專利名稱：一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，屬于植物組織培養(yǎng)方法，專用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的受體材料的培養(yǎng)。
二、技術(shù)背景草地早熟禾(Poa pratensis)屬冷季型草坪草，是溫帶地區(qū)重要的草種之一。由于它具有色澤美、抗寒能力強(qiáng)、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)北方地區(qū)多被用作建坪草種之一。草地早熟禾亦有自身的缺點(diǎn)，如易受病蟲危害、不耐炎熱等。
植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨成熟為改良草坪草開辟分子生物學(xué)育種新途徑。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化效率較高、遺傳穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，已被廣泛用于雙子葉植物。近年來，隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷改進(jìn)，已在水稻、小麥、玉米等禾谷類單子葉植物上得到應(yīng)用。至今，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在草地早熟禾上尚停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段，其主要原因是難以獲得顆粒狀的胚性愈傷組織。前人的研究工作著重于通過在培養(yǎng)基中附加不同的激素種類及其不同的激素配比組合，添加硫酸銅，誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生。在通常情況下，白色、半透明、粘狀胚性愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中逐漸喪失綠苗分化的能力，尤其是在通過農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)后徹底喪失植株再生的能力，從而影響草地早熟禾農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化工作的進(jìn)展。
迄今為止，國(guó)內(nèi)外應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化技術(shù)在草地早熟禾上僅有1例獲得成功的報(bào)道(柴寶峰等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物早熟禾的轉(zhuǎn)化[J]，植物學(xué)報(bào)，2003，45(8)966～973)。該文獻(xiàn)主要側(cè)重于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化技術(shù)方面的研究，未涉及顆粒狀愈傷組織的誘導(dǎo)。與前人的工作一樣，該作者在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上通過附加激素和硫酸銅誘導(dǎo)胚性愈傷組織發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)出的白色、半透明、粘狀胚性愈傷組織在繼代培養(yǎng)過程中逐漸喪失綠苗分化的能力，不宜用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的缺陷，提供一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，獲得的淺黃色、干燥、顆粒狀胚性愈傷組織的數(shù)量占總的誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)量40％以上。此類愈傷組織在繼代增殖培養(yǎng)、農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)、綠苗分化階段始終保持著顆粒狀結(jié)構(gòu)和植株再生的能力，從而保障農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化工作得以順利進(jìn)行。
技術(shù)方案一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，其特征在于，1)材料選用早熟禾的成熟種子為外植體材料；2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS大量元素、微量元素，B5維生素，蔗糖30g/L；附加激素2，4-二氯苯氧乙酸(簡(jiǎn)稱2，4-D，上?；瘜W(xué)試劑四廠)2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤(簡(jiǎn)稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)0.2mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；瓊脂條的用量為16g/L；3)培養(yǎng)方法將種子先浸泡在70％乙醇溶液中1～2min，再轉(zhuǎn)到0.1％(質(zhì)量比)HgCl2溶液中消毒15min，用無菌水沖洗3次后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為26±2℃，在散射光下培養(yǎng)，25d后獲得淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，即為適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾愈傷組織。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)和積極效果在離體培養(yǎng)條件下，通過調(diào)控愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的滲透壓，提高草地早熟禾顆粒狀胚性愈傷組織的誘導(dǎo)頻率，建立起高頻率植株再生受體系統(tǒng)，適合用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的受體材料，為開展草地早熟禾農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化工作提供了重要的基礎(chǔ)條件。
在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，固化劑—瓊脂條的用量增加一倍，即由常規(guī)用量8g/L提高到16g/L，獲得的淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織的數(shù)量占誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織總數(shù)40％以上。此類愈傷組織在繼代增殖培養(yǎng)、綠苗分化及農(nóng)桿菌感染和共培養(yǎng)過程中，始終保持著淺黃色、干燥、顆粒狀結(jié)構(gòu)和植株再生的能力，適合用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的受體材料。
使用本發(fā)明方法培養(yǎng)的淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已分別將蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(B.t基因)、葡萄糖氧化酶基因(GO基因)導(dǎo)入草地早熟禾“大青山”和“超級(jí)伊克利”兩個(gè)品種，獲得一批抗蟲、抗病轉(zhuǎn)基因工程植株。
具體實(shí)施例方式
1.材料和方法1.1試驗(yàn)材料選用草地早熟禾國(guó)外品種“超級(jí)伊克利”(Poapratensis L.cv.‘TotalEclipse’)和“午夜”(Poapratensis L.cv.‘Midnight’)由北京中種草業(yè)有限公司提供；國(guó)內(nèi)品種“大青山”(Poa pratensis L.cv.‘Daqingshan’)由內(nèi)蒙古畜牧科學(xué)院草原研究所提供，為試驗(yàn)材料。
1.2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS大量元素、微量元素，B5維生素，蔗糖30g/L。
附加激素2，4-二氯苯氧乙酸(簡(jiǎn)稱2，4-D，上?；瘜W(xué)試劑四廠)2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤(簡(jiǎn)稱BAP，上海雪滿生物科技有限公司)0.2mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；瓊脂條(乘風(fēng)牌，福建泉州市泉港化工廠)的用量分別設(shè)置3組對(duì)比試驗(yàn)8g/L、12g/L、16g/L。
1.3培養(yǎng)方法以成熟種子為外植體材料，種子先浸泡在70％乙醇溶液中1～2min，再轉(zhuǎn)到0.1％(質(zhì)量比)HgCl2溶液中消毒15min，用無菌水沖洗3次后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
培養(yǎng)室溫度為26±2℃，在散射光下培養(yǎng)。25d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)頻率。
2.結(jié)果2.1固化劑用量對(duì)顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)的影響表1、表2和表3結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中固化劑—瓊脂條的用量對(duì)顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)頻率有明顯的效果，在瓊脂正常用量的情況下3個(gè)品種誘導(dǎo)產(chǎn)生的淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織僅占誘導(dǎo)愈傷組織總數(shù)的3～7％而在瓊脂的用量提高一倍的情況下，顆粒狀愈傷組織占誘導(dǎo)愈傷組織總數(shù)的40％以上。
在禾谷類作物組織培養(yǎng)里，通常加入一定量的甘露醇提高培養(yǎng)基的滲透壓，獲得較高頻率的胚狀體發(fā)生。在本試驗(yàn)中，也觀察到添加甘露醇能起到提高顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)頻率的作用，但瓊脂的效果明顯比甘露醇的效果好。
2.2顆粒狀愈傷組織的植株再生能力從誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上選擇出顆粒狀愈傷組織進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)。在愈傷組織繼代培養(yǎng)基上，淺黃色、干燥、顆粒狀結(jié)構(gòu)愈傷組織的外形保持不變，經(jīng)過連續(xù)繼代培養(yǎng)3次后轉(zhuǎn)移到愈傷組織分化培養(yǎng)基上，25d后統(tǒng)計(jì)綠苗分化頻率。
表4顯示，大青山和超級(jí)伊克利兩個(gè)品種的顆粒狀愈傷組織經(jīng)過連續(xù)3次繼代培養(yǎng)后，其綠苗分化率保持在30％左右。
3.結(jié)論以草地早熟禾品種的種子為外植體材料，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的固化劑—瓊脂條的用量增加一倍，即由常用的8g/L提高到16g/L，誘導(dǎo)產(chǎn)生的淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織占愈傷組織誘導(dǎo)總量的40％以上。顆粒狀愈傷組織經(jīng)過連續(xù)繼代培養(yǎng)，其綠苗分化率保持在30％左右。顆粒狀愈傷組織適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化，獲得一批抗蟲、抗病轉(zhuǎn)基因工程植株。
表1 大青山成熟種子顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)情況III培養(yǎng)基固化劑用量 顆粒狀 粘狀 顆粒狀數(shù) 顆粒狀 粘狀顆粒狀數(shù)(克/升)塊數(shù) 塊數(shù) /總數(shù)(％) 塊數(shù) 塊數(shù)/總數(shù)(％)83 40 6.98 2 37 5.1312 9 29 23.68 8 32 20.0016 18 23 43.90 2126 44.68表2超級(jí)伊克利成熟種子顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)情況III培養(yǎng)基固化劑用量 顆粒狀 粘狀 顆粒狀數(shù) 顆粒狀 粘狀 顆粒狀數(shù)(克/升)塊數(shù) 塊數(shù) /總數(shù)(％) 塊數(shù) 塊數(shù) /總數(shù)(％)83 63 4.55 2 56 3.4512 10 55 15.38 13 53 19.7016 28 41 40.58 28 32 46.67
表3午夜成熟種子顆粒狀愈傷組織誘導(dǎo)情況III培養(yǎng)基固化劑用量 顆粒狀 粘狀 顆粒狀數(shù) 顆粒狀 粘狀 顆粒狀數(shù)(克/升)塊數(shù) 塊數(shù) /總數(shù)(％) 塊數(shù) 塊數(shù) /總數(shù)(％)85 67 6.94 6 797.0616 29 28 50.90 343747.89表4激素對(duì)大青山和超級(jí)伊克利的愈傷組織綠苗分化率的影響激素組合 大青山超級(jí)伊克利(mg/L) 愈傷總數(shù) 綠苗愈傷數(shù) 分化率(％) 愈傷總數(shù) 綠苗愈傷數(shù) 分化率(％)BA 2.0.NAA 0.1 52 1426.9 5218 30.6CPPU 2.0，NAA0.158 1627.6 5418 36.0本發(fā)明所用的基本培養(yǎng)基即由MS大量元素、微量元素(Murashige T，SkoogF.A revised medium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant，1962，15473～497)和B5維生素(Gamborg O L，Miller RA，Ojima K.Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J].Exp.Cell Res.，1968.50151～158)配合而成，是植物組織培養(yǎng)一種常用的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，其特征在于，1)材料選用早熟禾的成熟種子為外植體材料；2)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為MS大量元素、微量元素，B5維生素，蔗糖30g/L；附加激素2，4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L，6-芐基氨基嘌呤0.2mg/L；培養(yǎng)基在高壓滅菌前用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)整pH值至5.8；瓊脂條的用量為16g/L；3)培養(yǎng)方法將種子先浸泡在70％乙醇溶液中1～2min，再轉(zhuǎn)到0.1％(質(zhì)量比)HgCl2溶液中消毒15min，用無菌水沖洗3次后接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)室溫度為26±2℃，在散射光下培養(yǎng)，25d后獲得淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織，即為適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的受體材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，其特征在于，所用愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS大量元素和微量元素，B5維生素。
全文摘要
本發(fā)明一種適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的早熟禾組織培養(yǎng)方法，專用于早熟禾農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，固化劑—瓊脂條的用量增加一倍，即由常規(guī)用量8g/L提高到16g/L，獲得的淺黃色、干燥、顆粒狀愈傷組織的數(shù)量占誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織總數(shù)40％以上，適合用作農(nóng)桿菌介導(dǎo)法基因轉(zhuǎn)化的受體材料。用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已分別將蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白基因(B.t基因)、葡萄糖氧化酶基因(GO基因)導(dǎo)入草地早熟禾“大青山”和“超級(jí)伊克利”兩個(gè)品種，獲得一批抗蟲、抗病轉(zhuǎn)基因工程植株。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1561696SQ20041001448
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月29日
發(fā)明者佘建明, 張保龍, 倪萬潮, 何曉蘭, 陳志一, 朱瓊 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江紹興白云建設(shè)有限公司