專利名稱：用于鑒定一類新的水稻黃色斑駁病毒抗性基因和主要病毒抗性基因的基因座的手段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于鑒定一類新的水稻黃色斑駁病毒(Rice YellowMottle Virus，RYMV)抗性基因和主要病毒抗性基因的基因座的手段、工具、和方法。
關(guān)于工具，本發(fā)明特別涉及感染周期所必需的蛋白質(zhì)，標(biāo)記和PCR引物，以及它們在抗性基因的物理作圖和基因克隆中的應(yīng)用。
RYMV是非洲的地方性病毒。它與其它南方菜豆花葉病毒組具有共同特征即只有一條單鏈RNA，正極性、未聚腺苷酸化、且小型；并在植物中以非常大的數(shù)量產(chǎn)生T＝3對稱的二十面體顆粒。病毒顆粒還大量存在于維管組織中，主要是導(dǎo)管。在Oryza glaberrima的少數(shù)稀有品種中，鑒定了針對RYMV的非常高的抗性。但是，由于這兩種栽培稻物種之間的種間雜種極端不育，因此先前的研究尚不能夠描述這種抗性的遺傳基礎(chǔ)或機(jī)制。
本發(fā)明人在這一領(lǐng)域的研究顯示，稱為Gigante的品種顯示與O.glaberrima相同的特征，前者起源自莫桑比克，由ADRAO鑒定，且是Oryzasativa的成員。發(fā)明人通過證明RYMV抗性與考慮中的兩種抗性來源(O.sativa和O.glaberrima)中相同的主要隱性抗性基因有關(guān)而表征了RYMV抗性。
該抗性以細(xì)胞-細(xì)胞運(yùn)動的水平存在，并導(dǎo)致在受感染細(xì)胞處阻斷病毒，而病毒復(fù)制是正常的。
發(fā)明人關(guān)于RYMV的工作顯示，該病毒在整個感染周期中以不同方式運(yùn)動和增殖。在接種葉片中(I，


圖11)，它是病毒RNA與病毒蛋白質(zhì)(衣殼蛋白，P1，可能還有P3)復(fù)合物的形式，穿過表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、維管周圍鞘細(xì)胞(束內(nèi)輸導(dǎo)組織和鞘細(xì)胞)的胞間連絲，到達(dá)維管細(xì)胞(韌皮和木薄壁組織)(II，
圖11)，局部運(yùn)動。在維管細(xì)胞中，在所謂的長距離運(yùn)動前，它在酸性pH的液泡中借助Ca2+二價離子包裹自身并穩(wěn)定于致密顆粒的形式(II，
圖11)。只有在產(chǎn)生大量穩(wěn)定顆粒時才發(fā)生全身感染。在全身感染葉片中，病毒離開輸導(dǎo)組織，或在初期維管組織中或在葉肉細(xì)胞中增殖。在這一感染階段，局部運(yùn)動以去被膜形式(病毒RNA與蛋白質(zhì)復(fù)合物)或被膜形式發(fā)生，但總是穿過胞間連絲(III，
圖11)。
在感染周期的這些不同階段，病毒復(fù)合物和/或病毒粒需要由植物蛋白質(zhì)鑒定并轉(zhuǎn)運(yùn)，從而由一個細(xì)胞區(qū)室運(yùn)動至另一個細(xì)胞區(qū)室，由一個細(xì)胞運(yùn)動至另一個細(xì)胞。
例如，與病毒或其復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的植物蛋白質(zhì)似乎具有相似功能(轉(zhuǎn)運(yùn))，但是對于穿越的組織而言是特異的(表皮、葉肉、束內(nèi)輸導(dǎo)組織、維管周圍鞘、韌皮部、木質(zhì)部)。若這些蛋白質(zhì)是由野生型等位基因翻譯的，則它就是使病毒得以運(yùn)動的易感蛋白質(zhì)。另一方面，靜默型等位基因似乎導(dǎo)致低功能的蛋白質(zhì)(部分抗性)或無功能的蛋白質(zhì)(完全抗性)。
由此認(rèn)為，這些蛋白質(zhì)屬于其共同細(xì)胞功能顯然是識別底物并轉(zhuǎn)運(yùn)通過胞間連絲的基因家族，但是這些蛋白質(zhì)在組織特異性方面是不同的(表皮、葉肉、束內(nèi)輸導(dǎo)組織、維管周圍鞘、韌皮部、木質(zhì)部)。
共質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控極可能是這一基因家族的必需功能。
RYMV還是一種非常穩(wěn)定的病毒，在細(xì)胞中存在幾種異構(gòu)體，已經(jīng)確定了3種致密型、腫脹型、和中間型。因此，顆粒的構(gòu)造和外部電荷隨細(xì)胞pH(細(xì)胞質(zhì)pH7-8；液泡、小泡、和導(dǎo)管pH4.5-6.5)而變化。外部電荷使之得以附著于膜上并經(jīng)內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入健康細(xì)胞。最后，在細(xì)胞水平，本發(fā)明人顯示這種病毒主要在液泡中積累。因此，在部分抗性植株中3種異構(gòu)體的在植物中的存在、區(qū)室化、和病毒積累有可能提出與抗性不同的RYMV耐受性原始機(jī)制。
RYMV耐受性似乎通過液泡中的積累而發(fā)生。通過物理隔離病毒顆粒與細(xì)胞區(qū)室，液泡膜顯然防止了對細(xì)胞機(jī)器的任何有害的相互作用。因此，病毒增殖，積累，而并不殺死細(xì)胞(因此無癥狀)。
宿主細(xì)胞與病毒之間的關(guān)系是植物擔(dān)當(dāng)貯藏工廠。
在這種模型中，病毒與宿主植物之間的共進(jìn)化引導(dǎo)病毒調(diào)整自身，最終由植物識別成由植物產(chǎn)生的簡單貯藏蛋白質(zhì)，經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡。液泡膜的劇烈內(nèi)陷(自噬機(jī)制)可能使在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的病毒得以在液泡中積累。
另外，這種機(jī)制還類似于細(xì)胞解毒，例如重金屬或鹽。
考慮到這些結(jié)果，發(fā)明人首先準(zhǔn)備了用于鑒定識別并靶向轉(zhuǎn)運(yùn)植物中致病病毒所涉及的蛋白質(zhì)和用于克隆這些過程所涉及的基因的方法。
因此，本發(fā)明的目的是提供用于捕獲致病病毒(尤其是RYMV病毒)感染周期不可缺少的靶蛋白的方法，并涉及如此分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于鑒定RYMV抗性基因座分子標(biāo)記的方法。
本發(fā)明還同樣涉及DNA片段，如由這種方法揭示的、可用作標(biāo)記的DNA片段。
本發(fā)明還涉及這些標(biāo)記的應(yīng)用，特別是用于確定對抗性基因座具有高度特異性的其它標(biāo)記，和用于預(yù)測抗性表型。
本發(fā)明特別涉及所述標(biāo)記用于確定抗性物理圖譜和用于基因克隆的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及作為新產(chǎn)品用于PCR技術(shù)的引物序列。
用于分離識別并靶向轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)胞間連絲在植物中循環(huán)的致病病毒所涉及的蛋白質(zhì)的方法，其特征為將含所述蛋白質(zhì)與病毒顆粒復(fù)合物的樣品進(jìn)行電泳，使用衣殼抗蛋白質(zhì)單克隆抗體進(jìn)行Western印跡，然后收集非免疫檢測條帶。
根據(jù)一種變體，復(fù)合物得自由受感染的敏感植株提取的病毒。
更具體的說，病毒是RYMV病毒，且收集5、24、42、49、59、66、70、77、和210kDa的蛋白質(zhì)。
根據(jù)另一種變體，復(fù)合物得自純化病毒，并接觸敏感植株細(xì)胞懸浮液中的蛋白質(zhì)。
具體的說，病毒是RYMV病毒，且收集24、45、51、57、63、85、和大于120kDa的蛋白質(zhì)。
諸如由上述方法獲得的蛋白質(zhì)也屬于本發(fā)明新產(chǎn)品的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明涉及這些蛋白質(zhì)的應(yīng)用，特別是用于克隆抗致病病毒抗性基因的應(yīng)用，所述致病病毒經(jīng)胞間連絲在植物中循環(huán)。
本發(fā)明還涉及RYMV中主要抗性基因基因座標(biāo)記的鑒定，包括AFLP標(biāo)記(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)的應(yīng)用和PCR技術(shù)的應(yīng)用。
這種鑒定方法的特征為包括下列步驟-由親本品種的抗性后代個體和敏感后代個體選擇性擴(kuò)增水稻DNA片段，這些片段事先已被消化，并通過連接而固定末端具有一個或多個特定核苷酸的互補(bǔ)引物銜接頭，引物對中的一種引物被標(biāo)記以便顯影，-通過變性條件下凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并-比較衍生自抗性后代的片段混合物和衍生自敏感后代的片段混合物以及衍生自親本品種的片段混合物的電泳圖譜，以便鑒定其多態(tài)性與抗性基因座遺傳連鎖的條帶，任選的，為了確認(rèn)，在此鑒定后在每一種個體上進(jìn)行確認(rèn)，并計算標(biāo)記與抗性基因座之間的遺傳重組率。
在本發(fā)明的一個實施方案中，DNA片段是通過使用限制酶消化抗性植株和敏感植株及其親本的基因組DNA而獲得的。
經(jīng)證明合適的限制酶包括EcoRI和MseI。
將短核苷酸序列固定于消化片段(銜接頭)以產(chǎn)生平端，隨后用于固定銜接頭。
用于擴(kuò)增步驟的引物在3’端與這些銜接頭互補(bǔ)1-3個核苷酸，這是可變的。
使用PCR技術(shù)有利的進(jìn)行擴(kuò)增步驟。
使用末端分別包含AAC與CAG、ACC與CAG、或AGC與CAG基序的引物對，獲得特異性擴(kuò)增圖譜。
對應(yīng)于EcoRI和MseI銜接頭的序列分別是GAC TGC GTA CCA ATT C(SEQID NO.1)和GAT GAG TCC TGA GTA A(SEQ ID NO.2)。
然后在E-AAC/M-CAG、E-ACC/M-CAG、和E-AGC/M-CAG中有利的選擇用于擴(kuò)增的引物對；其中E和M分別對應(yīng)于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。實施例中的表6給出了其它引物對。
所得擴(kuò)增圖譜的比較性研究揭示，如實施例所示，多態(tài)性條帶特異存在于敏感品種及其敏感后代中，并由此對應(yīng)于抗性標(biāo)記。
具體的說，由變性條件下凝膠電泳的顯影結(jié)果鑒定出分別為510bp和140bp的2種標(biāo)記條帶M1和M2。
根據(jù)對分離數(shù)據(jù)的分析，這2種條帶確定了攜帶抗性基因座、且位于該基因座兩側(cè)5-10cM的10-15cM染色體區(qū)段。
根據(jù)本發(fā)明方法，由凝膠分離鑒定為RYMV抗性基因座特異標(biāo)記的多態(tài)性條帶。有利的切下電泳凝膠。在此分離步驟后，使用傳統(tǒng)技術(shù)進(jìn)行純化。以這種方式獲得DNA片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一種形式，在適當(dāng)載體(諸如質(zhì)粒)中克隆所述純化片段，并插入宿主細(xì)胞，特別是細(xì)菌細(xì)胞，諸如大腸桿菌。
根據(jù)本發(fā)明的另一種形式，對純化的、克隆的DNA片段測序。
利用對應(yīng)于所述DNA片段的插入片段序列，本發(fā)明還提供了用于獲得對RYMV中主要抗性基因的基因座具有高度特異性的標(biāo)記的方法。該方法的特征為，確定與給定插入片段序列的片段互補(bǔ)的PCR引物對，使用這些引物對特異性擴(kuò)增插入片段，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。
這些DNA序列可用于通過如下例示的不同方法鑒定與待測水稻品種中抗性基因座連鎖的多態(tài)性-在特異性擴(kuò)增片段并在瓊脂糖凝膠上分離片段后，直接鑒定這些DNA序列的大小多態(tài)性；-用限制酶消化擴(kuò)增產(chǎn)物，并在瓊脂糖凝膠上分離消化產(chǎn)物；-以這些序列為探針，雜交經(jīng)限制酶消化的水稻品種DNA，并確定限制性多態(tài)性。
本發(fā)明涉及作為新產(chǎn)品的多態(tài)性AFLP條帶，諸如通過上文所述方法由水稻植株DNA鑒定的AFLP條帶，并任選分離、純化、和測序。
如實施例中所述，這些AFLP條帶的特征為它們是在RYMV敏感品種(IR64)中和衍生自該品種與Gigante抗性品種雜交的敏感植株部分中特異揭示的。
本發(fā)明特別涉及對應(yīng)于這些多態(tài)性條帶的DNA序列，它們可用于確定攜帶RYMV抗性基因座的10-15cM的4號染色體片段。
考慮到用于獲得它們的方法，AFLP條帶對應(yīng)于限制性片段，具體的說，根據(jù)本發(fā)明方法的一個實施方案，對應(yīng)于EcoRI-MseI片段。
這類片段稱為M1和M2標(biāo)記，特征為在變性條件凝膠電泳中的大小分別是510bp和140bp。
這些片段的特征為它們對應(yīng)于抗性基因座側(cè)翼的DNA序列，且位于后者任一側(cè)的5-10cM。
本發(fā)明涉及諸如上文所述定義的cDNA，特征為對應(yīng)于所述多態(tài)性條帶的所述DNA序列攜帶RYMV抗性基因座，且確定小于10cM的片段。
本發(fā)明還涉及在載體(諸如質(zhì)粒)中克隆的片段，這些克隆載體本身，其特征為它們包含這些片段，以及用這些載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌。本發(fā)明特別涉及對應(yīng)于鑒定為M1標(biāo)記的片段、且滿足下文序列SEQ ID NO.3的DNA序列 M1標(biāo)記的DNA序列的大小為471bp。
本發(fā)明還涉及用作PCR擴(kuò)增引物的核苷酸序列新產(chǎn)品。
這些引物包括成對的E-AAC/M-CAG、E-ACC/M-CAG、和E-AGC/M-CAG；其中E和M分別對應(yīng)于SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
其它引物與在稱為標(biāo)記M1的片段序列中鑒定的序列互補(bǔ)。具體的說，是選自下面的序列(5’-3’)AGGAAGGGGAACACAACAGCC(21 bp)(SEQ ID N°4)TTATGCTGGAGGGGCTTGACC(21 bp)(SEQ ID N°5)GCAGTTCCATGCTGAGCGCAT(21 bp)(SEQ ID N°6)CCGAACATCCTCGAAAGGTCC(21 bp)(SEQ ID N°6)TCATATTCTGCGAGGAGCACC(21 bp)(SEQ ID N°8)本發(fā)明還涉及對應(yīng)于鑒定為標(biāo)記M2的片段、且對應(yīng)于下文序列SEQ IDNO.9的DNA序列AATTCACCCC ATGCCCTAAG TTAGGACGTT CTCAGCTTAG TGGTGTGGTAGCTTTTTCTA TTTTCCTAAG CACCCATTGA AGTATTTTGC ATTGGAGGTGGCCTTAGGTT TGCCTCTGTTAM2的大小為120bp。
確定了與在序列M2中鑒定的序列互補(bǔ)的特異引物。所述序列滿足下面的序列(5’-3’)SEQ ID N°10AACCTAAGGCCACCTCCAATSEQ ID N°11GCAAACCTAAGGCCACCTCSEQ ID N°12ATTCACCCCATGCCCTAAG根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及使用上述引物獲得的DNA序列用于確定多態(tài)性的應(yīng)用，這可用于鑒定抗性表型。
本發(fā)明還涉及用于鑒定攜帶RYMV主要抗性基因的DNA序列的方法。該方法的特征為篩選由IR64或其它品種的100-150kb DNA片段構(gòu)成的庫，諸如克隆在細(xì)菌中的BAC庫(BAC指細(xì)菌人工染色體)，從而由庫中選擇包含上文定義的標(biāo)記和RYMV抗性基因的克隆。
這類BAC庫可由IRRI協(xié)會獲得。
為了鑒定所選克隆的基因，將由植物提取的蛋白質(zhì)原液用于鑒定組分，然后逐步鑒定當(dāng)存在純化病毒時能夠在抗性品種中進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞運(yùn)動的蛋白質(zhì)。然后或由N端或由水解釋放的內(nèi)部片段，對候選蛋白質(zhì)部分測序?？梢赃@種方式確定引物并用于擴(kuò)增相應(yīng)cDNA。為了證實，確認(rèn)這些cDNA與位于微衛(wèi)星標(biāo)記之間的BAC克隆發(fā)生雜交。
另外，有可能將包含該基因的BAC片段亞克隆到粘粒形式的更小元件中，隨后重排以覆蓋完整的最初BAC克隆。將粘粒用于遺傳工程以進(jìn)行功能互補(bǔ)測試，從而確認(rèn)粘粒中包含的對應(yīng)于使用蛋白質(zhì)方法分離的cDNA的序列。在這種情況中，其目的是證明負(fù)責(zé)細(xì)胞-細(xì)胞病毒運(yùn)動的蛋白質(zhì)的合成有可能使抗性品種變得敏感。
因此，本發(fā)明涉及能夠與由上文所述包含100-150kb水稻品種(諸如IR64)DNA片段的庫(例如BAC庫)篩選得到的BAC克隆雜交的cDNA，此BAC克隆屬于包含標(biāo)記DNA序列的BAC克隆毗連序列群(或重疊BAC克隆組)，所述標(biāo)記DNA序列是利用上文定義的方法由水稻鑒定的。
根據(jù)本發(fā)明，可以傳統(tǒng)方式使用所結(jié)合的特異遺傳標(biāo)記將抗性基因轉(zhuǎn)移至敏感品種。這樣，抗性品種可以快得多、容易得多的方式培育。
另一個興趣點是這種基因的序列有助于獲得其它病毒(例如馬鈴薯Y病毒組)的抗性基因，這些病毒對于其它植物而言是致病的，但是機(jī)制(細(xì)胞-細(xì)胞運(yùn)動)是相同的。因此，本發(fā)明提供了極感興趣的以植物病原體天然抗性為基礎(chǔ)的植物改良手段。
下文實施例將說明本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點，并提及分別描繪下列內(nèi)容的
圖1-15
圖1PGEMTeasy質(zhì)粒中標(biāo)記M1的克隆。質(zhì)粒消化顯示對應(yīng)于條帶M1的510bp DNA片段。
圖2四種水稻品種(Azucena、Gigante、IR64、和Tog5681)中標(biāo)記M1的擴(kuò)增，使用引物對(2-4)291bp；(2-5)310bp；(1-3)288bp；(1-4)406bp；(1-5)425bp；(2-3)Tog5681中的M1片段略大于其它品種。
圖3四種品種(Azucena、Gigante、IR64、和Tog5681)中M1標(biāo)記序列上限制性位點的鑒定。
圖4使用引物對(1-3)、(1-4)、和(1-5)在四種品種(Azucena、Gigante、IR64、和Tog5681)上PCR擴(kuò)增后，用HpaII消化M1標(biāo)記。IR64和Tog5681品種中HpaII限制性位點的存在導(dǎo)致釋放86bp片段，這在相同程度上減小了擴(kuò)增片段的大小。
圖5F2后代(IR64和Gigante)抗性植株和敏感植株中M1標(biāo)記的表征?？剐訤2植株具有抗性親本的圖譜(IR64-無HpaII位點)，除了一個重組體例外；而敏感植株具有敏感親本的圖譜(IR64-有HpaII位點)，除了兩個重組體例外。
圖6HD群(IR64 x Azucena)；IR64-Azucena-30 HD個體(IR64 xAzucena)中M1標(biāo)記的分離。
圖7水稻4號染色體的遺傳連鎖圖，注明了標(biāo)記M1的位置和存在抗性基因座的空間間隔的鑒定。
圖8在攜帶衍生自四種品種(Azucena、Gigante、IR64、和Tog5681)并經(jīng)六種限制酶ApaI、KpnI、PstI、ScaI、XbaI、和HaeIII消化的DNA的膜上以M1標(biāo)記為探針進(jìn)行的雜交。Tog5681品種顯示的ScaI限制性圖譜不同于其它品種，這可用于標(biāo)記該品種的抗性基因座。
圖9在攜帶衍生自回交(IR64 x Tog5681)x Tog5681個體并經(jīng)ScaI消化的DNA的膜上以M1標(biāo)記為探針進(jìn)行的雜交。這些后代發(fā)生RYMV抗性分離。敏感個體(5)都顯示IR64條帶及Tog5681條帶(雜合子個體)?？剐詡€體(9)只顯示Tog5681條帶，除了一個重組個體例外。
圖10IR64 x Azucena圖上RYMV抗性基因座的作圖和錨定。
圖11接種葉片后，RYMV病毒在植株中的運(yùn)動。
圖12由受感染的敏感植株提取的病毒的層析圖。
圖13-16注入病毒后的層析、SDS-PAGE凝膠、和使用衣殼抗蛋白質(zhì)抗體的免疫印跡。
實施例實施例1抗性來源品種的鑒定使用基因座代表性取樣上的微衛(wèi)星標(biāo)記，表征用于抗性研究的品種，尤其是2種抗性品種Gigante和Tog5681。
通過短核苷酸模式重復(fù)的數(shù)目證明了多態(tài)性，最經(jīng)常的是給定品種特征的二核苷酸。
在一組基因座上，編入的等位基因可為每一種品種提供特異特征。
使用由Chen等人[1]確定的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后參照由相同作者描述的方案進(jìn)行變性條件聚丙烯酰胺凝膠電泳，由此檢測這些微衛(wèi)星標(biāo)記。
表1給出了結(jié)果，使用由Chen等人[同上]制定的參照系統(tǒng)，據(jù)此通過模式重復(fù)數(shù)目與作為對照的IR36品種的比較而鑒定了等位基因。因此，就任何其它品種而言，在基因座15上具體描述了2種品種Gigante和Tog5681(第1列給出了微衛(wèi)星標(biāo)記)。
表1
實施例2抗性的表征用病毒人工接種早期幼苗，并與極敏感對照品種IR64比較，由此表征抗性。
使用ELISA測試，在接種后長達(dá)60天內(nèi)在最近的葉片上跟蹤病毒含量。
這些測試從來不能證明與未接種病毒的對照植株的信號顯著不同的信號。
通過接種2種品種Tog5681和Gigante的分離原生質(zhì)體進(jìn)行了進(jìn)一步實驗。在這兩種情況中，都有可能檢測到病毒蛋白質(zhì)(衣殼蛋白和P1運(yùn)動蛋白)的存在和病毒DNA的積累，證明這些原生質(zhì)體能夠以與敏感品種(諸如IR64)原生質(zhì)體相同的方式增殖病毒。
因此，若認(rèn)為復(fù)制、細(xì)胞-細(xì)胞運(yùn)動、和經(jīng)導(dǎo)管的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)是植物內(nèi)感染周期過程中的3個主要步驟，則這兩個品種中的抗性最合邏輯的在于阻斷受感染細(xì)胞處的病毒。實施例3抗性遺傳學(xué)在抗性O(shè).sativa品種(Gigante)、抗性O(shè).glaberrima品種(Tog5681，也是由ADRAO鑒定的)、和高度敏感對照品種IR64(選自IRRI)之間進(jìn)行了不同的F1雜交。
植物材料的培養(yǎng)、雜交、和后代生成是在Montpellier的IRD溫室中進(jìn)行的。
通過ELISA測試對敏感與抗性品種之間的F1雜種測試RYMV病毒抗性并跟蹤癥狀。
這些F1雜種證明是與敏感親本一樣敏感的，由此顯示抗性類型是隱性的。
另一方面，2種抗性來源Gigante與Tog5681之間的雜種只產(chǎn)生抗性F1雜種，這是由于這些抗性來源為單一抗性基因座。
下文表2概述了這些結(jié)果。
此表給出了F1雜種、回交、和由敏感IR64品種與2種抗性栽培品種Gigante和Tog5681之間回交獲得的F2后代的全身途徑受感染葉片中的ELISA應(yīng)答分布(A 405nm)。
表2
ELISA應(yīng)答是由下列各項獲得的1)通過插條為每種F1雜種組合再生的10株植株2)為每種回交衍生種間基因型再生的1株植株3)對F2和可育種間后代直接測試早期幼苗(萌芽后10天接種并在接種后7天讀數(shù))關(guān)于Gigante，通過得自(IR64 x Gigante)雜交的55株F3族的抗性測試確認(rèn)了抗性遺傳。表3給出了結(jié)果。
此表給出了F3后代(IR64 x Gigante)中RYMV抗性的分離。萌芽后17天接種Burkina Faso隔離種群，并在接種后長達(dá)45天內(nèi)跟蹤癥狀。
表3
*通過ELISA測試分析由抗性F2植株衍生的F3后代檢查此表，顯示-1/4的F2植株只產(chǎn)生抗性植株F3后代，是抗性純合子，-1/4的F2植株只產(chǎn)生敏感植株F3后代，是敏感純合子，-1/2的F2植株處于抗性分離中，并以相同比例(3∶1)產(chǎn)生敏感與抗性植株F3后代。
所有這些結(jié)果完全吻合2種品種Gigante和Tog5681中存在的單一隱性抗性基因。實施例4使用AFLP方案鑒定M1和M2抗性標(biāo)記a-獲得DNA群對由F2(IR64 x Gigante)衍生的10株敏感植株和10株抗性植株的葉片取樣，用于提取DNA。
然后以化學(xué)計量方式混合DNA，形成分別對應(yīng)于10株敏感或抗性F2植株的兩種DNA群，混合物終濃度50ng/μl。這些混合物在由Zaneau等人[4]和Vos等人[5]開發(fā)的AFLP法(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)中用作鑒定抗性標(biāo)記的基礎(chǔ)。所用產(chǎn)品是可由Keygene&Life Technologies獲得的商品化試劑盒(Gibco BRL)。b-獲得限制性片段2種DNA群(50ng/μl)和親本各取250ng，用2種限制酶EcoRI和MseI同時消化。消化反應(yīng)(25μl)5μl DNA(50ng/μl)0.2μl (2U)EcoRI(10U/μl)0.2μl (2U)MseI(5U/μl)5μl 5x T4連接酶緩沖液14.5μl H2O消化反應(yīng)于37℃進(jìn)行2小時，然后70℃保溫15分鐘滅活限制酶。消化后，進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)(50μl)25μl雙重消化反應(yīng)體系1μl EcoRI銜接頭1μl MseI銜接頭5μl 5x T4連接酶緩沖液1μl (1U)連接酶(10U/μl)17μlH2O連接反應(yīng)于37℃進(jìn)行3小時，然后60℃保溫10分鐘滅活連接酶。c-擴(kuò)增以兩步適當(dāng)進(jìn)行所謂的擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增和特異擴(kuò)增。c1-預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)(50μl)5μl 含經(jīng)消化、固定了銜接頭、1/10稀釋的DNA的反應(yīng)體系0.5μl EcoRI引物(150ng/μl)2μl 5mM核苷酸混合物5μl 10x緩沖液，Promega5μl 25mM MgCl2
0.2μl (1U)Taq聚合酶(5U/μl)31.8μl H2OPCR預(yù)擴(kuò)增的設(shè)置如下20個循環(huán) 變性94℃30sec雜交56℃30sec延伸72℃1min取第一次擴(kuò)增1/30稀釋的一部分，用3’端含3個選擇性核苷酸的引物進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并通過標(biāo)記引物對中的一種引物使條帶在放射自顯影膠片上顯影。
所用引物對如下E-AAC/M-CAGE-ACC/M-CAGE-AGC/M-CAG其中E符合序列(SEQ ID NO.1)GAC TGC GTA CCA ATT C而M符合序列(SEQ ID NO.2)GAT GAG TCC TGA GTA A
在隨后的11個循環(huán)中，將雜交溫度降低0.7℃/循環(huán)最后20個循環(huán) 變性90℃30sec雜交56℃30sec延伸72℃ 1min標(biāo)記EcoRI引物(0.5μl管)0.18μl EcoRI引物(5ng)0.1μlγ33P-ATP(10mCi/μl)0.05μl 10x激酶緩沖液0.02μl (0.2U)T4聚合酶激酶(10U/μl)0.15μl H2O標(biāo)記反應(yīng)于37℃進(jìn)行1小時，然后70℃保溫10分鐘終止反應(yīng)。c2-特異擴(kuò)增反應(yīng)(20μl)0.5μl 經(jīng)標(biāo)記EcoRI引物5μl 1/30稀釋的預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系0.3μl MseI引物(100ng/μl)0.8μl 5mM核苷酸混合物2μl 10x緩沖液，Promega2μl 25mM MgCl20.1μl (0.5U)Taq聚合酶(5U/μl)9.3μl H2O擴(kuò)增設(shè)置如下第1個循環(huán) 變性94℃30sec雜交65℃30sec延伸72℃1min隨后11個循環(huán)條件與以前相同，降低雜交溫度0.7℃/循環(huán)最后20個循環(huán)變性90℃30sec
雜交56℃30sec延伸72℃1mind-電泳和放射自顯影在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束時，加入20μl加樣緩沖液(98％甲酰胺、0.005％二甲苯腈藍(lán)、和0.005％溴酚藍(lán))。在變性聚丙烯酰胺凝膠(6％丙烯酰胺、8M尿素)上以TBE(18mM Tris、0.4mM EDTA、18mM硼酸，pH8.0)為電泳緩沖液以50瓦電泳3小時，以分離擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳后，在1∶2醋酸/無水乙醇中固定凝膠20分鐘。將凝膠轉(zhuǎn)移至3M Wattman紙上，并用凝膠干燥器于80℃烘干45分鐘。將凝膠置于裝有超敏膠片的盒中。曝光2天后，將放射自顯影膠片顯影。比較由親本與敏感或抗性植株群獲得的圖譜，鑒定出存在于一個群而不存在于另一個群中的條帶。然后，在構(gòu)成DNA群的每一株植株上挨個確認(rèn)這些條帶，即抗性標(biāo)記的候選者。e-結(jié)果研究所得結(jié)果顯示，稱為M1和M2的2種標(biāo)記存在于敏感親本(IR64)和形成敏感植株群的所有F2植株(IR64 x Gigante)中，而此條帶不存在于抗性親本(Gigante)中，且抗性群中只有1個個體顯示此條帶。在回交(IR64 x Tog5681)x Tog5681中觀察到相同類型的變異。由此分析鑒定的其它標(biāo)記(M3至M6)也顯示相同變異-在敏感親本、F2敏感植株(IR64 x Gigante)群、和回交(IR64 xTog5681)x Tog5681的敏感植株中存在條帶。
-在抗性親本Gigante和Tog5681、F2抗性植株(IR64 x Gigante)群、和回交(IR64 x Tog5681)x Tog5681的抗性植株中不存在條帶。
表4和表5概述了AFLP標(biāo)記M1至M6(即F2群(IR64 x Gigante)和種間回交(IR64 x Tog5681)x Tog5681的抗性基因座)之間的分離資料。對分離資料和在這兩種雜交中罕見重組體的分析，可用于估算這些不同標(biāo)記與抗性基因座之間的重組率。具體的說，首先是標(biāo)記M1，其次是標(biāo)記M2至M6，確定了小于10-15cM的攜帶抗性基因座的片段。因此，M1與M2相距小于5-10cM，且位于此基因座的兩側(cè)。
表4
表5
*(-)種間回交Tog5681(+或-)F2群。實施例5標(biāo)記M1的分離用相同引物對進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，隨后在上述相同條件下進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。使用銀染試劑盒(Promega)通過硝酸銀染色進(jìn)行顯影，直接觀看凝膠上的條帶。顯影后，由凝膠切下M1條帶，然后在50μl水中4℃過夜洗脫DNA。
取5μl，用P33標(biāo)記的相同引物對再次擴(kuò)增。再次在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并比較親本與敏感和抗性群。對應(yīng)于此擴(kuò)增產(chǎn)物的泳道顯示510bp的單一條帶，與切下的最初條帶的泳動水平完全相同。再取5μl，同樣用相同引物對擴(kuò)增，并在1.8％瓊脂糖凝膠上分離。再次切下對應(yīng)于預(yù)期大小(510bp)的條帶，并用基因清潔試劑盒(Promega)純化。實施例6M1標(biāo)記的克隆和測序克隆取3μl純化產(chǎn)物，于37℃過夜進(jìn)行克隆反應(yīng)。
3μl 純化產(chǎn)物1μl PGEMTeasy載體1μl 10x T4連接酶緩沖液1μl T4 DNA連接酶4μl H2O用大腸桿菌JM109菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，向100μl感受態(tài)大腸桿菌JM109細(xì)胞中加入5μl克隆產(chǎn)物。在LB培養(yǎng)基上于37℃保溫1小時進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。隨后將細(xì)菌涂布于裝有瓊脂(含1/1000氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿。緊臨涂布細(xì)菌前加入50μl IPTG-XGal，以選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌。選擇白色菌落(已轉(zhuǎn)化的)，并再次置于相同條件(瓊脂+氨芐青霉素)的培養(yǎng)中。
使用Wizard Plus試劑盒(Promega)由此培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒DNA的微量制備。用EcoRI消化含插入片段的質(zhì)粒DNA，以確認(rèn)M1標(biāo)記的存在。利用1.8％瓊脂糖凝膠確認(rèn)對應(yīng)于質(zhì)粒的3kb條帶和對應(yīng)于M1標(biāo)記的510bp條帶的存在(照片1)。測序插入片段的序列(SEQ ID NO.3)如下(5’-3’)SED ID N°3
發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于用于AFLP擴(kuò)增的引物的序列，并顯示條帶對應(yīng)于限制性片段EcoRI-MseI。
通過推導(dǎo)對應(yīng)于引物的序列，克隆水稻的DNA片段的實際大小為471bp。
首先使用引物對(1-3)、(1-4)、和(1-5)，然后使用引物對(2-3)、(2-4)、和(2-5)，不同引物對的使用使之有可能確認(rèn)AFLP M1條帶的克隆。用這些引物對雜交所用品種的DNA進(jìn)行的擴(kuò)增只顯示一條帶。對應(yīng)于Tog5681品種的片段略大于其它品種(圖2)。實施例7M1序列向多態(tài)性標(biāo)記的轉(zhuǎn)化在雙重單倍體群(IR64 x Azucena)的親本之間確定M1標(biāo)記的多態(tài)性。此群總計超過300個標(biāo)記，分布于超過12條水稻染色體。由于這個原因，我們依賴IR64親本上測定的M1標(biāo)記序列的限制性位點(圖3)。將引物對(1-3)、(1-4)、和(1-5)用于擴(kuò)增雜交植株的親本的DNA，然后用限制酶消化。當(dāng)使用引物1時，限制性位點HpaII/MspI釋放86bp片段。Gigante和Azucena品種中不存在此位點(圖4)。
在敏感群和抗性雜交群(IR64 x Gigante)的F2個體上檢測標(biāo)記。所有抗性個體都具有Gigante品種的圖譜(不存在M1 AFLP標(biāo)記，與此相關(guān)，也不存在限制性位點HpaII/MspI)，除了個體5.11例外。敏感個體在純合子狀態(tài)就像IR64品種顯示HpaII/MspI限制性位點，除了2個雜合子個體，它們是重組體(圖5)。
用特異引物對可擴(kuò)增的M1標(biāo)記的序列確實對應(yīng)于M1 AFLP標(biāo)記。HpaII/MspI消化能夠區(qū)分由敏感親本(IR64)與抗性親本(Gigante)衍生的等位基因。
有了這些新資料，有可能確定標(biāo)記M1與M2之間抗性基因座的定位，并估計M1與抗性基因座之間距離的重組率為0.065±0.045，標(biāo)記M1與M2之間距離為0.11±0.047。實施例8M1標(biāo)記的作圖審查來自(IR64 x Azucena)群的60個個體作為標(biāo)記M1用引物對(1-3)擴(kuò)增，用HpaII/MspI消化，隨后在2.5％瓊脂糖凝膠上分離片段。標(biāo)記M1的分離顯示沒有畸變(圖6)。使用作圖軟件(Mapmaker V3)將結(jié)果用于M1標(biāo)記作圖，從而將M1標(biāo)記定位于4號染色體上標(biāo)記RG163與RG214之間(圖7)。此距離代表RYMV抗性基因座所處區(qū)域。
RYMV抗性基因在水稻遺傳圖4號染色體上的作圖使之有可能鑒定距抗性基因座最近的標(biāo)記。具體的說，它們是微衛(wèi)星標(biāo)記RM252和RM273，或者由這些標(biāo)記確定距離4-5cM內(nèi)、可用于鑒定親本IR64與Gigante之間多態(tài)性的任何其它標(biāo)記，諸如由基因組或cDNA文庫衍生的RFLP標(biāo)記、微衛(wèi)星、AFLP標(biāo)記、或者由區(qū)域(諸如克隆BAC、YAC、或其粘粒)物理作圖衍生的標(biāo)記。
本發(fā)明鑒定的標(biāo)記或定位于此距離內(nèi)、有可能鑒定抗性品種(諸如Gigante或O.glaberrima)與RYMV敏感水稻品種之間多態(tài)性的任何其它標(biāo)記，可用于通過連續(xù)回交及隨后的標(biāo)記輔助選擇將RYMV抗性轉(zhuǎn)移至敏感品種。實施例9Tog5681品種抗性基因座的標(biāo)記限制性位點HpaII/MspI在Tog5681品種中的存在意謂著不可能將實施例8中的策略用于確認(rèn)M1標(biāo)記也是由Tog5681衍生的Tog5681抗性標(biāo)記。因此，用12種限制酶(BamHI、BglII、DraI、EcoRI、EcoRV、HindIII、ApaI、KpnI、PstI、ScaI、XbaI、HaeIII)消化4種品種(Azucena、Gigante、IR64、和Tog5681)，以使用M1標(biāo)記的DNA序列作為探針鑒定限制性多態(tài)性。ScaI可鑒定IR64與Tog5681之間的多態(tài)性(圖8)。將此多態(tài)性用于在回交(IR64 xTog5681)xIR64上經(jīng)抗性分離確認(rèn)M1標(biāo)記。測試此回交的5個敏感個體，它們都顯示IR64的特征性條帶。9個抗性個體只顯示Tog5681條帶，只有1個例外(其為重組體，圖9)。因此，以M1標(biāo)記作為探針由ScaI揭示的限制性多態(tài)性與Tog5681的抗性基因座相關(guān)。鑒于M1標(biāo)記事實上定位2種品種Gigante與Tog5681中相同的抗性基因座，因此在遺傳分析與抗性標(biāo)記的鑒定之間存在一致。實施例10M2標(biāo)記成為特異PCR標(biāo)記的克隆和測序使用與標(biāo)記M1相同的方案，克隆由引物對E-AAC/M-CAG獲得、對應(yīng)于敏感親本(IR64)中可見且存在于形成敏感群的所有個體中的M2條帶的AFLP條帶。測定對應(yīng)于此條帶的序列，并確定3種引物(1種正向，2種反向)得以將此標(biāo)記轉(zhuǎn)變成特異性PCR標(biāo)記。M2標(biāo)記的序列(120bp)(SEQ ID NO.9) 引物(SEQ ID N°10)AACCTAAGGCCACCTCCAAT(右)(SEQ ID N°11)GCAAACCTAAGGCCACCTC(右)(SEQ ID N°12)ATTCACCCCATGCCCTAAG(左)將下面的條件用于同時擴(kuò)增M1和M2標(biāo)記1.5μl 10x緩沖液，Promega1.5μl MgCl2，Promega0.6μl 5mM dNTP0.15μl 10mM M1-1引物0.15μl 10mM M1-4引物0.15μl 10mM M2-1引物0.15μl 10mM M2-2引物7.74μl H2O0.06μl Taq聚合酶3.00μl 5ng/μl DNAPCR程序94℃5min35個循環(huán)94℃1min
59℃30sec72℃1min72℃5min4℃10min于雜交溫度60.5℃、其它參數(shù)保持不變，可單獨(dú)擴(kuò)增M2標(biāo)記。在這些擴(kuò)增條件下，M2標(biāo)記似乎是顯性標(biāo)記，特征為條帶存在于敏感親本(IR64)中而不存在于Gigante親本中。實施例11在標(biāo)記M1與M2之間產(chǎn)生重組抗性植株群體從而在此距離內(nèi)排列候選AFLP標(biāo)記，以便進(jìn)行抗性標(biāo)記用RYMV病毒(BF1株)人工接種720個F2個體(IR64 x Gigante)。將無癥狀植株(即188個個體)移植到溫室中。隨后，基于ELISA和后代測試的其它分析使之有可能消除最后一部分50株敏感植株。如先前所述，對剩余138株植株(抗性純合子)系統(tǒng)分析標(biāo)記M1和M2二者的基因型。如此，選擇出45個個體(38個M1的重組體和7個M2的重組體)和2個雙重重組體。將這些重組個體用于在M1與M2之間間隔區(qū)排列AFLP標(biāo)記。下文表6概述了這些結(jié)果。
表6.M1-M2標(biāo)記間隔區(qū)中重組體F2亞群(IR64 x Gigante)的選擇
實施例12篩選AFLP標(biāo)記以選擇抗性的新候選標(biāo)記遵循先前所述方案，使用總計328對引物EcoRI/MseI，每種由3個核苷酸確定。下文表7給出了這些引物。
表7
表7(續(xù))
由此篩選，有可能根據(jù)敏感親本和/或抗性親本中它們的出現(xiàn)情況確定一條或多條多態(tài)性條帶。23對引物能夠鑒定通過F2 DNA群確認(rèn)的敏感或抗性親本之間的多態(tài)性。下文表8概述并給出了水稻黃色斑駁病毒雜交抗性基因座相結(jié)合的AFLP標(biāo)記在M1-M2間隔中的定位。
表8
在形成群的每個個體上分開確認(rèn)后，可在實施例11中鑒定的重組體上測試對應(yīng)于IR64親本中存在的條帶的候選標(biāo)記。如此，確認(rèn)了9種標(biāo)記屬于M1-M2間隔區(qū)。表9給出了通過比較來自抗性F2亞群(IR64 xGigante)的敏感與抗性DNA群鑒定的AFLP標(biāo)記在M1-M2間隔區(qū)中的順序。
表9 重組個體的發(fā)生率*
M1-R間隔 0.97 0.97 0.97 0.87 0.61 0.39 0.13R-M2間隔 0.67 0.78 0.89 0.89 0.89距離/抗性(cM) 11.4** 11.03 11.03 11.03 9.88 6.90 3.332.10 0.00 3.33 3.89 4.44 4.44 4.44 5.0**A敏感親本(IR64)等位基因的純合子基因型H雜合子基因型B抗性親本(Gigante)等位基因的純合子基因型D抗性親本(Gigante)等位基因的非純合子基因型* 假設(shè)在間隔M1-R和M2-R中不存在雙重組合** 使用183個F2(IR64 x Gigante)的抗性圖估計的距離(
圖10)還鑒定了來自抗性親本的14條帶，并在F2群(IR64 x Gigante)中產(chǎn)生的重組體上確認(rèn)或否。實施例13使用微衛(wèi)星標(biāo)記錨定RYMV抗性基因座將位于遺傳圖4號染色體(IR64 x Azucena；實施例9)的M1標(biāo)記和諸如[6]中定義且屬于此染色體的微衛(wèi)星標(biāo)記用于細(xì)調(diào)RYMV抗性基因座的圖。在[1]和[6]中所述實驗條件下測試了下列微衛(wèi)星標(biāo)記RM241、RM252[1]、RM273、和RM177[6]。除了IR64與Gigante親本之間的非多態(tài)性標(biāo)記RM177之外，在平行評價RYMV抗性的F2群(IR64 x Gigante)上將標(biāo)記RM241、RM252、RM273作圖。183個F2個體的結(jié)果使之有可能表征大約3.6cM、以兩個微衛(wèi)星基因座RM252與RM272為界、包圍RYMV抗性基因的一段(
圖10a)。實施例14攜帶抗性基因座的間隔區(qū)的精細(xì)作圖和抗性標(biāo)記在M1-M2間隔區(qū)中的順序?qū)剐郧覍τ贛1與M2標(biāo)記為重組體的45個F2個體(IR64 x Gigante)表征實施例13中鑒定的微衛(wèi)星標(biāo)記。在所有可獲得的F2個體(IR64 xGigante)上的分離中標(biāo)記的作圖確認(rèn)了M1-M2間隔區(qū)標(biāo)記之間的順序和距離，特別是估計為3.6cM的RM252-RM273間隔區(qū)(
圖10b)。由抗性且對于M1與M2標(biāo)記為重組體的45個F2個體(IR64 x Gigante)，有可能確認(rèn)實施例12中鑒定的AFLP標(biāo)記的順序。一種AFLP標(biāo)記EACG/MACA保持在RM252-RM273間隔區(qū)內(nèi)，代表距RYMV抗性基因座最近的標(biāo)記(表9)。總之，在321個測試的F2個體中，20個個體在RYMV抗性基因座的一側(cè)或另一側(cè)發(fā)生重組，可有利的用于鑒定較近的標(biāo)記和/或用于克隆抗性基因。實施例15標(biāo)記輔助的抗性轉(zhuǎn)移在對RYMV高度敏感的灌溉品種(var BG90-2，Bouak é189，Jaya)上測試接近抗性基因座的標(biāo)記。3種標(biāo)記(M1、RM241、RM252)顯示在這3種品種與Gigante品種之間存在多態(tài)性，使得能夠利用這些標(biāo)記將抗性轉(zhuǎn)移至敏感基因型。經(jīng)第2次回交將抗性實驗性轉(zhuǎn)移至這些品種。在每次雜交時，確認(rèn)植株存在由Gigante衍生的標(biāo)記，并通過F2的后代測試控制抗性分離。下文表10概述了結(jié)果。
表10
實施例16以RYMV病毒或病毒/核糖核蛋白復(fù)合物為誘餌用于捕獲RYMV感染周期所必需的靶蛋白I-3種不依賴鈣和pH的RYMV異構(gòu)體的體外和體內(nèi)表征使用離子交換層析描述3種異構(gòu)體，此分離的原理是基于顆粒的穩(wěn)定性。
致密型是最穩(wěn)定的，因為它們由二價鈣離子封閉，使顆粒對pH不敏感。此形式不附著于離子交換樹脂，流經(jīng)層析柱而不受損害。過渡型(中間型)是第一次描述，它們來自致密型顆粒或腫脹型顆粒。這些顆粒不含鈣，使之對pH敏感。因此，它們在酸性pH是致密的，而在堿性pH是腫脹的。這兩種異構(gòu)體(致密型和過渡型)可通過改變層析緩沖液的pH來區(qū)分。在堿性pH，過渡型顆粒瞬時腫脹，由于它們的穩(wěn)定性不足以耐受層析壓力(大約1000-1500psi)而在層析柱中爆炸；由此解離產(chǎn)生的衣殼蛋白附著于離子交換樹脂。由此可在堿性pH純化致密型?？紤]到腫脹型的不穩(wěn)定性，它們非常難以分離，但是可以在存在二價離子螯合劑(EDTA或EGTA)時在堿性pH由致密型顆粒生成腫脹型顆粒。在此處理后，所有顆粒變得不穩(wěn)定并在層析柱中爆炸。
根據(jù)本發(fā)明，如下捕獲靶蛋白i)在10mM乙酸鈉(pH5.0)和3mM CaCl2中透析大約6小時并通過層析(pH8.0)純化后獲得致密型顆粒。由受感染植株提取病毒或暴露致密型顆粒(由Biocad純化)與由病毒敏感型品種(IR64)的細(xì)胞懸浮液提取的蛋白質(zhì)后分離靶蛋白。
ii)在存在EDTA時在酸性pH由致密型顆粒獲得過渡型顆粒。
iii)在堿性pH由過渡型顆粒獲得腫脹型顆粒和核糖核蛋白復(fù)合物。在此pH，由腫脹型顆粒(高度不穩(wěn)定)自發(fā)獲得核糖核蛋白復(fù)合物。II-用于捕獲靶蛋白的方法-由受感染的敏感型植株(IR64)提取的病毒
圖12顯示了結(jié)果。
圖12A于pH8.5未注入病毒的對照層析圖；
圖12B于pH8.5注入100μl 1.7μg/μl病毒后的層析圖，方法1(NaCl梯度0-2550mM)；
圖12C注入100μl在10mM乙酸鈉(pH5)和3mM CaCl2中透析大約14小時的病毒后的層析圖；
圖12D于pH8.5注入100μl 1.7μg/μl(未透析)病毒后的層析圖，方法2(NaCl梯度0-1500mM和1500-2550mM，見實施例后的方法)。收集各級分(1ml)，加入800μl丙酮于4℃沉淀2小時，以13000rpm離心20分鐘，將沉淀真空離心干燥5分鐘，然后重懸于大約40μl 10mM Tris-堿緩沖液(pH7.4)。將樣品凍存于-20℃。
采用方法1，在Biocad中于pH8.0注入170μg病毒后(
圖13A)，收集洗脫液的不同部分，丙酮沉淀，重懸于10mM Tris-堿緩沖液(pH7.4)，進(jìn)行SDS-PAGE微凝膠電泳，隨后用硝酸銀(Biorad)顯影(
圖13B)，并使用衣殼抗蛋白質(zhì)MabE.5非區(qū)分性單克隆抗體(Denis fargette，IRD)進(jìn)行Western印跡(
圖13C)。
未免疫檢測到的條帶對應(yīng)于可能感興趣的植物蛋白質(zhì)。它們是5、24、42、49、59、66、70、77、和210kDa的蛋白質(zhì)。
-由提取并透析的病毒(在10mM乙酸鈉(pH5.0)和3mM CaCl2中透析大約14小時)隨后在Biocad上純化二級分2(A2)將病毒接觸水稻細(xì)胞懸浮液(IR64)的蛋白質(zhì)以捕獲靶蛋白。
純化級分2并進(jìn)行純度確認(rèn)(
圖14A)。在級分2中，病毒是純的，因為在SDS-PAGE和硝酸銀染色后不再存在任何其它條帶(
圖14B和14C，比較級分A2與
圖13B和13C中的B2)。將350μg病毒與860μg由細(xì)胞懸浮液(IR64)提取的蛋白質(zhì)在不同保溫溶液中于4℃保溫12小時后(
圖15)，在含或不含NaCl的情況下提取樣品。然后在Biocad上純化樣品，并通過大型SDS-PAGE及硝酸銀染色(
圖15A)和使用MabE.5的免疫檢測(
圖15B)來分析丙酮沉淀后的病毒級分(級分2和3)。
靶蛋白(MabE.5未免疫檢測到的)具有與由受感染葉片分離的蛋白質(zhì)相似的分子量；它們在D2條件(pH8.0，10mM DTT和0.3M NaCl)下特別可見；它們是24、45、51、57、63、85、和大于120kDa的蛋白質(zhì)。
III-靶蛋白的克隆和用于鑒定一類新的抗性基因的應(yīng)用對分離靶蛋白進(jìn)行N端測序(24、42-45、57、63、85、和大于120kDa的蛋白質(zhì))。鑒定5’簡并引物。在品種indica(IR64和Gigante)、temperatejaponica(02428)、tropical japonica(Azucena)、和glaberrima(Tog5681和Tog5673)的庫中進(jìn)行cDNA的克隆。然后使用傳統(tǒng)技術(shù)分析序列(同源性、推定的功能、和多態(tài)性)。
IV-材料和方法病毒的提取通過包括下列步驟的方法進(jìn)行提取-由感染病毒的植株(癥狀必須顯著)收獲新鮮葉片(或保存于-80℃)。感染期取決于所用水稻品種(耐受品種可用于獲得更大量的病毒)。
-在液氮中研磨葉片以獲得細(xì)粉并凍存。
-加入添加0.2％β-巰基乙醇的提取緩沖液(0.1M乙酸鈉*，pH5.0)(100g磨碎的葉片中加入大約1升緩沖液)并搖動2分鐘。
-用“粗棉布(cheese cloth)”型織物過濾獲得的懸浮液并用手?jǐn)D壓布中剩余濾渣。
-加入1倍體積的氯仿并搖動2分鐘。
-于4℃以10000g離心10分鐘并收集上層水相。
-估計水相的體積并加入NaCl至終濃度0.3M。靜置溶解(在冷室中)并加入PEG8000至終濃度6％。
-搖動過夜(沉淀病毒)。
-在250ml離心杯中于4℃以22000g離心懸浮液30分鐘。
-棄去上清液并空氣干燥病毒沉淀幾分鐘。以1ml提取緩沖液[1]收集每個離心杯中的沉淀并制成冷的懸浮液。
-合并獲得的級分并用0.5ml緩沖液漂洗離心杯，也加到先前的級分中。
-以12000g離心10分鐘以除去固相雜質(zhì)并收集上清液。
-稀釋后，于259nm進(jìn)行分光光度計測定并計算病毒濃度其中OD259＝6.5對應(yīng)于1μg/μl病毒懸浮液。比率OD259/OD280大于等于1.5，證明病毒純化得好，否則在蔗糖梯度上進(jìn)行純化。
*溶液A2M乙酸(115.5ml溶于1000ml)；溶液B2M乙酸鈉(164gC2H3O2或272g C2H3O2Na·3H2O溶于1000ml)。14.8ml溶液A+35.2ml溶液B定容至1000ml，首先加入溶液B，然后逐漸加入溶液A直至達(dá)到pH5；如果需要，用溶液A調(diào)pH。離子交換層析Biosystems PerSeptive Chromatograph BIOCAD 700E(Framingham，MA，USA)配備Gilson F-250收集器。注入100μl病毒樣品，并在預(yù)裝的POROS陰離子交換柱(HQ//H，4.6mm D/100mm L，CV＝1.7ml)上純化，該柱裝有10μm POROS顆粒。所用洗脫緩沖液由15mM Bis-Tris丙烷Tris堿(50/50，Sigma)(pH6或pH8.5)組成，流速6ml/min，內(nèi)壓大約1500psi。上樣前，用洗脫緩沖液平衡層析柱。注入病毒后，用洗脫緩沖液清洗層析柱，然后用3分鐘的NaCl梯度0-2.55M(方法1)或4分鐘的NaCl梯度0-1550mM隨后30秒鐘的NaCl梯度1500-2550mM(方法2)。最后，進(jìn)行洗脫緩沖液的最后一步(大約1分鐘)，NaCl濃度2550mM。記錄260nm和280nm的吸光率。3次注入相同樣品后，觀察到的最大變化是大約3％。病毒的最小檢測水平是大約7ng/μl。收集1ml級分并在注射前在20mM磷酸鹽緩沖液中于4℃透析大約14小時。在電子顯微鏡下檢查樣品。細(xì)胞懸浮液將谷粒去殼，置于70％(v/v)乙醇中消毒1分鐘，然后置于2.6％次氯酸鈉溶液中45分鐘，其中建立部分真空以改進(jìn)接觸。
在無菌水中清洗4次后，將谷粒置于培養(yǎng)皿(用石蠟?zāi)し饪?中的凝膠培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基)中，并置于25℃黑暗中。
6周后，將由胚芽形成的愈傷組織置于用于細(xì)胞增殖的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)(來自幾個愈傷組織的幾個球狀結(jié)構(gòu)，使用Erlen)。
3周后，置于液體培養(yǎng)基中的愈傷組織已經(jīng)增殖，并移植懸浮液。隨后每10-15天移植懸浮液并提取蛋白質(zhì)。用于水稻細(xì)胞懸浮液的培養(yǎng)基SZ培養(yǎng)基[Zhang等人，1998]大量元素x10(每升)每升終溶液中加入100ml母液KNO340.00g(NH4)2SO43.30gMgSO4·7H2O 2.46gNaH2PO42.76g(2H2O3.12g-無水的2.40g)CaCl2·2H2O 1.47gB5微量元素x100(每升)每升終溶液中加入10ml母液MnSO4·7H2O 1349mgZnSO4112mg(7H2O200mg)KI 75mgNa2MoO4·2H2O 25mgH3BO3300mgCuSO45H2O 2.5mgCoCl26H2O 2.5mgB5維生素x100(每100ml)每升終溶液中加入1ml母液尼克酸100mg鹽酸硫胺素1000mg鹽酸吡哆素100mg肌醇 10g脯氨酸500mg/升終溶液谷氨酰胺 500mg/升終溶液酪蛋白酶促水解物300mg/升終溶液鐵EDTA x1000(每升)每升終溶液中加入1ml母液否則FeSO4·7H2O 2.8gNa2EDTA 3.7g激素2，4-D x1000每升終溶液中加入1ml母液原液2mg/ml麥芽糖和蔗糖(用于2428)30g/LpH5.8用于水稻愈傷組織發(fā)生的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS[Murashige T.&Skoog F.1962]大量元素x10(每升)每升終溶液中加入100ml母液KNO319.00gNH4NO316.50gMgSO4·7H2O 3.70gKH2PO41.70gCaCl2·2H2O 4.40g微量元素x100(每升)每升終溶液中加入10ml母液MnSO4H2O 1690mgZnSO4·7H2O 860mgKI 83mgNa2MoO4·2H2O 25mgH3BO3620mgCuSO45H2O2.5mgCoCl26H2O2.5mg維生素x1000(每100ml)每升終溶液中加入1ml母液尼克酸 50mg鹽酸硫胺素 10mg鹽酸吡哆素 50mg肌醇10g甘氨酸 200mg鐵EDTA x1000(每升)每升終溶液中加入1ml母液否則FeSO4·7H2O 2.8gNa2EDTA3.7g激素2，4-D x1000每升終溶液中加入1ml母液原液2mg/ml麥芽糖或蔗糖30g/LpH5.8PHYTAGEL 2.5g/L用于愈傷組織誘導(dǎo)和傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基NBN6大量元素x10(每升)每升終溶液中加入100ml母液KNO328.30g(NH4)2SO44.64gMgSO4·7H2O 1.40gKH2PO44.00gCaCl2H2O1.65gB5微量元素x100(每升)每升終溶液中加入10ml母液MnSO4·7H2O1349mgZnSO4112mg(7H2O200mg)KI 75mgNa2MoO4·2H2O25mgH3BO3300mgCuSO45H2O 2.5mgCoCl26H2O 2.5mgB5維生素x1000(每100ml)每升終溶液中加入1ml母液尼克酸100mg鹽酸硫胺素1000mg鹽酸吡哆素100mg肌醇 10g或Gamborg維生素 11.2加入終濃度脯氨酸500mg/升終溶液谷氨酰胺 500mg/升終溶液酪蛋白酶促水解物300mg/升終溶液鐵EDTA x1000(每升)每升終溶液中加入1ml母液否則FeSO4·7H2O2.8gNa2EDTA 3.7g或EDTA鐵鈉鹽(Sigma E-6760)4.15g/L激素2，4-D x1000每升終溶液中加入1ml母液原液2mg/ml麥芽糖和蔗糖30g/LPHYTAGEL 2.6g/LpH5.8蛋白質(zhì)提取由細(xì)胞懸浮液提取蛋白質(zhì)-用于細(xì)胞懸浮液的提取緩沖液終濃度每100mlTris20mM，pH7.4 50ml 40mM Tris pH7.4NaCl100mM 584mgNa2EDTA·2H2O10mM 372mg葡萄糖 25mM 856mgSDS 0.1％ 0.5ml 20％SDS(變性)屈立通-x-1000.1％ 100μl(非變性)DNA和RNA1μg/ml蛋白質(zhì)抑制劑 2片或4ml濃縮液EGTA5mM 190mg甘油5％ 5mlDTT 5mM 77mg用HCl調(diào)pH至7.4-將5g細(xì)胞懸浮液與無菌Fontainebleau沙一起置于研缽中-加入1ml緩沖液并研磨，然后加入4ml緩沖液-由此在變性條件(含SDS的緩沖液)和非變性條件(含屈立通的緩沖液)下提取水稻品種。于3℃以15000g離心15分鐘。
-收集并分裝上清液，每個1.5ml管中裝1ml，立即凍存于-80℃。
所有步驟盡可能在冰上進(jìn)行，且盡可能快的進(jìn)行。蛋白質(zhì)測定法-用BSA(2mg/ml)為每種變性和非變性緩沖液確定參考范圍1000μg/ml，100μg/ml。
-將4份樣品在相應(yīng)緩沖液中稀釋5倍。
-向50μl每份樣品和范圍點中，加入2.5ml考馬斯蛋白質(zhì)測定試劑并混合。
-在一次性比色杯中讀取595nm吸光率。膜制備的操作模式如下制備聚丙烯酰胺凝膠(19∶1或29∶1)12％電泳膠 每1mm凝膠40％丙烯酰胺雙-丙烯酰胺 1.5ml1.5M Tris-HCl pH8.8 1.3ml20％SDS 25μl10％過硫酸銨50μlTEMED 5μlH2O2.2ml5％濃縮膠 每1mm凝膠40％丙烯酰胺雙-丙烯酰胺 250μl1M Tris-HCl pH6.8 250μl20％SDS 10μl10％過硫酸銨 20μlTEMED 2μlH2O 1.5ml-由板的頂部倒入電泳膠至2cm，然后用1-丁醇覆蓋(促進(jìn)聚合，避免接觸空氣)。
-聚合(15-30分鐘)后，用Whatmann濾紙吸去丁醇，然后倒入濃縮膠，并安置梳子到位。
-聚合后，用電泳緩沖液清洗加樣孔，然后用1倍體積的加樣緩沖液加入先前于98℃變性5分鐘的樣品。
-于80V電泳直至藍(lán)色進(jìn)入電泳膠，然后升壓至100V；當(dāng)藍(lán)色離開凝膠時(大約5kDa)停止電泳。
-在轉(zhuǎn)移緩沖液中于100V1小時將凝膠轉(zhuǎn)移至0.45μm硝酸纖維素膜(Bio-Rad，產(chǎn)品編號1620115)。
-將潮濕的膜保存于冰箱中直至使用。使用MALI多克隆抗體(Pab Mali)的操作模式-所有保溫/清洗步驟都是在搖床(SRP6型搖床，Stuart Sciences)上進(jìn)行的，速度20/25rpm，室溫≌23℃。
-用于保溫/清洗步驟的溶液體積是20ml，并在112mm×77mm塑料盒中進(jìn)行。
-將膜在封閉液中保溫1小時。
-與1/1000稀釋的第一種多克隆Mali抗體(抗RYMV)一起在相同封閉液中保溫1小時(收集溶液，加入抗體，搖動，并放回膜上)。
-用TBS(pH7.5)漂洗5分鐘6次。
-與1/40000稀釋的第二種綴合HRP的抗兔抗體一起在新的封閉液中保溫1小時。
-用TBS(pH7.5)漂洗5分鐘6次。
-將膜置于Saran包裝膜上，并以統(tǒng)一方式(必須適當(dāng)覆蓋膜)倒入通過混合等體積的2種溶液而制備的West Pico液(每張小型膜總計3ml)。
-等待5分鐘(光照)，除去過量底物，用Saran包裝膜包裹，其上放置一張膠片(黑暗)，曝光1分鐘至1小時。
-對于pH6.5和pH8.0的雜交，使用MES緩沖液(pH6.5)和TAPS緩沖液(pH8.0)以相同方式操作所有雜交和清洗步驟。使用E單克隆抗體(Mab E)的操作模式-所有保溫/清洗步驟都是在搖床(SRP6型搖床，Stuart Sciences)上進(jìn)行的，速度20/25rpm，室溫≌23℃。
-用于保溫/清洗步驟的溶液體積是20ml，并在112mm×77mm塑料盒中進(jìn)行。
-將膜在封閉液中保溫1小時。
-與1/100或1/1000稀釋的第一種單克隆E抗體(抗RYMV表位)一起在相同封閉液中保溫1小時(回收溶液，加入抗體，搖動，并放回膜上)。
-用TBS(pH7.5)漂洗5分鐘6次。
-與1/40000稀釋的第二種綴合HRP的抗小鼠抗體一起在新的封閉液中保溫1小時。
-用TBS(pH7.5)漂洗5分鐘6次。
-將膜置于Saran包裝膜上，并以統(tǒng)一方式(必須適當(dāng)覆蓋膜)倒入通過混合等體積的2種溶液而制備的West Pico液(每張小型膜總計3ml)。
-等待5分鐘(光照)，除去過量底物，用Saran包裝膜包裹，其上放置一張膠片(黑暗)，曝光1分鐘至1小時。
-對于pH6.5和pH8.0的雜交，使用MES緩沖液(pH6.5)和TAPS緩沖液(pH8.0)以相同方式操作所有雜交和清洗步驟。溶液-2x加樣緩沖液2x加樣緩沖液的濃度 每10ml 2x溶液中的產(chǎn)品含量100mM Tris-HCl pH6.81ml 1M Tris-HCl pH6.8200mM DTT 0.308g4％SDS 2ml 20％SDS0.2％溴酚藍(lán) 20mg20％甘油2ml加水至10ml終體積-10x電泳緩沖液2x溶液的濃度每10ml 2x溶液中的產(chǎn)品含量250mM Tris堿30.285g Tris堿2.5M甘氨酸 187.67g甘氨酸-轉(zhuǎn)移緩沖液Tris堿 2.42g甘氨酸 11.26g甲醇100mlH2O至1升終體積-多克隆封閉液溶于適當(dāng)緩沖液的3％脫脂奶粉(Bio-Rad，產(chǎn)品編號170-6404)-單克隆封閉液溶于適當(dāng)緩沖液的0.5％BSA-TBS(pH7.5)2.423g Tris堿(20mM)+3.146g NaCl(75mM)+0.508g MgCl2·6H2O(2.5mM)+0.5ml NP-40(0.05％Tergitol，作為非液相于室溫使用前加熱)+H2O至1000ml終體積。用HCl調(diào)pH至5.5。
-MES(pH6.5)3.904g MES(20mM)+4.937g KCl(75mM)+0.508gMgCl2·6H2O(2.5mM)+0.5ml NP-40(0.05％Tergitol，作為非液相于室溫使用前加熱)+H2O至1000ml終體積。用NaOH或HCl調(diào)pH至6.5。
-TAPS(pH8.0)4.866g TAPS(20mM)+4.937g KCl(75mM)+0.508g MgCl2·6H2O(2.5mM)+0.5ml NP-40(0.05％Tergitol，作為非液相于室溫使用前加熱)+H2O至1000ml終體積。用NaOH或HCl調(diào)pH至8.0。
-多克隆Mali(Pab Mali)由完整病毒顆粒獲得的多克隆抗體溶液。需1/1000稀釋。
-單克隆E(Mab E)由RYMV表位獲得的單克隆抗體溶液。需1/50或1/1000稀釋。
-HRP-抗兔綴合物“免疫純山羊抗兔IgG，(H+L)，綴合過氧化物酶”(參考PIERCE31460)在H2O中恢復(fù)至0.8mg/ml。需1/40000稀釋。
-HRP-抗小鼠綴合物“免疫純山羊抗小鼠IgG，(H+L)，綴合過氧化物酶”(參考PIERCE31430)在H2O中恢復(fù)至0.8mg/ml。需1/40000稀釋。
-West Pico“超強(qiáng)信號West Pico化學(xué)發(fā)光底物”(參考PIERCE34080)。等體積混合Lumino/Enhancer溶液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液(每張小型8cm×5cm膜總計3ml)。將如此制備的溶液靜置24小時，并在亮處使用。
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權(quán)利要求
1.用于分離識別并靶向轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)胞間連絲在植物中循環(huán)的致病病毒所涉及的蛋白質(zhì)的方法，其特征為將含所述蛋白質(zhì)與病毒顆粒的復(fù)合物的樣品進(jìn)行電泳，使用衣殼抗蛋白質(zhì)單克隆抗體進(jìn)行Western印跡，并收集未免疫檢測到的條帶。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征為復(fù)合物得自由受感染的敏感植株提取的病毒。
3.權(quán)利要求2的方法，其特征為病毒是RYMV病毒，且收集5、24、42、49、59、66、70、77、和210kDa的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的方法，其特征為復(fù)合物得自純化病毒，并接觸敏感植株細(xì)胞懸浮液的蛋白質(zhì)。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征為病毒是RYMV病毒，且收集24、45、51、57、63、85、和大于120kDa的蛋白質(zhì)。
6.諸如使用權(quán)利要求1-5任一項的方法獲得的蛋白質(zhì)。
7.權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)用于克隆抗致病病毒抗性基因的應(yīng)用，所述致病病毒經(jīng)胞間連絲在植物中循環(huán)。
8.對應(yīng)于權(quán)利要求6的蛋白質(zhì)、能夠與由含水稻品種諸如IR64的100-150kb DNA片段的庫例如BAC庫(細(xì)菌人工染色體)篩選得到的BAC克隆雜交的cDNA，此BAC克隆屬于含標(biāo)記的DNA序列的BAC克隆的毗連群，或者與位于微衛(wèi)星標(biāo)記RM252-RM272之間的區(qū)域重疊的BAC克隆組，所述標(biāo)記是由包括下列步驟的方法由水稻鑒定的—由親本品種的抗性后代個體和敏感后代個體先后選擇性擴(kuò)增水稻DNA片段，這些片段事先已被消化，并通過連接而固定末端具有一個或多個特定核苷酸的互補(bǔ)引物銜接頭，其中引物對中的一種引物被標(biāo)記以便顯影，—通過變性條件下的凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，并—將衍生自抗性后代的片段混合物和衍生自敏感后代的片段混合物與衍生自親本品種的片段混合物的電泳圖譜進(jìn)行比較，以鑒定其多態(tài)性與抗性基因座遺傳連鎖的條帶，在此鑒定后任選地在每一種個體上進(jìn)行證實，并計算標(biāo)記與抗性基因座之間的遺傳重組率，從而確認(rèn)。
9.權(quán)利要求8的cDNA，其特征為在RYMV敏感品種中和在衍生自此品種與Gigante抗性品種雜交的敏感植物部分中具體證實了所述多態(tài)性AFLP條帶。
10.權(quán)利要求8或9的cDNA，其特征為對應(yīng)于所述多態(tài)性條帶的所述DNA序列攜帶RYMV抗性基因座，且確定一個小于10cM的區(qū)段。
11.權(quán)利要求10的cDNA，其特征為所述DNA序列是EcoRI-MseI片段。
12.權(quán)利要求11的cDNA，其特征為所述片段的大小在變性條件下的凝膠電泳上分別是510bp和140bp。
13.權(quán)利要求8-12任一項的cDNA，其特征為所述DNA片段對應(yīng)于抗性基因座側(cè)翼，且位于后者任一側(cè)的5-10cM的DNA序列。
14.權(quán)利要求13的cDNA，其特征為使用的DNA序列符合SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.9。
全文摘要
本發(fā)明涉及捕獲致病性病毒、尤其是水稻黃色斑駁病毒(RYMV)感染周期不可缺少的靶蛋白的方法,以及克隆所述過程中涉及的基因的方法。因此,本發(fā)明涉及鑒定RYMV抗性的分子標(biāo)記的方法。本發(fā)明涉及分離與病毒顆粒的所述蛋白質(zhì)復(fù)合物。該方法包括對含所述復(fù)合物的樣品進(jìn)行電泳,使用衣殼抗蛋白質(zhì)單克隆抗體進(jìn)行Western印跡,并回收未免疫檢測到的條帶。本發(fā)明還涉及能與由含有水稻品種諸如IR64的DNA片段的庫中篩選得到的BAC(細(xì)菌人工染色體)雜交的cDNA。所述BAC克隆包含由通過將抗性和敏感性植株的AFLP(擴(kuò)增長度多態(tài)性)進(jìn)行比較的方法而由水稻鑒定的標(biāo)記的DNA序列。
文檔編號A01H1/04GK1364198SQ0081074
公開日2002年8月14日 申請日期2000年6月21日 優(yōu)先權(quán)日1999年6月21日
發(fā)明者C·布拉吉多, J－P·布里扎德, A·格斯奎爾 申請人:發(fā)育研究院