.培養(yǎng)基如表2所示，由MS培養(yǎng)基附加0.05，0.1，0.5和1.0mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件和試驗方法同實(shí)施例1。
3.觀察試驗現(xiàn)象及結(jié)果分析得出經(jīng)統(tǒng)計試驗結(jié)果見表3?！艾旣悺钡恼T導(dǎo)率最高且沒有出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，“櫻花”和“虞美人”的誘導(dǎo)率中等稍有玻璃化現(xiàn)象，“白玉蘭”的誘導(dǎo)率最低并且在四個品種中玻璃化現(xiàn)象最嚴(yán)重。所以，本發(fā)明MS培養(yǎng)基附加1.0mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基適宜“0409”櫻花，“0418”虞美人和“0420”瑪麗三個品種，而不適用于“0413”白玉蘭。
表3 不同香石竹品種對莖段誘導(dǎo)芽的影響


注玻璃化程度表示方法+＜5％++5％～15％實(shí)施例3本實(shí)施例是將香石竹莖段接種在LS培養(yǎng)基上，附加不同種類及濃度生長素，比較增殖率和再增殖的質(zhì)量，測試不同培養(yǎng)基的適用性。
1.試驗材料供試的香石竹品種為“0409”櫻花，“0418”虞美人和“0420”瑪麗，由上?；ɑ芰挤N場提供。
2.培養(yǎng)基如表2所示，以LS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加不同濃度6-BA或者KT激素的培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3.0％，瓊脂濃度為0.7％，pH值為5.8。
3.培養(yǎng)條件和試驗方法同實(shí)施例1。
4.觀察試驗現(xiàn)象及結(jié)果分析得出附加6-BA 0.05～1.0mg/L的LS培養(yǎng)基均適合上述品種的莖段誘導(dǎo)芽，芽誘導(dǎo)率為40％-70％。
盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。
權(quán)利要求
1.一種香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其組成包括(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2)6芐基腺嘌呤0.05～1.2mg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，所說的6-芐基腺嘌呤濃度為0.8～1.2mg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，所說的6-芐基腺嘌呤濃度為1mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，其特征在于，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為LS培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1所述的香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的應(yīng)用，包括將所說的培養(yǎng)基組合物用于石竹科石竹屬植物試管苗的增殖培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的應(yīng)用，所說的石竹科石竹屬植物為香石竹。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物的應(yīng)用，所說的石竹科石竹屬植物為香石竹品種0409櫻花、0413白玉蘭、0418虞美人或者0420瑪麗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適宜香石竹莖段誘導(dǎo)芽的培養(yǎng)基組合物，特別地指MS培養(yǎng)基加6－BA0.05～1.2mg/L，對莖段誘導(dǎo)芽有效，其中MS+6－BA1mg/L效果最好。指明了植物生長調(diào)節(jié)劑6－BA對香石竹莖段誘導(dǎo)芽有促進(jìn)的作用。本發(fā)明還提供了這種培養(yǎng)基組合物在香石竹組織培養(yǎng)快速繁殖中的應(yīng)用，為今后香石竹的工廠化生產(chǎn)提供了可行的方案。
文檔編號A01H4/00GK1951174SQ20051003100
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者劉麗娜, 魏秀麗, 李建粵, 周根余 申請人:上海師范大學(xué)