專利名稱：一種真鯛胚胎冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類胚胎冷凍保存，具體地說是一種海洋魚類真鯛胚胎冷凍保存方法，把真鯛胚胎通過降溫、液氮保存及解凍洗脫，獲取復(fù)活胚胎的過程。
背景技術(shù)：
魚類胚胎冷凍保存研究約有20年歷史，由于魚類胚胎體積較大、含水量多、卵黃含量高、卵膜通透性差，冷凍保存較哺乳類胚胎困難得多。國內(nèi)外學(xué)者對魚類胚胎冷凍保存的損傷機理、冷凍降溫速率、解凍復(fù)溫、抗凍劑種類和毒性等方面進(jìn)行了大量研究，并取得很大進(jìn)展。目前鯉科魚類胚胎在-100℃以上溫度的冷凍保存已獲得較穩(wěn)定的復(fù)活率[張克儉，樓允東，張飲江等。三種淡水魚類胚胎低溫保存及其降溫和復(fù)溫速率的研究。水產(chǎn)學(xué)報1997，21(4)366-372]；鮭鱒魚類胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwaterfish.Thesis of the University of Minnesota，U.S.A 1986)；鯉魚和泥鰍胚胎的冷凍保存已突破了液氮溫區(qū)，Zhang等于1989年將16個鯉胚胎冷凍到-196℃，解凍后有4個復(fù)活，并有3尾孵出魚苗(Zhang，X.S.，Zhao，L.，Hua，T.C.，et al.A study on thecryopreservation of common carp embryos.CryoLetters，1989，10271-278)；張克儉等在1997年將心跳期泥鰍胚胎冷凍到-196℃，在16個胚胎中，有1個完全復(fù)活并孵出魚苗[張克儉，樓允東，張飲江等。三種淡水魚類胚胎低溫保存及其降溫和復(fù)溫速率的研究。水產(chǎn)學(xué)報1997，21(4)366-372]。雖然以上結(jié)果盡管還難以重復(fù)，但可以說是目前比較好的結(jié)果。以上魚類胚胎的冷凍保存方法并不適用于海洋魚類真鯛胚胎的保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于海洋魚類的真鯛胚胎冷凍保存方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為選擇真鯛心跳期胚胎，放入抗凍液中在0～4℃，預(yù)冷90分鐘；分段降溫，降溫期間在-12℃時置核，降溫至-30℃直接投入液氮中保存。
所述真鯛心跳期胚胎的心跳次數(shù)大于60次/分鐘；抗凍液是以平衡鹽溶液Cortland為基液(pH＝8.28)，其中含有體積含量5％的二甲基亞砜(DMSO)和5％的丙二醇(PG)二種抗凍劑；分段降溫是指0～-15.5℃降溫速度為3.5℃/分鐘，-15.5～-30℃降溫速度為3℃/分鐘。
所述保存后的真鯛胚胎解凍時在-80℃平衡10分鐘，放入43℃水浴解凍至冰核全部融化，用洗脫溶液洗脫，最后放入海水中培育，獲取復(fù)活胚胎；洗脫溶液是0.5mol/L蔗糖溶液；在洗脫時，在0.5mol/L蔗糖中浸泡10分鐘。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(1)真鯛心跳期胚胎與其它早期階段的胚胎相比，對冷凍降溫的耐受力最強；(2)DMSO和PG二種抗凍劑混合使用，減輕毒性作用；(3)-12℃置核大大降低溶液的過冷度；(4)-30℃直接投入液氮中，使胚胎快速通過-30℃以下“危險溫度區(qū)”，降低胞內(nèi)冰晶的冷凍損傷；(5)從-80℃至43℃的水浴解凍，快速渡過重結(jié)晶區(qū)，減少重結(jié)晶對胚胎的損傷；本發(fā)明的真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛這種海水名貴魚類的種質(zhì)保存、遺傳多樣性和育種及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
具體實施例方式
實施例1)撈取同批自然產(chǎn)真鯛受精卵，放置海水溫度18±1℃、微充氣的孵化桶內(nèi)培育，至心跳期胚胎，心跳次數(shù)60次/分鐘以上；2)用80目篩絹網(wǎng)撈取胚胎，用濾紙輕蘸吸去表面海水，放入DMSO5％+PG5％的以平衡鹽溶液Cortland為基液的抗凍液中，在0～4℃冰箱中浸泡90分鐘(預(yù)冷)；從冰箱中取2個2ml的凍存管，各吸取1.2ml的抗凍劑，其中一支含有61粒胚胎，另一只含有62粒胚胎；快速放入降溫儀，開始降溫；3)降溫程序為0～-15.5℃，降溫速度為3.5℃/min；-15.5～-30℃，降溫速度為3℃/min；其中在-12℃時，迅速從降溫儀中取出凍存管，將事先浸入液氮中解剖針取出，輕輕觸在溶液表面，凍存管快速放回降溫儀中，完成置核，降溫達(dá)到-30℃時，迅速將凍存管投入液氮罐中保存；4)保存2小時后取出凍存管，放入保持在-80℃的降溫儀中平衡10分鐘，然后迅速放在43℃水浴鍋中解凍，至冰核全部融化；5)立即用80目篩絹網(wǎng)過濾胚胎，與抗凍劑分離，放入0.5mol/L蔗糖溶液中浸泡10分鐘，然后再過濾，放入18±1℃的過濾海水中靜水培育；6)解凍后復(fù)活胚胎共為13粒，復(fù)活率為10.57％，復(fù)活胚胎全部發(fā)育至仔魚。
權(quán)利要求
1.一種真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于選擇真鯛心跳期胚胎，放入抗凍液中在0～4℃，預(yù)冷90分鐘；分段降溫，降溫期間在-12℃時置核，降溫至-30℃直接投入液氮中保存。
2.按照權(quán)利要求1所述真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于所述真鯛心跳期胚胎的心跳次數(shù)大于60次/分鐘。
3.按照權(quán)利要求1所述真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于所述抗凍液是以平衡鹽溶液Cortland為基液，其中含有體積含量5％的二甲基亞砜和5％的丙二醇二種抗凍劑。
4.按照權(quán)利要求1所述真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于所述分段降溫是指0～-15.5℃降溫速度為3.5℃/分鐘，-15.5～-30℃降溫速度為3℃/分鐘。
5.按照權(quán)利要求1所述真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于所述保存后的真鯛胚胎解凍時在-80℃平衡10分鐘，放入43℃水浴解凍至冰核全部融化，用洗脫溶液洗脫，最后放入海水中培育，獲取復(fù)活胚胎。
6.按照權(quán)利要求5所述真鯛胚胎冷凍保存方法，其特征在于所述在洗脫時，在0.5mol/L蔗糖中浸泡10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及魚類胚胎冷凍保存，具體地說是一種海洋魚類真鯛胚胎冷凍保存方法，選擇真鯛心跳期胚胎，放入抗凍液中在0～4℃，預(yù)冷90分鐘；分段降溫，降溫期間在－12℃時置核，降溫至－30℃直接投入液氮中保存；保存后的真鯛胚胎解凍時在－80℃平衡10分鐘，放入43℃水浴解凍至冰核全部融化，用洗脫溶液洗脫，最后放入海水中培育，獲取復(fù)活胚胎。本發(fā)明的真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛這種海水名貴魚類的種質(zhì)保存、遺傳多樣性和育種及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
文檔編號A01N1/02GK1593124SQ03133938
公開日2005年3月16日 申請日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者李軍, 肖志忠, 丁福紅, 馬道遠(yuǎn), 徐世宏 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所