專利名稱：一種豬精液冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬精液冷凍保存方法，屬于家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，豬是最主要的飼養(yǎng)家畜，豬肉產(chǎn)量約占全國(guó)肉類總量的70%。近幾年隨著人民生活水平的提高，豬的育種方向從主要著眼于生長(zhǎng)速度與瘦肉率的提高，轉(zhuǎn)變?yōu)楦纳曝i肉的品質(zhì)，提高肉的風(fēng)味。傳統(tǒng)的選育方式世代間隔時(shí)間長(zhǎng)，已不能適應(yīng)市場(chǎng)需求，而采用豬冷凍精液技術(shù)，可充分利用優(yōu)良種畜，縮短良種選育世代間隔時(shí)間，快速建立新的適合市場(chǎng)要求的種豬和商品豬雜交繁育體系。同時(shí)，近千年的飼養(yǎng)史，已在我國(guó)形成了數(shù)百種各具特色的地方品種，這是一份非常寶貴的財(cái)產(chǎn)，今后畜牧業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)，相當(dāng)部份是遺傳資源，優(yōu)良基因利用的競(jìng)爭(zhēng)，但近年國(guó)外豬種的引進(jìn)雜交，已使我國(guó)有相當(dāng)數(shù)量的地方品種滅絕或面臨滅絕，而采用豬精液冷凍保存技術(shù)可有效保存我國(guó)地方豬種質(zhì)資源，具有不可估量的社會(huì)意義和效益。雖然草食家畜精液超低溫(_196°C )冷凍保存技術(shù)已在現(xiàn)代化畜牧生產(chǎn)、種質(zhì)資源保存中發(fā)揮著重要作用，并產(chǎn)生了顯見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。但豬冷凍精液一直難以在生產(chǎn)中大范圍推廣應(yīng)用，其原因有兩個(gè)，一是豬精子細(xì)胞質(zhì)膜中膽固醇與磷脂比率顯著低于草食動(dòng)物，在冷凍過(guò)程中精子膜的離子通透性增強(qiáng)，脂類物質(zhì)流失，導(dǎo)致凍精活率低、受胎率低。二是豬精子在冷凍過(guò)程中常受到自由基和氧化應(yīng)激的侵害，從而影響豬精子冷凍后活率和受精能力。自由基是細(xì)胞內(nèi)正常代謝產(chǎn)生的，生物體內(nèi)含有天然的抗氧化劑(自由基清除劑)以中和自由基的毒副作用。正是在這些抗氧化劑的調(diào)節(jié)下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。但是，在常規(guī)的豬精液冷凍稀釋液中上述抗氧化劑的水平低于體內(nèi)水平，并且在精子冷凍前的稀釋平衡過(guò)程中，不可避免地暴露于空氣，而空氣中的氧氣濃度高于生殖道內(nèi)氧氣濃度(20% VS. 7% )，加上體外操作時(shí)光線和稀釋液中金屬離子的影響，使得冷凍時(shí)精子內(nèi)自由基水平增加，打破了氧化-抗氧化的平衡狀態(tài)，導(dǎo)致精子氧化應(yīng)激損傷。因此，篩選新的冷凍保護(hù)劑以提高冷凍后精子活率已成為豬精液冷凍研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。谷胱甘肽是蛋氨酸、甘氨酸和半胱氨酸組成的含有巰基的非蛋白三肽，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠消除超氧陰離子和過(guò)氧化氫等自由基。它是組織細(xì)胞中主要的非蛋白巰基化合物，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶兩種酶類的底物，為這兩種酶分解過(guò)氧化氫所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶。對(duì)于谷胱甘肽的研究已有文獻(xiàn)報(bào)道。CN100455592C、CN100503837C、CN1164737C、CN1325511C、CN1313597C、CN100360679C 等多種專利申請(qǐng)公開(kāi)了谷胱甘肽的制備方法。CN1185008C、CN100435793C等多種專利公開(kāi)了谷 胱甘肽用作藥物的用途。但到目前為止，尚未見(jiàn)有關(guān)谷胱甘肽用于家畜繁殖技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于豬精液冷凍保存的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可降低冷凍對(duì)精子的損傷、提高冷精活率的豬精液冷凍保存方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是谷胱甘肽在制備豬精液冷凍保存液中的應(yīng)用。具體的，所述的豬精液冷凍保存液以適用于豬精液冷凍保存的稀釋液為基質(zhì)，所述豬精液冷凍保存液中還含有2 6mg/mL的谷胱甘肽，5 llmg/mL的乳糖和10 30% (v/v)卵黃、5 10% (v/v)的甘油和O. 5 2mg/mL的十二醇硫酸鈉。一種含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液，所述的豬精液冷凍保存液以常規(guī)適用于豬精液冷凍保存的稀釋液為基質(zhì)，所述豬精液冷凍保存液中還含有2 6mg/mL的谷胱甘肽，5 llmg/mL的乳糖和10 30% (v/v)卵黃、5 10% (v/v)的甘油和O. 5 2mg/mL的十二醇硫酸鈉。所述谷胱甘肽已有多種制取方法，屬于已知工藝和成熟技術(shù)，并已有商品出售，較為成熟的生產(chǎn)廠家有美國(guó)Sigma-Aldrich公司、陜西融升生物科技有限公司、重慶藥友制藥有限責(zé)任公司、湖州朗深系生物技術(shù)有限公司等。本發(fā)明中所用谷胱甘肽由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供，純度為98%。具體的，所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下
谷胱甘肽2 ~ 6 g
乳糖50 ~ IlOg
卵黃100 ~ 300 mL
甘油50 ~ 100 mL
十二自手稅酸納5 ~ 20 g適用于豬精液冷凍保存的稀釋液補(bǔ)足至1000mL。所述適用于豬精液冷凍保存的稀釋液為常規(guī)用于豬精液冷凍保存的稀釋液，如BTS稀釋液、韓國(guó)產(chǎn)的Seminark 稀釋液等。優(yōu)選的，所述適用于豬精液冷凍保存的稀釋液為BTS稀釋液(Beltsville thawing solution),每IOOOmL按如下配方配制葡萄糖37g、檸檬酸鈉6g、氯化鉀0. 75g、碳酸氫鈉I. 25g、乙二胺四醋酸I. 25g、青霉素100000單位，鏈霉素IOOmg,去離子水補(bǔ)足至1000mL。優(yōu)選的，所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下谷胱甘肽4g
乳糖80 g
卵黃200 mL
甘油80 mL
十二醇疏酸納5 gBTS稀釋液補(bǔ)足至1000mL。本發(fā)明還涉及一種應(yīng)用所述含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液進(jìn)行豬精液冷凍保存的方法，所述方法包括(I)將新鮮采取的豬精液用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍；(2)在15°C條件下靜置(平衡)2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘；(3)離心后去除上清液，沉淀用含谷胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液稀釋(不含甘油和十二醇硫酸鈉)，使精子密度為2 X IO9個(gè)/mL，稀釋后的精液在5°C條件下靜置(平衡)2小時(shí)后，再用5°C下保存的含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個(gè)/mL，得到稀釋后的精液； 所述豬精液冷凍稀釋液每IOOOmL組成如下谷胱甘肽2 6g乳糖50 IlOg卵黃100 300mLBTS稀釋液補(bǔ)足至IOOOmL ；所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下
谷胱甘肽2 ~ 6 g
乳糖50 ~ IlOg
卵黃100~300 mL
甘油50 ~ 100 mL
十二自手稅酸納5 ~ 20 gBTS稀釋液補(bǔ)足至IOOOmL ；(4)將冷凍稀釋后的精液裝入常規(guī)冷凍管，置于液氮面上3厘米，熏蒸5分鐘后，直接投入液氮中，冷凍保存?zhèn)溆?。本發(fā)明豬精液冷凍保存液，是根據(jù)豬精液冷凍保存過(guò)程中抗氧化、抗自由基的需要，結(jié)合谷胱甘肽的生物學(xué)功能研制而成。谷胱甘肽具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠消除超 氧陰離子和過(guò)氧化氫等自由基。它是組織細(xì)胞中主要的非蛋白巰基化合物，是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶兩種酶類的底物，為這兩種酶分解過(guò)氧化氫所必需，能穩(wěn)定含巰基的酶。因此谷胱甘肽應(yīng)用于豬精液冷凍保存，可以有效地去除冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的多余自由基，解決了目前豬精液冷凍保存存活率低的問(wèn)題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例I :制備含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液和冷凍稀釋液含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液制備
準(zhǔn)確稱取谷胱甘肽400mg，先用50mL的BTS稀釋液(每IOOOmL按如下配方配制葡萄糖37g、檸檬酸鈉6g、氯化鉀O. 75g、碳酸氫鈉I. 25g、乙二胺四醋酸I. 25g、青霉素100000單位，鏈霉素lOOmg，去離子水補(bǔ)足至IOOOmL)溶解，然后向稀釋液中加入8g乳糖、20mL的卵黃(從雞蛋中抽取得到)、8mL甘油和O. 5g的十二醇硫酸鈉，再加入BTS稀釋液至IOOmL,再次攪拌混勻。用O. 22 μ M的微濾膜抽濾消毒后，在5°C下貯存，備用。含谷胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液制備準(zhǔn)確稱取谷胱甘肽400mg，先用50mL的BTS稀釋液溶解，然后向稀釋液中加入8g乳糖和20mL的卵黃，再加入BTS稀釋液至IOOmL,再次攪拌混勻。用O. 22 μ M的微濾膜抽濾消毒后，在5°C下貯存，備用。實(shí)施例2 :含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液用于大約克豬精液冷凍保存選擇繁殖力高、體格健壯的大約克種公豬，采用手握法采精。收集精子豐富部分，經(jīng)4層滅菌紗布過(guò)濾去除膠體后，立即測(cè)精液量，并檢查精子活率，收集精子活率在75%以上的精液約50mL，用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍。在15°C條件下靜置平衡2小時(shí)，然后1000轉(zhuǎn)離心10分鐘。精液離心后去除精清，精子沉淀用含谷胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液(實(shí)施例I)稀釋，該稀釋液是不含甘油和十二醇硫酸鈉的本發(fā)明冷凍保存液，因?yàn)楦视偷蜏貤l件下對(duì)精子有毒副作用，加入甘油后精子要馬上冷凍不能低溫靜置。使精子密度為2X IO9個(gè)/mL。稀釋后的精液在5°C條件下靜置平衡2小時(shí)。再用豬精液冷凍保存液(實(shí)施例I)稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個(gè)/mL。對(duì)照組精液用不含谷胱甘肽的冷凍保存液(BTS稀釋液)稀釋，然后將試驗(yàn)組和對(duì)照組精液裝入O. 25mL常規(guī)冷凍管中，置于液氮面上3厘米，熏蒸5分鐘后，直接投入液氮中長(zhǎng)期保存。實(shí)施例3 :大約克豬凍精解凍為了檢測(cè)本發(fā)明專利的實(shí)施效果，大約克豬精液依次按照實(shí)施例I、實(shí)施例2方法處理后，分別將裝有凍精的試驗(yàn)組和對(duì)照組冷凍管置于37°C水浴鍋中10秒解凍，顯微鏡下檢測(cè)精力活率，其中對(duì)照組凍精解凍后活率為30. 2%，試驗(yàn)組冷凍管中凍精解凍后精子活率為36. 7%，比對(duì)照組提高6. 5%，統(tǒng)計(jì)分析表明兩者差異顯著。結(jié)果證實(shí)，含谷胱甘肽的豬精液冷凍保存液冷凍保存大約克豬精液可有效提高冷精解凍后的存活率。
權(quán)利要求
1.一種豬精液冷凍保存方法，所述方法包括 (1)將新鮮采取的豬精液用等溫的BTS稀釋液稀釋一倍； (2)在15°C條件下靜置2小時(shí)，1000轉(zhuǎn)離心10分鐘； (3)離心后去除上清液，沉淀用含谷胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液稀釋，使精子密度為2X IO9個(gè)/mL，稀釋后的精液在5°C條件下靜置2小時(shí)后，再用5°C下保存的所述的豬精液冷凍保存液稀釋一倍，使精子的最終密度為I X IO9個(gè)/mL，得到稀釋后的精液；所述含谷胱甘肽的豬精液冷凍稀釋液每IOOOmL組成如下 谷胱甘肽 2 6g 乳糖50 IlOg 卵黃100 300mL BTS稀釋液補(bǔ)足至IOOOmL ； 所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下谷胱甘肽2 ~ 6 g乳糖50 ~ IlOg卵黃100~300 mL甘油50 ~ 100 mL十二自手稅酸納5 ~ 20 g BTS稀釋液補(bǔ)足至IOOOmL ； (4)將冷凍稀釋后的精液裝入冷凍管，置于液氮面上3厘米，熏蒸5分鐘后，直接投入液氮中,冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述豬精液冷凍保存液每IOOOmL組成如下谷胱甘肽4g乳糖80 g卵黃200 mL甘油80 mL十二醇疏酸納5 g BTS稀釋液補(bǔ)足至lOOOmL。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種以含谷胱甘肽的冷凍保存液進(jìn)行豬精液冷凍保存的方法。所述的冷凍保存液以常規(guī)適用于豬精液冷凍保存的稀釋液為基質(zhì)，還添加有2～6mg/mL的谷胱甘肽，5～11mg/mL的乳糖和10～30％(v/v)卵黃、5～10％(v/v)的甘油和0.5～2mg/mL的十二醇硫酸鈉。本發(fā)明將谷胱甘肽應(yīng)用于豬精液冷凍保存，可以有效地去除冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的多余自由基，解決了目前豬精液冷凍保存存活率低的問(wèn)題。其經(jīng)濟(jì)成本較低，便于在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01N1/02GK102630665SQ20121010034
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者俞頌東, 王爭(zhēng)光, 董文艷, 陳阿琴 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)