專利名稱：水葫蘆生物抑制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及天然植物源除草劑，具體是關(guān)于水葫蘆生物抑制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
水葫蘆[Eichhornia crassipes(Martus)Solmslaubach]又稱鳳眼蓮，是雨久花科鳳眼藍(lán)屬的多年生飄浮性宿根大型水生單子葉植物，原產(chǎn)于南美洲。水葫蘆在13-39℃溫度下均能繁殖，以無(wú)性繁殖為主，在適宜條件下每5天就能繁殖一個(gè)新的植株，也能開(kāi)花結(jié)實(shí)產(chǎn)生種子而進(jìn)行有性繁殖，一枝花大約結(jié)300粒種子。1萬(wàn)平方米的水面能生長(zhǎng)200萬(wàn)株水葫蘆，合計(jì)300多噸，是世界上生長(zhǎng)、繁殖最快的水草之一，也是危害最嚴(yán)重的多年生水生雜草之一。它侵占水庫(kù)、湖泊、堵塞河道、灌渠、為蚊蠅的滋生、繁殖提供良好的環(huán)境，嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)發(fā)展，水上運(yùn)輸和人類健康。
我國(guó)遼寧南部、華北、華東、華中、西南和華南的19個(gè)省(市、區(qū))均有分布，特別是長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，水葫蘆導(dǎo)致生態(tài)破壞和生物污染，生長(zhǎng)難以控制，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞，大量水生動(dòng)植物的死亡；導(dǎo)致生物多樣性的喪失、生態(tài)災(zāi)害頻發(fā)，對(duì)農(nóng)林業(yè)造成嚴(yán)重的損失。
目前在水葫蘆治理中，國(guó)內(nèi)多用人工打撈和化學(xué)藥劑。目前國(guó)內(nèi)外使用的化學(xué)藥劑主要有克無(wú)蹤(paraquat)、草甘磷(glyphosate)、農(nóng)達(dá)(Roundup)、41％Bioforce水劑、2，4-D。在龐大的水體中，濫用化學(xué)除草劑容易產(chǎn)生新一輪的環(huán)境污染造成的后果越來(lái)越嚴(yán)重，人們已把目光投向無(wú)污染、無(wú)公害的天然產(chǎn)物農(nóng)藥及植物性農(nóng)藥。
利用植物化感作用(allelopathy)來(lái)控制一些雜草的生長(zhǎng)，已有很多報(bào)道(Fujii Y等，weed Biology and Management 3233-241，2003；Singh HP等，Agriculture，Ecosystems and Environment 95537-541，2003；Chung IM等，Crop Protection 21913-920，2002)。開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥主要是利用植物體的次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)是植物自身防御體系與有害生物的相互適應(yīng)演變、協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，具有除草劑活性物質(zhì)通常包括酚酸類(phenolic acids)，生物堿(alkaloids)，三萜(烯)(triterpenes)等。與有機(jī)合成農(nóng)藥相比，植物源除草劑具有選擇性高、低毒、易降解等優(yōu)點(diǎn)(Beiz RG amd Hurle K，Journal of Chemical Ecology，Vol 30，No.1，pp 175-198，2004)。利用植物內(nèi)源提取物治理水葫蘆的有關(guān)報(bào)道很少，例如印度的Saxena報(bào)道用馬纓丹(Lantana camara)葉的提取液培養(yǎng)水葫蘆，能夠有效地殺死水葫蘆，但其作用機(jī)理及其有效成分尚不清楚(Saxena MK，Journal of Chemical Ecology，Vol.26，No.10.pp2435-2447，2000)。國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)用生物抑制劑治理水葫蘆的報(bào)道。因此，研究尋找一種安全、穩(wěn)定和高效的水葫蘆的生物防治制劑，為建立健康、有效的水葫蘆管理體系，提供新的途徑，是一個(gè)很有價(jià)值的研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種水葫蘆生物抑制劑及其制備方法。
水葫蘆生物抑制劑是由馬纓丹提取液，甘油和表面活性劑組成。它們的體積比為馬纓丹提取液∶甘油∶1重量％濃度的表面活性劑＝85-95∶10-4∶5-1。并用醋酸調(diào)節(jié)pH為5.6-5.8。
馬纓丹提取液的提取方法是將馬纓丹的葉片于60-80℃烘干至恒定，制成干粉。取1-10重量份的馬纓丹葉的干粉在100重量份水中于溫度1-10℃提取過(guò)夜，離心，取上清液即是馬纓丹提取液，馬纓丹是本發(fā)明抑制劑的活性成份，它能抑制水葫蘆生長(zhǎng)，葉芽的繁殖，加速水葫蘆葉的衰老死亡。
甘油是起保濕劑的作用，保持在噴藥后的一定時(shí)間內(nèi)葉表面有一定的濕度，以增加藥效。
表面活性劑的作用是，由于水葫蘆表面有蠟質(zhì)，光滑，表面活性劑的作用是使藥劑噴灑在葉的表面后，能粘附于葉的表面。表面活性劑可選自于吐溫-20，TritonX-100或十二烷基硫酸鈉(SDS)，在抑制劑配方中是采用1重量％濃度。
本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑的制備方法將馬纓丹的葉片于60-80℃烘干至恒重制成干粉，取1-10重量份的馬纓丹葉的干粉在100重量份水中于溫度1-10℃下提取過(guò)夜，離心，取上清液即得馬纓丹提取液。在該提取液中加入按上述體積比的甘油和1重量％濃度的表面活性劑，混勻，用醋酸調(diào)節(jié)pH為5.6-5.8，即制得液體抑制劑。
本發(fā)明抑制劑可直接噴灑在水葫蘆葉面上使用，實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它能有效地抑制水葫蘆葉芽的生長(zhǎng)，加速水葫蘆葉片衰老死亡。抑制效果還可通過(guò)對(duì)噴灑藥前后的葉片中的葉綠素含量的測(cè)定和超氧化物歧化酶的測(cè)定來(lái)顯示。
葉綠素是高等植物用于光合作用光能吸收和傳遞的主要色素。用本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑噴灑水葫蘆的實(shí)驗(yàn)表明，噴灑3天后，水葫蘆葉片的葉綠素含量，明顯低于對(duì)照，嫩葉與老葉中總的葉綠素相對(duì)含量分別是對(duì)照的50.39％與47.72％，葉綠素含量的減少，影響了葉片的光合作用，水葫蘆的生長(zhǎng)發(fā)育因此受到抑制。
超氧化物歧化酶(SOD)能夠有效地維持植物體細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡，水葫蘆生物抑制劑能降低水葫蘆細(xì)胞內(nèi)SOD活性，加速水葫蘆葉的衰老死亡，從而達(dá)到抑制水葫蘆的生長(zhǎng)與無(wú)性繁殖作用。
又對(duì)本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑進(jìn)行了對(duì)水體生物安全性的試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)南美白對(duì)蝦的安全濃度為235μl/l，對(duì)蒙古裸腹蚤的安全濃度為5.1ml/l，證明了該抑制劑對(duì)水體生物的毒性很低。
綜合本發(fā)明試驗(yàn)結(jié)果，表明以馬纓丹的天然產(chǎn)物為主要成分的本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑能夠有效地促進(jìn)水葫蘆葉片的衰老死亡，并對(duì)其葉芽有一定的抑制作用，降低葉片葉綠素的含量和超氧化物歧化酶的活性，對(duì)水葫蘆的生長(zhǎng)與有明顯的抑制作用，加速水葫蘆葉片的衰老死亡。
與目前國(guó)內(nèi)外常用的有機(jī)化學(xué)藥劑相比，本發(fā)明還具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)生產(chǎn)成本低本發(fā)明采用的藥用植物馬纓丹是一種生物產(chǎn)量很高的植物，容易栽培，且有效成份含量高、活性強(qiáng)。
(2)容易生產(chǎn)馬纓丹葉干燥后，只需簡(jiǎn)單的水提取即可使用，不要復(fù)雜的化學(xué)合成。
(3)無(wú)化學(xué)污染，環(huán)保型的具有低毒、易降解等環(huán)保方面的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明抑制劑使用的植物的天然產(chǎn)物，在使用一段時(shí)間后，就能夠被降解，實(shí)驗(yàn)表明該抑制劑對(duì)水生生物的毒性很低。
(4)本發(fā)明抑制劑的使用不受溫度的限制，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的研究表明，用本制劑噴灑水葫蘆的葉，用藥劑量為0.17L/m2，每天噴灑一次，連續(xù)噴灑7天，都能有效地使水葫蘆的葉提早衰老死亡，根壞死，葉芽繁殖受到抑制。
因此本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑作為水葫蘆的天然植物源除草劑具有很大的潛在的應(yīng)用價(jià)值，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。


圖1水葫蘆生物抑制劑對(duì)水葫蘆葉芽繁殖與葉片衰老死亡作用的照片，A對(duì)照，B噴抑制劑5天后，C噴抑制劑8天后，D對(duì)照水葫蘆植株與處理11天后的水葫蘆植株。
圖2水葫蘆生物抑制劑對(duì)水葫蘆葉片中SOD酶活性影響的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1水葫蘆生物抑制劑的制備取廣州市郊區(qū)采集的馬纓丹葉，于70℃烘干至恒重，研磨成細(xì)粉末制成干粉(約小于100目)，在1000毫升水中加30克干粉，在4℃下進(jìn)行提取過(guò)夜，10000g離心15分鐘，取上清液，即為馬纓丹提取液。向該提取液940ml中，加入甘油50ml及1重量％濃度的吐溫-20 10ml，攪拌混勻，用醋酸將pH調(diào)節(jié)至5.6，即得液體水葫蘆生物抑制劑。
實(shí)施例2水葫蘆生物抑制劑的制備取廣州市郊區(qū)采集的馬纓丹葉，于80℃烘干至恒重，研磨成細(xì)粉末制成干粉(約小于100目)，在1000毫升水中加100克干粉，在10℃下進(jìn)行提取過(guò)夜，10000g離心15分鐘，取上清液，即為馬纓丹提取液。向該提取液850ml中，加入甘油100ml及1重量％濃度的TritonX-100 50ml，攪拌混勻，用醋酸將pH調(diào)節(jié)至5.8，即得液體水葫蘆生物抑制劑。
實(shí)施例3水葫蘆生物抑制劑對(duì)水葫蘆生長(zhǎng)及葉片衰老死亡的影響試驗(yàn)水葫蘆[Eichhornia crassipes(Mart.)Solms.Family Pontederiaceae]采集于上海市清浦縣的河道中，再于中科院植物生理生態(tài)所的人工氣候室的缸中進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。選取大小、形態(tài)相似的水葫蘆植株(每株水葫蘆大約50g鮮重，5片展開(kāi)的葉子，根長(zhǎng)20cm，水上部分20cm左右)培養(yǎng)于盛有15L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料盒(34×27×19cm)中，人工氣候室中培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，溫度25-30℃，光照1000-2500lux(modelAplab ML 4420光度計(jì)測(cè)定)。實(shí)驗(yàn)期間塑料盒中培養(yǎng)液通過(guò)添加蒸餾水保持恒定的體積。每一盒中放入5棵水葫蘆，每4盒為1組，用藥劑量為0.17L/m2，用實(shí)施例1制得的抑制劑進(jìn)行噴灑，每天噴灑一次，對(duì)水葫蘆新增及死亡葉進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。
試驗(yàn)結(jié)果1.噴藥后水葫蘆葉的反應(yīng)圖1表明噴灑抑制劑后，水葫蘆的老葉提前衰老死亡，在噴藥后3-5天水葫蘆的葉明顯失綠，8天后大部分葉已衰老死亡，根與莖部也開(kāi)始?jí)乃?。水葫蘆生長(zhǎng)受到明顯的抑制。
2.葉芽繁殖與葉的衰老死亡統(tǒng)計(jì)結(jié)果從表1可看出用水葫蘆生物抑制劑噴灑3天后，水葫蘆的葉片，尤其是較老的葉片開(kāi)始?jí)乃溃?天后膨大的葫蘆部位也開(kāi)始失綠壞死。本發(fā)明抑制劑同時(shí)還減慢了水葫蘆葉芽的增加速度，但不能完全抑制葉芽的繁殖，其主要作用是加速葉片衰老，最后導(dǎo)致其死亡(見(jiàn)圖1)，可見(jiàn)本發(fā)明抑制劑對(duì)抑制水葫蘆的生長(zhǎng)及葉芽的繁殖有顯著的效果。
表1.水葫蘆生物抑制劑處理對(duì)水葫蘆葉芽繁殖及葉片衰老死亡的影響

注表中數(shù)字是平均數(shù)±方差，“0”表示沒(méi)有。
實(shí)施例4.水葫蘆生物抑制劑對(duì)水葫蘆葉片的葉綠素含量影響的試驗(yàn)葉綠素的測(cè)定與計(jì)算參考Arnon等的方法(Amon DI，PlantPhysiol.，241-15，1949)加以修改。用實(shí)施例1制得的水葫蘆生物抑制劑噴灑水葫蘆3天后，選取從中心葉芽開(kāi)始的第2片葉為嫩葉，第5片葉為老葉，大約2g，剪碎后加丙酮10ml，過(guò)濾后，于751GW分光光度計(jì)上，663nm和645nm波長(zhǎng)處讀取光密度，計(jì)算出葉綠素的含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)表明，噴灑3天后，水葫蘆葉片的葉綠素含量，明顯低于對(duì)照，嫩葉與老葉中總的葉綠素相對(duì)含量分別是對(duì)照的50.39％與47.72％，葉綠素含量的減少，影響了葉片的光合作用，這也是本發(fā)明生物抑制劑能夠抑制水葫蘆生長(zhǎng)的原因之一。
表2水葫蘆生物抑制劑噴灑3天后水葫蘆葉片中葉綠素的含量(平均±方差)

注“相對(duì)含量”表示受處理的葉片中葉綠素的含量占對(duì)照葉片中葉綠素含量的百分比。
實(shí)施例5.水葫蘆生物抑制劑對(duì)水葫蘆葉片的超氧化物歧化酶影響的試驗(yàn)超氧化物歧化酶的測(cè)定方法參見(jiàn)Giannoplilis等的方法(Giannoplilis CN等，Plant physiol.，59315-318，1997)。取2g左右的葉片，加入5ml的研磨緩沖液(0.02mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.8)，研磨(冰上)成勻漿，用兩層紗布過(guò)濾后，13,000g，4℃離心，20分鐘。上清液即酶提取液用于酶活測(cè)定。反應(yīng)混合液3ml(由0.013mol/L蛋氨酸，1.3×10-6mol/L核黃素，7.5×10-5mol/L氮藍(lán)四唑，0.05mol/L磷酸鈉緩沖液組成，pH7.8)，與50μl酶提取液在37℃保溫，4000lux光照，15分鐘后，立即放回冰中保存，分光光度計(jì)560nm測(cè)定OD值。用磷酸緩沖液作為空白對(duì)照。
用實(shí)施例1制得的水葫蘆生物抑制劑進(jìn)行對(duì)水葫蘆葉的噴灑處理，測(cè)定結(jié)果如圖2所示，水葫蘆的嫩葉中SOD的活性一直高于老葉，水葫蘆生物抑制劑噴灑后顯著下降，在處理5天后仍然與老葉的對(duì)照樣品活性相似，在處理的早期嫩葉片中SOD尚能有效地清除O2，而后期SOD活性嚴(yán)重下降，則不能有效地清除O2，引發(fā)氧化性破壞作用，這可能是水葫蘆生物抑制劑處理總是老葉先衰老死亡的原因之一。
實(shí)施例6.水葫蘆生物抑制劑對(duì)水體生物的安全性試驗(yàn)將本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑委托上海水產(chǎn)大學(xué)進(jìn)行了對(duì)水體生物的安全性試驗(yàn)。試驗(yàn)對(duì)象為南美白對(duì)蝦(P.vanname)與蒙古裸腹蚤(Moina mongolica)。試驗(yàn)用水為曝氣自來(lái)水。按常規(guī)方法測(cè)得pH為7.3-7.5，硬度為4.6德國(guó)度，試驗(yàn)水溫分別為25±0.5℃與22±3℃。本實(shí)驗(yàn)對(duì)水葫蘆葉面噴灑的落入40cm深水中最大的濃度為60μl/L。
試驗(yàn)結(jié)果是南美白對(duì)蝦的安全濃度為235μl/L，對(duì)蒙古裸腹蚤的安全濃度為5.1ml/l。證明了本發(fā)明水葫蘆生物抑制劑對(duì)南美白對(duì)蝦與蒙古裸腹蚤的毒性很低。
權(quán)利要求
1.一種水葫蘆生物抑制劑，其特征在于所述抑制劑是由馬纓丹提取液，甘油和表面活性劑組成，它們的體積比為馬纓丹提取液∶甘油∶1重量％濃度的表面活性劑＝85-95∶10-4∶5-1，并用醋酸調(diào)節(jié)pH為5.6-5.8；所述馬纓丹提取液的提取方法，是將馬纓丹葉片于60-80℃烘干至恒重，制成干粉，取1-10重量份的馬纓丹葉的干粉在100重量份水中于溫度1-10℃下提取過(guò)夜，離心，取上清液即是馬纓丹提取液。
2.如權(quán)利要求1所述的水葫蘆生物抑制劑，其特征在于所述表面活性劑可選自于吐溫-20，Tinton X-100或十二烷基硫酸鈉。
3.如權(quán)利要求1所述的水葫蘆生物抑制劑的制備方法，其特征在于將馬纓丹葉片于60-80℃烘干至恒重，制成干粉，取1-10重量份的馬纓丹葉的干粉在100重量份水中于溫度1-10℃下提取過(guò)夜，離心，取上清液即是馬纓丹提取液，在該提取液中按權(quán)1的所述體積比加入甘油和1重量％濃度的表面活性劑，混勻，用醋酸調(diào)節(jié)pH為5.6-5.8即得液體抑制劑。
全文摘要
一種水葫蘆生物抑制劑及其制備方法。該抑制劑是由馬纓丹提取液，甘油和表面活性劑組成，取1－10重量份的馬纓丹葉制成的干粉在100重量份水中于溫度1－10℃下提取過(guò)夜，離心，取上清液即是馬纓丹提取液。該抑制劑可直接噴灑在水葫蘆葉面上使用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，它能有效地抑制水葫蘆葉芽的生長(zhǎng)，加速水葫蘆葉片衰老死亡；降低葉片葉綠素的含量和超氧化物歧化酶的活性，對(duì)水葫蘆的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，因此水葫蘆生物抑制劑作為水葫蘆的天然植物源除草劑具有很大的潛在的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N65/08GK1586206SQ20041005299
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月20日
發(fā)明者鄭慧瓊, 王六發(fā), 王慧 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院