專利名稱：用于誘導(dǎo)植物抗病性的微生物誘導(dǎo)劑的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域。
植物病害不但嚴(yán)重影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，它還直接有害于人、畜的健康。目前對(duì)植物病害的防治還是以化學(xué)農(nóng)藥為主，它的過量使用對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品的污染是不容忽視的問題。高效、低毒生物農(nóng)藥的研究和開發(fā)是生產(chǎn)綠色食品和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有效手段。植物都具有潛在的抗病基因，這一潛在的抗病基因可經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)出來，從而使植物免遭病原真菌、細(xì)菌和病毒的危害。微生物誘導(dǎo)劑是一類來源于微生物的能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性防衛(wèi)反應(yīng)的物質(zhì)，它們大多數(shù)是安全低毒、環(huán)境友好的。本發(fā)明的直接目的是提供微生物誘導(dǎo)劑的制備和使用方法。
微生物誘導(dǎo)劑主要包括微生物細(xì)胞提取物、微生物代謝產(chǎn)物以及微生物菌體。其中已知的有效成分有β-葡聚糖及其寡聚糖、幾丁質(zhì)、聚氨基葡糖及其寡聚糖、糖蛋白等，還有一些未知成分。
本發(fā)明所述的微生物誘導(dǎo)劑制備和使用方法內(nèi)容如下1.通過常規(guī)發(fā)酵方法(包括液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵等)進(jìn)行微生物發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物通過離心或過濾分別收集微生物菌體和發(fā)酵液。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物先用水浸泡，再壓濾，收集濾液和濾渣，液態(tài)發(fā)酵液和固態(tài)發(fā)酵濾液以及菌體都有一定的誘導(dǎo)劑活性。
2.微生物菌體在沸水中回流2～4小時(shí)。過濾或離心分別收集微生物菌體和抽提液。這兩部分產(chǎn)物都有一定的誘導(dǎo)劑活性。
3.沸水抽提過的微生物菌體(主要是真核微生物)在10％左右NaOH或KOH溶液中回流1小時(shí)，根據(jù)微生物菌種的不同可適當(dāng)調(diào)整堿的濃度和回流時(shí)間；冷卻，抽濾，用水洗滌。如此反復(fù)幾次，再用稀鹽酸煮沸，抽濾，先后用水、無水乙醇洗滌，脫水，濾干，干燥，即得幾丁質(zhì)。
4.將獲得的幾丁質(zhì)與脫乙酰酶在TES-NaOH緩沖液(pH5.5)中30℃培養(yǎng)48小時(shí)，即可獲得聚氨基葡糖。
5.將步驟1、2獲得的發(fā)酵液、提取液用水按一定比例稀釋，均勻噴霧與植物表面，必要時(shí)加入表面活性劑，幫助其在植物表面吸附，向植物組織內(nèi)部滲透，間隔3-5天噴霧一次，根據(jù)具體情況可適當(dāng)調(diào)整稀釋倍數(shù)和間隔天數(shù)。經(jīng)過該方法處理的植物對(duì)多數(shù)病害都有一定的防效。
6.將步驟1、2獲得的微生物菌體或孢子(植物病原菌需滅活)制備成懸濁液，均勻噴霧與植物表面，必要時(shí)加入表面活性劑，幫助其在植物表面吸附，間隔3-5天噴霧一次，根據(jù)具體情況可適當(dāng)調(diào)懸濁液濃度和間隔天數(shù)。也可以拌種或拌入植物所生長(zhǎng)的土壤中。經(jīng)過該方法處理的植物對(duì)多數(shù)病害都有一定的防效。
7.將步驟4獲得的聚氨基葡糖配成0.1％左右的溶液，浸泡植物種子，或直接噴灑到植株表面，可預(yù)防多數(shù)植物病害。
實(shí)施例1各種微生物發(fā)酵產(chǎn)物誘導(dǎo)植物抗病實(shí)驗(yàn)用土豆汁培養(yǎng)基，接種草酸青霉、黑曲霉、溜曲霉、大毛霉等菌種，液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)充分培養(yǎng)后，發(fā)酵液稀釋到總糖濃度為0.1％，加入0.05％的吐溫20，噴霧黃瓜幼苗，用0.05％的吐溫20水溶液作對(duì)照，每隔3天噴霧一次，3次誘導(dǎo)后，挑戰(zhàn)接種黑星病，待對(duì)照幼苗發(fā)病明顯后分別調(diào)查對(duì)照和處理幼苗的病情指數(shù)，計(jì)算各處理的防效。各菌種的發(fā)酵液誘導(dǎo)黃瓜對(duì)黑星病的防效見表1，表中數(shù)據(jù)為3次平行的平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。
表1
實(shí)施例2各種微生物細(xì)胞提取物誘導(dǎo)植物抗病實(shí)驗(yàn)用土豆汁培養(yǎng)基，接種草酸青霉、黑曲霉、大毛霉、釀酒酵母等菌種，液態(tài)發(fā)酵，經(jīng)充分培養(yǎng)后，過濾，收集菌體，在沸水中回流3小時(shí)。過濾或離心分別收集微生物菌體和抽提液。抽提液稀釋到總糖濃度為0.06％，加入0.05％的吐溫20，噴霧黃瓜幼苗，用0.05％的吐溫20水溶液作對(duì)照，每隔3天噴霧一次，3次誘導(dǎo)后，挑戰(zhàn)接種黑星病，待對(duì)照幼苗發(fā)病明顯后分別調(diào)查對(duì)照和處理幼苗的病情指數(shù)，計(jì)算各處理的防效。各菌種的發(fā)酵液誘導(dǎo)黃瓜對(duì)黑星病的防效見表2，表中數(shù)據(jù)為3次平行的平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。
表2
實(shí)施例3草酸青霉菌體提取物對(duì)不同植物的誘導(dǎo)抗病效果將草酸青霉菌體提取物配制成總糖濃度為0.06％的溶液，加入0.05％的吐溫20，噴霧植物幼苗，用0.05％的吐溫20水溶液作對(duì)照，每隔3天噴霧一次，3次誘導(dǎo)后，挑戰(zhàn)接種病原菌，待對(duì)照幼苗發(fā)病明顯后分別調(diào)查對(duì)照和處理幼苗的病情指數(shù)，計(jì)算各處理的防效。各菌種的發(fā)酵液誘導(dǎo)黃瓜對(duì)黑星病的防效見表3，表中數(shù)據(jù)為3次平行的平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10％。
表權(quán)利要求
1.收集微生物發(fā)酵產(chǎn)物，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物通過離心或過濾分別收集微生物菌體和發(fā)酵液。固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物先用水浸泡，再壓濾，收集濾液和濾渣，液態(tài)發(fā)酵液和固態(tài)發(fā)酵濾液以及菌體都可以誘導(dǎo)植物抗病害。
2.微生物菌體在沸水中回流，過濾或離心分別收集微生物菌體和抽提液。微生物菌體和抽提液都可以誘導(dǎo)植物抗病害。
3.微生物菌體(主要是真核微生物)在濃NaOH或KOH溶液中回流，根據(jù)微生物菌種的不同可適當(dāng)調(diào)整堿的濃度和回流時(shí)間；冷卻，抽濾，用水洗滌。如此反復(fù)幾次，再用稀鹽酸煮沸，抽濾，先后用水、無水乙醇洗滌，脫水，濾干，干燥，即得幾丁質(zhì)。微生物幾丁質(zhì)也可以誘導(dǎo)植物抗病害。
4.權(quán)利要求第3項(xiàng)所獲得的幾丁質(zhì)與脫乙酰酶在TES-NaOH緩沖液(pH5.5)中30℃培養(yǎng)48小時(shí)，即可獲得聚氨基葡糖。聚氨基葡糖也可以誘導(dǎo)植物抗病害。
5.權(quán)利要求第1、2項(xiàng)所獲得的發(fā)酵液、提取液用水按一定比例稀釋，均勻噴霧與植物表面，必要時(shí)加入表面活性劑，幫助其在植物表面吸附，向植物組織內(nèi)部滲透，間隔一段時(shí)間天噴霧一次，根據(jù)具體情況可適當(dāng)調(diào)整稀釋倍數(shù)和間隔天數(shù)。經(jīng)過該方法處理的植物對(duì)多數(shù)病害都有一定的防效。
6.權(quán)利要求第1、2項(xiàng)所獲得的微生物菌體或孢子(植物病原菌需滅活)制備成懸濁液，均勻噴霧與植物表面，必要時(shí)加入表面活性劑，幫助其在植物表面吸附，間隔一段時(shí)間噴霧一次，根據(jù)具體情況可適當(dāng)調(diào)懸濁液濃度和間隔天數(shù)。也可以拌種或拌入植物所生長(zhǎng)的土壤中。經(jīng)過該方法處理的植物對(duì)多數(shù)病害都有一定的防效。
7.權(quán)利要求第3項(xiàng)所獲得的聚氨基葡糖配成0.02～0.5％的溶液，浸泡植物種子，或直接噴灑到植株表面，可預(yù)防多數(shù)植物病害。
全文摘要
本發(fā)明為一種以微生物代謝產(chǎn)物、微生物菌體以及微生物細(xì)胞提取物來誘導(dǎo)植物抗病害的方法，并設(shè)計(jì)了各種微生物誘導(dǎo)劑的制備方法，屬于生物農(nóng)藥領(lǐng)域。發(fā)明以各種微生物菌體、微生物孢子以及微生物發(fā)酵產(chǎn)物為原料，制備了多種能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病能力的微生物誘導(dǎo)劑。用制備的各種微生物誘導(dǎo)劑處理植物幼苗或種子，實(shí)驗(yàn)了不同植物對(duì)不同病害的防治效果，結(jié)果表明，經(jīng)過誘導(dǎo)的植物都產(chǎn)生了一定的抗病效果。
文檔編號(hào)A01N63/00GK1456059SQ0312079
公開日2003年11月19日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者張洪勛, 白志輝, 彭霞薇, 齊鴻雁 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心