專利名稱：雙轉(zhuǎn)基因耐鹽植物的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雙轉(zhuǎn)基因耐鹽抗旱植物的培育方法，更具體地說雙轉(zhuǎn)基因煙草、西紅柿、油菜等耐鹽抗旱植物的培育方法。
背景技術(shù)：
土地的鹽堿化已嚴(yán)重制約了現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，為了培育出具有耐鹽特性的農(nóng)作物新品種，世界各地科學(xué)家進(jìn)行了大量研究。結(jié)果表明，鹽脅迫對(duì)植物造成的傷害，主要是植物細(xì)胞滲透壓的變化引起細(xì)胞失水以及過量的鹽分阻擾了植物細(xì)胞中主要的化學(xué)代謝途徑。在天然的耐鹽植物(halophyte)細(xì)胞內(nèi)含有大量的鹽分，但是從這些植物細(xì)胞中提取出的各種酶類卻對(duì)鹽離子十分敏感(Flowers 1977；Glenn et al.1999)，表明這些植物能夠通過某種方式將吸收的鹽離子同細(xì)胞液隔離。耐鹽植物的耐鹽機(jī)理主要是滲透調(diào)節(jié)作用，主要包括合成有機(jī)物質(zhì)和積累無機(jī)鹽兩種方式。耐鹽植物在鹽生環(huán)境下，有機(jī)物合成增加，使細(xì)胞滲透勢(shì)等于或低于環(huán)境滲透勢(shì)，從而保證了植物體從環(huán)境中吸收足夠水分，同時(shí)維持細(xì)胞正常膨壓勢(shì)，保持細(xì)胞正常生長(zhǎng)。Sharma等1986年報(bào)道了小麥耐鹽品種在一定的鹽濃度下有機(jī)酸含量較不耐鹽品種高，Hanson1985的研究認(rèn)為禾本科植物在鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)可以大量積累甜菜堿，其積累水平與植物抗鹽脅迫的能力成正比，McDonnc于1988年，Asharfl于1990年等均報(bào)道了甜菜堿在細(xì)胞內(nèi)積累能提高細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)大分子蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能。張士功等人的研究證明在鹽脅迫下，小麥幼苗體內(nèi)可溶性糖含量增高，外源甜菜堿能提高鹽脅迫下小麥幼苗體內(nèi)游離脯氨酸、可溶性糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量，限制根對(duì)Na+的吸收，并阻止其向地上部位運(yùn)輸，同時(shí)提高K+的含量及向上運(yùn)輸?shù)男?，從而提高植物體對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)能力。外源甜菜堿還能在一定程度上提高小麥幼苗內(nèi)SOD和POD等細(xì)胞保護(hù)酶的活性，降低活性氧自由基對(duì)質(zhì)膜的傷害和脂膜過氧化作用的水平，維持了細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定性和完整性。由此可見，在鹽脅迫下，植物體內(nèi)合成和積累大量的有機(jī)物是其抵抗鹽脅迫的主要方式，甜菜堿不僅自身是一種滲透調(diào)節(jié)劑，而且還能促進(jìn)其它滲透劑的合成；同時(shí)它還能改善植物體其它抵抗不良環(huán)境傷害的功能。另外，植物體在鹽脅迫下，可以通過在液泡中積累無機(jī)鹽離子進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)證明，在鹽脅迫下，小麥原生質(zhì)體中的絕大多數(shù)Na+都集中在液泡中，在相同條件下，抗鹽品種比不抗鹽品種液泡中鹽離子的含量高出20％左右。Sanrma等1981年報(bào)道，不同品種的小麥在同一鹽濃度下，耐鹽性強(qiáng)的品種較不耐鹽的品種Na+和Cl-含量要小的多，這說明耐鹽品種對(duì)鹽離子透性小，它主要依靠質(zhì)膜的選擇透性或利用其它方式將鹽離子拒之于門外，從而減輕了鹽脅迫對(duì)植物體的傷害程度。
綜上所述，植物大致通過以下三種方式使細(xì)胞內(nèi)的鹽離子維持在相對(duì)較低的水平一是植物在生長(zhǎng)過程中不吸收鹽離子，將其排斥在體外，這類植物被稱為拒鹽型植物；另一類是植物將吸收到體內(nèi)的鹽離子進(jìn)行區(qū)域化，聚集在細(xì)胞器中(如液泡等)，這類植物被稱為聚鹽型植物；第三類為植物將吸收到體內(nèi)的鹽離子再通過一定的結(jié)構(gòu)如鹽腺分泌到體外，該類植物為排鹽型植物(Wang et al.2003)。
以上所述的第一種方式?jīng)]有多少農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究?jī)r(jià)值，因?yàn)橹参锊晃胀寥乐械柠}份，大量的鹽份仍保留在土壤內(nèi)，從而土地?zé)o法脫鹽；第二種機(jī)理涉及植物體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理代謝，十分復(fù)雜，植物體主要是采取直接或間接的保護(hù)機(jī)制來提高自身的抗鹽性，即利用小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的代謝以及過量表達(dá)可清除活性氧自由基的基因來提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性。在植物體內(nèi)這些滲透保護(hù)物質(zhì)主要是多元醇、脯氨酸、季胺類化合物等，目前已經(jīng)克隆了同這些滲透物質(zhì)積累相關(guān)的一些基因，如脯氨酸合成酶(proA)基因、山菠菜堿脫氫酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD)基因、膽堿氧化酶(codA)基因、膽堿脫氫酶(betA)基因及磷酸山梨醇脫氫酶(gutD)基因等，將這些基因在受體植物中過量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。另外，在受到鹽脅迫時(shí)，植物細(xì)胞離子均衡受到破壞，通過降低由此產(chǎn)生的高Na+的毒害，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的K+/Na+比率，維持其高K+低Na+的離子平衡，如過量表達(dá)可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)離子平衡的UAL1基因，也可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性；以上第三種機(jī)理最具有應(yīng)用研究?jī)r(jià)值，植物要在高鹽環(huán)境中生存，除了通過無機(jī)鹽離子進(jìn)行滲透調(diào)外，最主要的是必須把過量的鹽離子驅(qū)離細(xì)胞液(Glenn et al.1999)。通過位于細(xì)胞膜上的氫離子鈉離子交換泵(Na+-H+Antiport)的作用，可以將細(xì)胞內(nèi)的鹽離子排到體外(Blumwald et al.2000；Shi et al.2000)。在植物細(xì)胞中還存在大量的液泡，位于液泡膜上的Na+/H+Antiport可以有效地將鈉離子區(qū)域化到液泡內(nèi)(Zhang & Blumwald 2001；Apse et al.1999；Blumwald & Poole 1985；Blumwald & Gelli 1997；Frommer et al1999)。
前期的研究工作表明，將脯氨酸合成酶基因(proA)、山菠菜堿脫氫酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD)基因、膽堿氧化酶(codA)基因、膽堿脫氫酶(betA)基因及磷酸山梨醇脫氫酶(gutD)基因等在受體植物中過量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。將膽堿氧化酶(codA)基因?qū)霐M南芥菜后，轉(zhuǎn)基因植株獲得了耐鹽性(Hayashi et al 1997)；脯氨酸在植物體內(nèi)的含量直接同植物的耐鹽性相關(guān)，表達(dá)Na+/H+Antiport基因的轉(zhuǎn)基因西紅柿及油菜在受到鹽脅迫時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸含量明顯增高(Zhang et al 2001；Zhang & Blumwald 2001)。近年來從細(xì)菌、酵母以及植物中相繼克隆到了多個(gè)氫離子鈉離子交換泵(Na+/H+Antiport)基因(Munro et al 1991；Ramirez et al 1998；Gaxiola et al 1999)。其編碼的蛋白為Na+/H+交換泵，該蛋白定位在植物細(xì)胞內(nèi)的液泡膜上，功能是將細(xì)胞液中的鈉離子轉(zhuǎn)移到液泡中，同時(shí)把液泡內(nèi)的氫離子交換到液泡外的細(xì)胞液中，從而使植物吸收的大量鹽分(Na+)“區(qū)域化”到液泡內(nèi)，細(xì)胞液中Na+的含量保持在相對(duì)較低的水平，各種生理代謝活動(dòng)可以正常進(jìn)行，表達(dá)該基因的轉(zhuǎn)基因植株也就獲得了抗鹽特性。轉(zhuǎn)基因植物把吸收到細(xì)胞內(nèi)的鹽分聚集在液胞內(nèi)，不僅可以免除鹽離子在細(xì)胞液中的毒害，同時(shí)還可以借助于鹽離子將水分吸入細(xì)胞內(nèi)以維持滲透平衡。同滲透物質(zhì)積累相關(guān)的基因以及清除活性氧自由基的基因主要是通過直接或間接的保護(hù)機(jī)制來提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性；Na+/H+交換蛋白基因則是通過對(duì)植物吸收的大量鹽分(Na+)進(jìn)行“區(qū)域化”來提高植物的耐鹽性，二者作用機(jī)理不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使作用機(jī)理不同的兩類耐鹽基因同時(shí)在受體植物中表達(dá)，從而獲得抗鹽性高于轉(zhuǎn)單基因的雙轉(zhuǎn)基因抗逆植物新品種。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種培育抗逆性提高的植物品種的方法，該方法包括a)將與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化到所述植物細(xì)胞中，并使所述基因在所述植物細(xì)胞中表達(dá)；b)從步驟a)獲得的所述植物細(xì)胞再生出植物，并選出抗逆性提高的植物品種。
本發(fā)明另一方面提供了一種植物細(xì)胞，它被與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了植物表達(dá)載體pHXZ/BADH的結(jié)構(gòu)圖，圖中NOS-proNOS啟動(dòng)子；NOS-terNOS終止子；CaMV 35S proCaMV 35S啟動(dòng)子；RB和LB左右邊界；BADH山菠菜堿脫氫酶基因；NPT II(Kanr)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
圖2顯示了植物表達(dá)載體pHXZ/MGX4的結(jié)構(gòu)圖，圖中NOS-proNOS啟動(dòng)子；NOS-terNOS終止子；CaMV 35S proCaMV 35S啟動(dòng)子；RB和LB左右邊界；MGX4紅樹Na+/H+交換蛋白基因；Hpt潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
圖3顯示了在100mg/L卡那霉素的選擇壓力下的再生出的煙草植株，其中A，野生型正對(duì)照；B，再生的抗性苗；C，野生型負(fù)對(duì)照(未感染)。
圖4顯示了在50mg/L的潮霉素的選擇壓力下的再生的煙草植株，其中A，野生型正對(duì)照；B，再生抗性苗；C，野生型負(fù)對(duì)照(未感染)；D，野生型負(fù)對(duì)照(未感染，C的底面)。
圖5顯示了在100mg/L卡那霉素和150mM NaCl的選擇壓力下的再生的煙草植株，其中左圖表示兩周后的煙草植株，右圖表示一個(gè)月后的煙草植株；其中CK+為野生型非轉(zhuǎn)基因煙草在不含有卡那霉素及NaCl的MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，CK-為野生型非轉(zhuǎn)基因煙草在含有100mg/L卡那霉素及150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，TG為轉(zhuǎn)基因煙草在含有100mg/L卡那霉素及150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。
圖6顯示了對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的PCR分析結(jié)果，其中1，pHXZ/BADH質(zhì)粒；2，空白對(duì)照(水)；3，野生型煙草總DNA；4、5，不同的轉(zhuǎn)BADH基因株系總DNA(B-5、B-8)；6，雙轉(zhuǎn)基因株系BM-12總DNA(BADH基因引物)；7，pHXZ/MGX4質(zhì)粒；8，空白對(duì)照(水)；9，野生型煙草總DNA；10、11，不同的轉(zhuǎn)MGX4基因株系總DNA(M-6、M-16)；12，雙轉(zhuǎn)基因株系BM-12總DNA(MGX4基因引物)；13，1kbDNA標(biāo)記。
圖7顯示了轉(zhuǎn)基因植株在100毫克/升卡那霉素、50毫克/毫升潮霉素以及0、100、200、300mM NaCl的選擇壓力下的耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果。其中WT為野生型非轉(zhuǎn)基因煙草，B為只表達(dá)BADH基因的轉(zhuǎn)基因煙草，M為表達(dá)MGX4基因的轉(zhuǎn)基因煙草，B+M為同時(shí)表達(dá)BADH及MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草。
圖8顯示了將野生型煙草、單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草、同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草種子播種在MS0培養(yǎng)基上的萌發(fā)及成活情況，它們都能夠萌發(fā)并成活。其中左上為野生型煙草；右上為單獨(dú)表達(dá)BADH基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；左下為單獨(dú)表達(dá)MGX4基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；右下為同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草。
圖9顯示了將野生型煙草、單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草、同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草種子播種在含有250mM NaCl的MSO培養(yǎng)基上的萌發(fā)及成活情況。其中左上為野生型煙草；右上為單獨(dú)表達(dá)BADH基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；左下為單獨(dú)表達(dá)MGX4基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；右下為同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草。
圖10顯示了將野生型煙草、單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草、同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草幼苗(長(zhǎng)出3-4片真葉)進(jìn)行耐旱試驗(yàn)(每周保持3天干旱處理)的結(jié)果，雙轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于野生型煙草以及單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草。其中A為野生型煙草；B為單獨(dú)表達(dá)BADH基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；C為單獨(dú)表達(dá)MGX4基因的單轉(zhuǎn)基因煙草；D為同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草。
具體實(shí)施方案本發(fā)明一方面涉及一種培育抗逆性提高的植物品種的方法，該方法包括a)將與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化到所述植物細(xì)胞中，并使所述基因在所述植物細(xì)胞中表達(dá)；b)從步驟a)獲得的所述植物細(xì)胞再生出植物，并選出抗逆性提高的植物品種。
在本發(fā)明所用的術(shù)語中，“目的基因”即指同小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成(積累)相關(guān)的基因以及可以清除活性氧自由基的基因(下文簡(jiǎn)稱“目的基因A”)、Na+/H+交換蛋白(Na+/H+Antiport)基因(下文簡(jiǎn)稱“目的基因B”)。在植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要是指多元醇、甜菜堿、脯氨酸、季胺類化合物等，同小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成(積累)相關(guān)的基因是指脯氨酸合成酶(proA)基因、膽堿氧化酶(codA)基因、山菠菜堿脫氫酶(BADH)基因、磷酸甘露醇脫氫酶(mtlD)基因、膽堿脫氫酶(betA)基因及磷酸山梨醇脫氫酶(gutD)基因、Δ1二氫吡咯-5-羧酸鹽合成酶(Δ1Pyrroline-5-Carboxylate Synthetase，P5CS)基因、UAL1基因等。Na+/H+交換蛋白基因是指任何編碼具有Na+/H+交換蛋白功能(活力)的基因，例如MGX4基因。
本發(fā)明的術(shù)語“基因”的含義不僅涵蓋了全長(zhǎng)基因，而且所述基因的片段和類似物也包括在該術(shù)語的范圍內(nèi)?！邦愃苹颉毕抵溉魏瓮澳康幕颉本幋a序列中的任何區(qū)域同源性在40％以上、較佳的在60％以上、更佳的在80％以上、還要佳的在90％以上的基因，或其編碼的氨基酸序列同“目的基因”氨基酸編碼序列中任何區(qū)域有40％以上、較佳的在60％以上、更佳的在80％以上、還要佳的在90％以上的同源性的基因。在較佳的實(shí)施方案中，所述“類似基因”編碼的氨基酸序列與所述“目的基因”編碼的氨基酸序列相比有1-20個(gè)、更佳的有1-10個(gè)氨基酸發(fā)生插入、缺失或置換。所述“類似基因”可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成或用PCR在體外擴(kuò)增的。
術(shù)語“基因片段”的含義是指長(zhǎng)度在300個(gè)堿基對(duì)(bp)以上的同“目的基因”或“類似基因”DNA序列中的任何域區(qū)同源性在40％以上、較佳的在60％以上、更佳的在80％以上、還要佳的在90％以上的任何DNA片段，或任何編碼100個(gè)氨基酸以上的DNA片段，其編碼的氨基酸序列同“目的基因”或“類似基因”編碼的氨基酸序列中的任何區(qū)域同源性在40％以上、較佳的在60％以上、更佳的在80％以上、還要佳的在90％以上。該基因片段可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，任何“基因片段”或“類似基因”均能適用于本發(fā)明，只要所述基因片段或類似基因具有所需的生物活性即可。在此處，對(duì)于基因的片段或其類似物而言，“具有生物活性”即指所述基因片段或基因類似物所編碼的氨基酸序列具有與所述基因所編碼的氨基酸序列相同或基本上相同的生物活性。
另外，在整篇說明書中，“轉(zhuǎn)基因”系指通過任何方法導(dǎo)入植物個(gè)體一段外源的雙鏈脫氧核糖核苷酸(DNA)片段，可以是游離在染色體外，也可以整合到受體植物染色體的基因組上；可以通過生殖過程傳遞到后代，也可以不傳遞到后代。外源基因可以是從任何生物基因組中克隆的，也可以是人工合成的或用PCR在體外擴(kuò)增的。
本文所用的術(shù)語“植物”或“受體植物”系指整個(gè)植物界，包括低等植物、高等植物、藻類以及任何利用光合作用生存的水生物，主要包括光合水生物、藻類、厥類、裸子植物(松、柏等)、被子植物(蔬菜、糧食作物、油料作物、藥用植物、苗木、花卉)等。在具體實(shí)施方案中，所述植物選自蔬菜、糧食作物、油料作物、藥用植物，例如煙草、西紅柿、油菜等作物。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能夠明了，本發(fā)明的方法可以適用于任何其它植物。
術(shù)語“抗逆植物”，指任何具有抗鹽、抗旱、抗寒、抗熱、抗蟲等特性的植物。
本發(fā)明者通過將兩種作用機(jī)理不同的基因(目的基因A和B)分別或同時(shí)轉(zhuǎn)化到受體植物中，使其同時(shí)在受體植物中大量表達(dá)，從而獲得了耐鹽性顯著高于單個(gè)基因(即目的基因A和B)的受體植物。盡管不愿意受理論的束縛，本發(fā)明人認(rèn)為所述顯著耐鹽特性的獲得可能是基于以下原因一方面受體植物細(xì)胞內(nèi)小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量提高，其維持滲透平衡的能力得以增強(qiáng)；另一方面，受體植物細(xì)胞內(nèi)Na+/H+交換蛋白的含量大幅度提高，將細(xì)胞液中的鈉離子“包裝”到液泡內(nèi)，從而使雙轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽特性進(jìn)一步提高。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)這兩種不同的作用機(jī)理的組合導(dǎo)致了植物抗逆性有了出乎意料的顯著增加，雙轉(zhuǎn)基因植株的種子可以在含有高鹽濃度的培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活，而單獨(dú)表達(dá)目的基因A或B的單轉(zhuǎn)基因植株不能在含有高鹽濃度的培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活。本發(fā)明的方法不僅使受體植物的抗鹽能力達(dá)到最高點(diǎn)，還使其對(duì)其他相關(guān)逆境因子(如寒冷、干旱等)的耐受性也同時(shí)得以提高。
具體而言，本發(fā)明的方法包括以下步驟1.構(gòu)建可以在植物中大量表達(dá)的基因表達(dá)載體，將目的基因A、目的基因B分別裝配于具有不同篩選標(biāo)記的基因表達(dá)載體上，置于強(qiáng)力組成型表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子(如CaMV35S)或其他類型的啟動(dòng)子(如可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的二元載體?；?qū)⒛康幕駻、目的基因B裝配到同一個(gè)表達(dá)載體上，置于強(qiáng)力組成型表達(dá)強(qiáng)力啟動(dòng)子(如CaMV35S)或其他類型的啟動(dòng)子(如可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的三元載體。
2.將上述基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體植物中，并在啟動(dòng)子的帶動(dòng)下，使目的基因在轉(zhuǎn)基因受體植物中大量表達(dá)；根據(jù)基因表達(dá)載體上的篩選標(biāo)記篩選具有雙抗性的再生植株?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的植物，這些方法包括但不局限于，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(較佳的用去臂的T-DNA載體)、化學(xué)轉(zhuǎn)化(如PEG轉(zhuǎn)化)、電穿孔、直接DNA轉(zhuǎn)移、花粉管法和粒子轟擊等技術(shù)。例如，一種熟知的方法是根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移入植物組織，然后進(jìn)行選擇和體外生長(zhǎng)，隨后將轉(zhuǎn)化的植物組織再生成植物。本發(fā)明的目的基因A和B可籍由同一表達(dá)載體或不同表達(dá)載體分別導(dǎo)入植物細(xì)胞中。較佳的是，所述表達(dá)載體還可攜帶抗生素(如卡那霉素、潮霉素、慶大霉素或博來霉素等)有抗性的標(biāo)記基因。這些標(biāo)記基因的存在使人能選出在含有某些抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的成功轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。
通過植物轉(zhuǎn)化技術(shù)衍生獲得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，包括上述那些，可培育再生成具有轉(zhuǎn)化基因型的全植物，從而具有所需的表型(如對(duì)鹽的耐受性)。從植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植株的技術(shù)雖然對(duì)于本發(fā)明而言很重要，但是它是本領(lǐng)域中熟知的常規(guī)技術(shù)。例如，從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植物的方法在Evans，等人，《原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)，植物細(xì)胞培養(yǎng)手冊(cè)》124-176頁，Macmillan Publishing Company，New York，1983中有所描述。另外，還可從植物胼胝體、外植體、器官或其部分再生植物。如果已經(jīng)將可選擇的標(biāo)記(如抗生素抗性標(biāo)記)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，那么可將選擇試劑摻入再生培養(yǎng)基中，以進(jìn)一步確認(rèn)再生的小植株是轉(zhuǎn)基因植株。所述再生培養(yǎng)基中例如可以是含有植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的MS培養(yǎng)基。
3.對(duì)第一代雙抗性再生植株進(jìn)行DNA(Southern Blots)，RNA(Northern Blots)及蛋白(Western Blots)雜交分析，并檢測(cè)其抗鹽性及其他相關(guān)的抗逆性；4.對(duì)上述蛋白分析呈陽性的第一代個(gè)體進(jìn)行繼代繁殖，并分析其后代(F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4)中目的基因的含量(表達(dá)水平)及個(gè)體的抗鹽性及其他相關(guān)的抗逆性；
5.對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行中試及大田試驗(yàn)，并申請(qǐng)通過國(guó)家相關(guān)部門的品種鑒定。
本發(fā)明另一方面還提供了一種植物細(xì)胞，其特征在于，它被與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化。在較佳的實(shí)施方案中，所述植物是煙草，所述與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的或清除活性氧自由基的基因是山菠菜堿脫氫酶基因，所述Na+/H+交換蛋白基因是MGX4基因。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件(如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989中所述條件)實(shí)施，或按照制造廠商所建議的條件。
將從山菠菜中克隆的參與甜菜堿合成的山菠菜堿脫氫酶(BADH)基因、從紅樹中克隆的MGX4基因(Na+/H+Antiport)基因在煙草中分別及共同表達(dá)后，雙轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性明顯高于表達(dá)單個(gè)基因(BADH或Na+/H+Antiport)的轉(zhuǎn)基因煙草，并且雙轉(zhuǎn)基因煙草的種子可以在含有高鹽濃度(200mM NaCl)的培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活，而單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草不能在含有高鹽濃度的培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活(圖8，9)。將BADH基因、MGX4基因，分別裝配于強(qiáng)力組成型表達(dá)的花椰菜花葉病毒35S強(qiáng)力啟動(dòng)子(CaMV35S)之下，構(gòu)建成可以在植物中表達(dá)的載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，使該目的基因在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)大量表達(dá)，具體操作如下1)、植物表達(dá)載體pHXZ/BADH、pHXZ/MGX4的構(gòu)建將具有卡那霉素篩選標(biāo)記的二元植物表達(dá)載體pBI121首先用限制性內(nèi)切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平頭，再用限制性內(nèi)切酶Xba I切割，將載體上原有的GUS基因切去，將載體純化后回收；同時(shí)，將BADH抗鹽基因(Jia et al，2002)用Xba I和SmaI酶切，然后將其回收后同載體連接，得到具有卡那霉素篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pHXZ/BADH(
圖1)。將具有潮霉素篩選標(biāo)記的二元植物表達(dá)載體pGPTV35S-HPT首先用限制性內(nèi)切酶SstI消化后，用T4DNA聚合酶切成平頭，再用限制性內(nèi)切酶Xba I切割，將載體上原有的GUS基因切去，將載體純化后回收；同時(shí)，將MGX4基因(紅樹Na+/H+交換蛋白基因)用Xba I和SmaI酶切，將其回收后同載體連接，得到具有潮霉素篩選標(biāo)記的植物表達(dá)載體pHXZ/MGX4(圖2)。
2)、煙草的遺傳轉(zhuǎn)化將植物表達(dá)載體pHXZ/BADH、pHXZ/MGX4分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中(Zhang & Zeevaart 1999)，用含有pHXZ/BADH的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液感染野生煙草葉切片，在共生培養(yǎng)基(MS+1毫克/升6-BAP(芐基氨基嘌呤)、0.1毫克/升NAA(萘乙酸))上共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素、200毫克/升氨芐霉素)；如圖3所示，在100mg/L的卡那霉素的選擇壓力下，可以從經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片外植體上再生出煙草植株。大約三周后，將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升卡那霉素、100毫克/升氨芐霉素)，誘導(dǎo)生根；兩周后將已生根的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)，將收獲的T1種子播種在含有100毫克/升卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選出純合體，對(duì)其進(jìn)行分子鑒定后用于二級(jí)轉(zhuǎn)化。
用含有pHXZ/MGX4的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液感染表達(dá)BADH基因的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，在共生培養(yǎng)基MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素)上共培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上(MS+1毫克/升6-BAP、0.1毫克/升NAA、100毫克/升卡那霉素、50毫克/升潮霉素、200毫克/升氨芐霉素)。如圖3所示，在100mg/L的卡那霉素、50毫克/升潮霉素的選擇壓力下，可以從經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的煙草葉片外植體上再生出煙草植株。
大約三周后，將再生的轉(zhuǎn)基因幼苗切下，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(MS+0.1毫克/升NAA、50毫克/升卡那霉素、50毫克/升潮霉素、200毫克/升氨芐霉素)，誘導(dǎo)生根。兩周后將已生根的幼苗轉(zhuǎn)移到土壤中培養(yǎng)，將收獲的T1種子播種在含有50毫克/升潮霉素的MS培養(yǎng)基上，篩選出純合體，對(duì)雙轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定和耐鹽試驗(yàn)。
如圖4所示，在50mg/L的潮霉素的選擇壓力下，只有經(jīng)過轉(zhuǎn)化的具有潮霉素抗性的煙草再生植株可以生根。假陽性(箭頭所示)可以在進(jìn)一步的篩選中篩除。
在100mg/L的卡那霉素和150mM NaCl的選擇壓力下，對(duì)卡那抗性植株做進(jìn)一步的選擇，經(jīng)過兩周和一個(gè)月的篩選、觀察，只有轉(zhuǎn)基因的再生植株(TG)可以正常生根，而野生型的煙草一直到一個(gè)月后都難以生根(圖5)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR分析，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株中已經(jīng)整合了外源基因(圖6)。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在100mg/L的卡那霉素、50mg/L的潮霉素和不同濃度NaCl(0、100、200、300mM)的選擇壓力下，野生型煙草在選擇培養(yǎng)基上萌發(fā)后，不能長(zhǎng)出真葉。而轉(zhuǎn)基因煙草的種子在選擇培養(yǎng)基上可以萌發(fā)且正常生長(zhǎng)。經(jīng)過抗性篩選后，轉(zhuǎn)基因植株的根比對(duì)照有極明顯的伸長(zhǎng)(圖7)。
將雙轉(zhuǎn)基因煙草的種子培養(yǎng)在含有高鹽濃度(200mM NaCl)的MS培養(yǎng)基上可以萌發(fā)并存活，而單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草不能在含有高鹽濃度(200mM NaCl)的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并存活(如圖8，9所示)。
另外，對(duì)野生型煙草、單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草、同時(shí)表達(dá)BADH和MGX4基因的雙轉(zhuǎn)基因煙草幼苗(長(zhǎng)出3-4片真葉)進(jìn)行耐旱試驗(yàn)(每周保持3天干旱處理)，結(jié)果如
圖10所示，雙轉(zhuǎn)基因煙草的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于野生型煙草以及單獨(dú)表達(dá)BADH或MGX4的單轉(zhuǎn)基因煙草。
在本發(fā)明前面以及下文提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
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權(quán)利要求
1.一種培育抗逆性提高的植物品種的方法，其特征在于，該方法包括a)將與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化到所述植物細(xì)胞中，并使所述基因在所述植物細(xì)胞中表達(dá)；b)從步驟a)獲得的所述植物細(xì)胞再生出植物，并選出抗逆性提高的植物品種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因選自脯氨酸合成酶基因、膽堿氧化酶基因、山菠菜堿脫氫酶基因、磷酸甘露醇脫氫酶基因、膽堿脫氫酶基因、磷酸山梨醇脫氫酶基因、Δ1二氫吡咯-5-羧酸鹽合成酶基因或UAL1基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因，以及Na+/H+交換蛋白基因籍由同一表達(dá)載體導(dǎo)入所述植物細(xì)胞中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟a)中，與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因，以及Na+/H+交換蛋白基因籍由具有不同篩選標(biāo)記的不同表達(dá)載體分別導(dǎo)入所述植物細(xì)胞中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物選自光合水生物、藻類、厥類、裸子植物或被子植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化方法選自農(nóng)桿菌介導(dǎo)、PEG轉(zhuǎn)化、基因槍或花粉管法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗逆性為耐鹽性和抗旱性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因是山菠菜堿脫氫酶基因，所述Na+/H+交換蛋白基因是紅樹Na+/H+交換蛋白基因。
9.一種植物細(xì)胞，其特征在于，它被與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na+/H+交換蛋白基因或其具有生物活性的片段或類似物轉(zhuǎn)化。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種培育抗逆性提高的植物品種的方法，其特征在于，該方法包括a)將與小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成相關(guān)的基因或清除活性氧自由基的基因或其具有生物活性的片段或類似物，以及Na
文檔編號(hào)A01H4/00GK1727490SQ200410053340
公開日2006年2月1日 申請(qǐng)日期2004年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月30日
發(fā)明者張洪霞, 楊磊, 賈同春 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 山東中盛生物工程有限公司